处理甲壳动物以制备其低氟化物/低三甲胺产品的方法.pdf

本发明考虑从磷脂-蛋白质复合物(PPC)处理的低氟化物甲壳动物油的生产，该复合物在甲壳动物(即，例如，磷虾)捕获后立即形成。进一步，甲壳动物油还可具有减少的三甲胺和/或三甲胺氧化物含量。处理包括将甲壳动物粉碎成较小的颗粒，加水，加热所得物，加酶(一种或多种)以水解粉碎的材料，使酶(一种或多种)失活，从酶催化处理的材料除去固体以减少材料的氟化物含量，分离并干燥PPC材料。接着，使用利用超临界CO2或超临界二甲醚和/或乙醇作为溶剂的提取，从PPC分离磷虾油以及其他物质。提取中，磷虾油可从进料物几乎完全分离。

1.  一种甲壳动物油组合物，其包含磷脂和少于约0.5ppm的氟化物。

2.  根据权利要求1所述的甲壳动物油组合物，其进一步包含少于约0.001％(w/w)的三甲胺。

3.  根据权利要求1所述的甲壳动物油组合物，其进一步包含少于约0.02％(w/w)的三甲胺氧化物。

4.  根据权利要求1所述的甲壳动物油组合物，其中所述磷脂在约39-52wt％之间，其中所述磷脂包含至少约65％的卵磷脂和至少约2.4wt％的溶血卵磷脂。

5.  根据权利要求1所述的甲壳动物油组合物，其进一步包含甘油三酯、中性脂质、约20-26wt％的Omega-3脂肪酸、和至少约0.8wt％的游离脂肪酸。

6.  根据权利要求1所述的甲壳动物油组合物，其中所述油是磷虾油。

7.  一种甲壳动物磷脂-肽复合物(PPC)组合物，其包含水解蛋白、磷脂和约300-500ppm之间氟化物的基质。

8.  根据权利要求7所述的甲壳动物PPC组合物，其中所述磷脂为至少40wt％。

9.  根据权利要求7所述的甲壳动物PPC组合物，其进一步包含约0.044％(w/w)的三甲胺和约0.354％(w/w)的三甲胺氧化物。

10.  根据权利要求7所述的甲壳动物PPC组合物，其进一步包含至少40％(w/w)的甘油三酯。

11.  一种甲壳动物脱油磷脂-肽复合物(PPC)组合物，其包含水解蛋白、约200-500ppm之间的氟化物、约35％的总脂肪、约16.6％十二碳五烯酸、约10.0％二十二碳六烯酸和至少0.1wt％的游离脂肪酸的基质。

12.  根据权利要求11所述的甲壳动物脱油PPC组合物，其中所述总脂肪包含少于20％的甘油三酯和约69％的其他脂质组分。

13.  根据权利要求12所述的甲壳动物脱油PPC组合物，其中所述总脂肪包含约35.2％的脂肪酸，其中约30wt％的所述脂肪酸为n-3脂肪酸。

14.  根据权利要求12所述的甲壳动物脱油PPC组合物，其中所述总脂质进一步包含至少68％的磷脂。

15.  根据权利要求12所述的甲壳动物脱油PPC组合物，其进一步包含约2.2％的溶血卵磷脂。

16.  根据权利要求12所述的甲壳动物脱油PPC组合物，其进一步包含约115mg/kg的虾青素。

17.  一种干燥蛋白水解物组合物，其包含约70-80％的蛋白质、约1.5-3.0％脂质和约5-7％灰分。

18.  一种生产低氟化物甲壳动物组合物的方法，其包括：
a)将甲壳动物捕获物粉碎成具有范围在约1-25毫米之间粒径的材料；和
b)将所述甲壳动物材料分离成磷脂-肽复合物(PPC)组合物亚组分，其中所述亚组分包含少于500ppm的氟化物含量。

19.  根据权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包括用包含溶剂的流体提取所述PPC组合物亚组分，其中产生低氟化物油，所述油具 有少于0.5ppm的氟化物含量。

20.  根据权利要求19所述的方法，其中所述提取进一步产生低三甲胺/三甲胺氧化物油，其中所述三甲胺少于约0.001％(w/w)且所述三甲胺氧化物少于约0.02％(w/w)。

21.  根据权利要求18所述的方法，其中进行所述分离而无乳化。

22.  根据权利要求18所述的方法，其中所述溶剂包含非极性溶剂。

23.  根据权利要求18所述的方法，其中所述溶剂包含至少一种极性溶剂。

24.  根据权利要求18所述的方法，其中所述溶剂包含所述非极性溶剂和所述至少一种极性溶剂。

25.  根据权利要求22所述的方法，其中所述非极性溶剂选自超临界二氧化碳和超临界二甲醚的至少一种。

26.  根据权利要求23所述的方法，其中所述极性溶剂选自乙醇和丙酮的至少一种。

27.  根据权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述分离前水解所述甲壳动物材料。

28.  根据权利要求22所述的方法，其中所述提取进一步产生脱油PPC组合物。

29.  根据权利要求23所述的方法，其中所述极性溶剂从所述脱油PPC组合物分离磷脂组合物和蛋白水解物组合物。

30.  根据权利要求19所述的方法，其中所述提取包括少于10小时。

31.  根据权利要求19所述的方法，其中所述提取包括少于5小时。

32.  根据权利要求19所述的方法，其中所述提取包括少于2小时。

33.  根据权利要求18所述的方法，其中所述甲壳动物材料是磷虾材料。

34.  根据权利要求18所述的方法，其中所述分离包括约1,000-1,800g之间的离心力。

35.  根据权利要求18所述的方法，其中所述分离包括约5,000-10,000g之间的离心力。

36.  一种组合物，其包含低氟化物甲壳动物PPC和低氟化物脱油PPC的混合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。

37.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述甲壳动物PPC是磷虾PPC。

38.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述甲壳动物脱油PPC是磷虾脱油PPC。

39.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述甲壳动物PPC和甲壳动物脱油PPC为1:1的比率。

40.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述混合物包含研磨的精细粉末。

41.  根据权利要求40所述的组合物，其中所述粉末包含约250μm的粒径。

42.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物包含少于0.1％(mEq/kg)的过氧化物水平。

43.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物包含少于0.1％(w/w)的酰茴香醛水平。

44.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物进一步包含微胶囊化的多不饱和的Omega-3脂肪酸。

45.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物进一步包含氧化锌。

46.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物进一步包含海洋肽。

47.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种补充氨基酸。

48.  一种方法，其包括配制包含低氟化物甲壳动物PPC和低氟化物甲壳动物脱油PPC的组合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。

49.  根据权利要求48所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述组合物研磨成粉末。

50.  根据权利要求48所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述组合物压成片。

51.  根据权利要求48所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述组合物封装入胶囊。

52.  根据权利要求48所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述粉末与食品混合。

53.  根据权利要求48所述的方法，其中所述配制进一步包含微胶囊化多不饱和Omega-3脂肪酸。

54.  根据权利要求48所述的方法，其中所述配制进一步包含氧化锌。

55.  根据权利要求48所述的方法，其中所述配制进一步包含海洋肽。

56.  根据权利要求48所述的方法，其中所述配制进一步包含至少一种补充氨基酸。

57.  一种组合物，其包含低氟化物甲壳动物PPC和甲壳动物蛋白水解物的混合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。

58.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述甲壳动物PPC是磷虾PPC。

59.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述甲壳动物蛋白水解物是磷虾蛋白水解物。

60.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述甲壳动物PPC和所述甲壳动物蛋白水解物为1:1的比率。

61.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述混合物包含研磨的精细粉末。

62.  根据权利要求61所述的组合物，其中所述粉末包含约250μm的粒径。

63.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述组合物包含少于0.1％(mEq/kg)的过氧化物水平。

64.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述组合物包含少于0.1wt％的酰茴香醛水平。

65.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述组合物进一步包含微胶囊化的多不饱和的Omega-3脂肪酸。

66.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述组合物进一步包含氧化锌。

67.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述组合物进一步包含海洋肽。

68.  根据权利要求57所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种补充氨基酸。

69.  一种方法，其包括配制包含低氟化物甲壳动物PPC和甲壳动物蛋白水解物的组合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。

70.  根据权利要求69所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述组合物研磨成粉末。

71.  根据权利要求69所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述组合物压成片。

72.  根据权利要求69所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述组合物封装入胶囊。

73.  根据权利要求69所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述粉末 与食品混合。

74.  根据权利要求69所述的方法，其中所述配制进一步包含微胶囊化的多不饱和Omega-3脂肪酸。

75.  根据权利要求69所述的方法，其中所述配制进一步包含氧化锌。

76.  根据权利要求69所述的方法，其中所述配制进一步包含海洋肽。

77.  根据权利要求69所述的方法，其中所述配制进一步包含至少一种补充氨基酸。

处理甲壳动物以制备其低氟化物/低三甲胺产品的方法
技术领域
本发明涉及处理富含脂质的甲壳动物(即，例如，磷虾)以制备包含磷脂、蛋白质养分和油(即，例如，中性的脂质和/或甘油三酯)的低氟化物、三甲胺和三甲胺氧化物的组合物的方法。
背景技术
甲壳动物，特别是磷虾，代表着作为生物材料的巨大来源。取决于计算方法和调查，南极磷虾(大磷虾(Euphausia superba))的量大致为1至2×10⁹吨且每年捕获的可能重量估计为5至7×10⁶吨。这些生活在南极附近冷水中的小甲壳动物作为蛋白质、脂质如磷脂、多不饱和脂肪酸等、壳多糖/壳聚糖、虾青素和其他类胡萝卜素、酶和其他材料的来源受到关注。
已经研发出多个分离上述材料的方法。一个问题是产物可包含不需要的在甲壳动物的外骨骼(也称为外壳或外皮)中包含的痕量材料。例如，磷虾在它们的外骨骼中积累氟化物，从而通过包含外骨骼的部分或通过不考虑氟化物转移到最终材料的提取过程增加任何制备的材料的氟化物的量。在这种情况中，游离的氟化物或松散地结合的氟化物可从外骨骼材料分散并进入进一步处理的材料，使终端产物的氟化物离子和/或氟化的化合物高。
氟化物是高浓度时对陆生生物以及所有种类的鱼和甲壳动物且特别是淡水鱼类的健康有害的化合物，这是由于氟化物原子具有进入此类有机体的骨结构并引起氟中毒、或削弱骨结构的倾向，其影响类似于骨质疏松，但又有所不同，因为其自身就是骨结构，且不是被影响的骨多孔。氟骨症是以骨骼畸形和关节痛为特征的病症。其由病理性的骨形成——由于氟化物对成骨细胞的促有丝分裂作用——引起。在 其更严重的形式中，氟骨症引起脊柱后凸、跛足和伤残。有或没有神经根病，也都可发生脊髓病形式的继发性神经系统并发症。高氟化物摄入还已在大鼠实验中显示出对雄性生殖系统有毒，并且在人体中高氟化物摄入和氟骨症症状已与降低的血清睾酮水平相关联。所以，如果磷虾材料被用作食物或饲料产品的起始材料，就不得不做通过处理步骤除去氟化物的预防。然而，氟化物的分散和外骨骼的细微颗粒的存在代表了工业规模中处理磷虾材料时难以克服的问题。
极性脂质如磷脂对细胞膜是必须的并还称为膜脂质。对于大多数已知的动物种类，极性脂质的含量几乎是恒定的。然而，这对南极磷虾不适用。根据季节磷脂含量从2％高至10％变化。高含量，例如大于5％的磷脂原则上是好的，但也意味着是个问题，因为其可在工业处理中产生强乳液。乳液使处理如水解过程中脂质和蛋白质部分的分离变得复杂。
磷虾油是从磷虾制备的一种有价值的产品。其含有磷脂、甘油三酯和类胡萝卜素、虾青素以及其他事物而基本上不含蛋白质、碳水化合物和矿物质。磷虾材料的不同部分通过以下方式及其他方式彼此分离：i)机械粉碎磷虾；ii)挤压磷虾，iii)加热并用酶水解；iv)旋转装置中的离心力；和v)溶剂提取。
本领域需要的是对这些比较常规的方法显著的提高，并在本发明的许多实施方式(下文)中描述。例如，粉碎的甲壳动物原料可被分离和/或提取成各种富含低氟化物、低三甲胺和/或低三甲胺氧化物的甲壳动物粉和/或油的组合物。
发明内容
本发明涉及处理富含脂质的甲壳动物(即，例如，磷虾)以制备包含磷脂、蛋白质养分和油(即，例如，中性的脂质和/或甘油三酯)的低氟化物、三甲胺和三甲胺氧化物的组合物的方法。
在一个实施方式中，本发明考虑一种甲壳动物油组合物，其包含磷脂和少于约0.5ppm的氟化物。在一个实施方式中，甲壳动物油组合物进一步包含少于约0.001％(w/w)的三甲胺。在一个实施方式中，甲壳动物油组合物进一步包含少于约0.02％(w/w)的三甲胺氧化物。 在一个实施方式中，磷脂在约39-52wt％之间，其中所述磷脂包含至少约65％的卵磷脂和至少约2.4wt％的溶血卵磷脂。在一个实施方式中，甲壳动物油进一步包含甘油三酯、中性脂质、约20-26wt％Omega-3(例如，n-3)脂肪酸、和至少约0.8wt％的游离脂肪酸。在一个实施方式中，甲壳动物油组合物是磷虾油。
在一个实施方式中，本发明考虑甲壳动物磷脂-肽复合物(PPC)组合物，其包含水解蛋白、磷脂和约200-500ppm之间的氟化物的基质。在一个实施方式中，磷脂为至少40wt％。在一个实施方式中，甲壳动物PPC组合物进一步包含约0.044％(w/w)的三甲胺和约0.354％(w/w)的三甲胺氧化物。在一个实施方式中，甲壳动物PPC组合物进一步包含至少40％(w/w)的甘油三酯。
在一个实施方式中，本发明考虑甲壳动物脱油磷脂-肽复合物(PPC)组合物，其包含水解蛋白、约200-500ppm之间氟化物、约35％总脂肪、约16.6％十二碳五烯酸、约10.0％二十二碳六烯酸和至少0.1wt％的游离脂肪酸的基质。在一个实施方式中，其中总脂肪包含少于20％的甘油三酯、和约69％的其他脂质组分。在一个实施方式中，总脂肪包含约35.2％的脂肪酸，其中约30wt％的所述脂肪酸为n-3脂肪酸。在一个实施方式中，总脂质进一步包含至少68％的磷脂。在一个实施方式中，脱油PPC进一步包含约2.2％的溶血卵磷脂。在一个实施方式中，脱油PPC进一步包含约115mg/kg的虾青素。
在一个实施方式中，本发明考虑制备低氟化物甲壳动物组合物的方法，其包括：a)将甲壳动物捕获物粉碎成具有约1-25毫米之间范围的粒径的材料；和b)将所述粉碎的甲壳动物材料分离为磷脂-肽复合物(PPC)组合物亚组分，其中所述亚组分包含少于500ppm的氟化物含量。在一个实施方式中，该方法进一步包括用包含溶剂的流体提取所述PPC组合物亚组分，其中生成了低氟化物油，所述油具有少于0.5ppm的氟化物含量。在一个实施方式中，提取进一步生成低三甲胺/三甲胺氧化物油，其中所述三甲胺少于约0.001％(w/w)且所述三甲胺氧化物少于约0.02％(w/w)。在一个实施方式中，进行分离而无乳化。在一个实施方式中，溶剂包含非极性溶剂。在一个实施方式中，溶剂包含至少一种极性溶剂。在一个实施方式中，溶剂包含所述非极性溶 剂和所述至少一种极性溶剂。在一个实施方式中，该非极性溶剂包括但不限于超临界二氧化碳和超临界二甲醚。在一个实施方式中，该极性溶剂包括但不限于乙醇和丙酮。在一个实施方式中，该方法进一步包括在所述分离前水解所述甲壳动物材料。在一个实施方式中，该提取进一步生成脱油的PPC组合物。在一个实施方式中，极性溶剂从所述脱油的PPC组合物分离磷脂组合物和蛋白水解物组合物。在一个实施方式中，该提取包括少于10小时。在一个实施方式中，该提取包括少于5小时。在一个实施方式中，该提取包括少于2小时。在一个实施方式中，甲壳动物材料是磷虾材料。在一个实施方式中，该分离包括约1,000-1,800g之间的离心力。在一个实施方式中，该分离包括约5,000-10,000g之间的离心力。
在一个实施方式中，本发明考虑包含低氟化物甲壳动物PPC和低氟化物脱油PPC的混合物的组合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。在一个实施方式中，该甲壳动物PPC是磷虾PPC。在一个实施方式中，该甲壳动物脱油PPC是磷虾脱油PPC。在一个实施方式中，甲壳动物PPC和甲壳动物脱油PPC是以1:1的比率。在一个实施方式中，该混合物包含研磨的精细粉末。在一个实施方式中，该粉末包含约250μm的粒径。在一个实施方式中，该组合物包含少于0.1％(mEq/kg)的过氧化物水平。在一个实施方式中，该组合物包含少于0.1％(w/w)的酰茴香醛(aniside)水平。在一个实施方式中，该组合物进一步包含微胶囊化的多不饱和的Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该组合物进一步包含氧化锌。在一个实施方式中，该组合物进一步包含海洋肽(marine peptide)。在一个实施方式中，该组合物进一步包含至少一种补充氨基酸。
在一个实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括配制包含低氟化物甲壳动物PPC和低氟化物甲壳动物脱油PPC的组合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。在一个实施方式中，该方法进一步包括将所述组合物研磨成粉末。在一个实施方式中，该方法进一步包括将所述组合物压成片。在一个实施方式中，该方法进一步包括将所述组合物封装入胶囊。在一个实施方式中，该方法进一步包括将所述粉末与食品混合。在一个实施方式中，该配制进一步包含微胶囊 化多不饱和Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该配制进一步包含氧化锌。在一个实施方式中，该配制进一步包含海洋肽。在一个实施方式中，该配制进一步包含至少一种补充氨基酸。
在一个实施方式中，本发明考虑包含低氟化物甲壳动物PPC和甲壳动物蛋白水解物的混合物的组合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。在一个实施方式中，甲壳动物PPC是磷虾PPC。在一个实施方式中，甲壳动物蛋白水解物是磷虾蛋白水解物。在一个实施方式中，甲壳动物PPC和甲壳动物蛋白水解物是以1:1的比率。在一个实施方式中，该混合物包含研磨的精细粉末。在一个实施方式中，该粉末包含约250μm的粒径。在一个实施方式中，该组合物包含少于0.1％(mEq/kg)的过氧化物水平。在一个实施方式中，该组合物包含少于0.1％(w/w)的酰茴香醛水平。在一个实施方式中，该组合物进一步包含微胶囊化的多不饱和的Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该组合物进一步包含氧化锌。在一个实施方式中，该组合物进一步包含海洋肽。在一个实施方式中，该组合物进一步包含至少一种补充氨基酸。
在一个实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括配制包含低氟化物甲壳动物PPC和甲壳动物蛋白水解物的组合物，其中所述氟化物水平范围在约200-500ppm之间。在一个实施方式中，该方法进一步包括将所述组合物研磨成粉末。在一个实施方式中，该方法进一步包括将所述组合物压成片。在一个实施方式中，本方法进一步包括将所述组合物封装入胶囊。在一个实施方式中，该方法进一步包括将所述粉末与食品混合。在一个实施方式中，该配制进一步包括微胶囊化多不饱和Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该配制进一步包括氧化锌。在一个实施方式中，该配制进一步包括海洋肽。在一个实施方式中，该配制进一步包括至少一种补充氨基酸。
在一个实施方式中，本发明考虑包含范围约40-50％之间的脂质和少于0.5mg/kg氟化物的磷脂-肽复合物(PPC)组合物。在一个实施方式中，脂质包含磷脂。在一个实施方式中，本发明考虑一种油组合物，其包含约400-500克/kg的磷脂、约200-260克/kg的Omega-3脂肪酸、少于0.5mg/kg的氟化物、约15克/kg的溶血磷脂酸、和少于约8克/kg 的游离脂肪酸。在一个实施方式中，本发明考虑一种脱油磷脂-肽复合物(PPC)组合物，其包含约300-400克/kg的脂质，其中约0.1-1.0％为游离脂肪酸和范围在约22-27％(w/w)之间的Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，脂质包含磷脂。在一个实施方式中，本发明考虑包含至少75％磷脂的甲壳动物脂质组合物。在一个实施方式中，脂质组合物包含约75％-90％之间的磷脂。在一个实施方式中，脂质组合物包含约75％-80％之间的磷脂。在一个实施方式中，本发明考虑包含约70-80％蛋白质、约1.5-3.0％脂质，和约5-7％灰分的干燥蛋白水解物组合物。
在一个实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括：a)提供：i)水解并粉碎的甲壳动物材料；ii)至少一个能够分离所述水解甲壳动物材料的卧式离心机；和iii)包含溶剂的流体；和b)用第一卧式离心机将所述水解甲壳动物材料分离为高氟化物固体部分和低氟化物水解材料部分；c)用第二卧式离心机将所述低氟化物水解材料部分分离为磷脂-肽复合物(PPC)组合物亚组分和浓缩的水解产物亚组分；和d)使所述PPC组合物亚组分与所述流体接触，其中低氟化物油被提取。在一个实施方式中，粉碎的甲壳动物材料具有约1-25毫米之间的粒径。在一个实施方式中，第一卧式离心机分离所述水解甲壳动物材料而无乳化。在一个实施方式中，溶剂包含非极性溶剂。在一个实施方式中，非极性溶剂包含超临界CO₂。在一个实施方式中，溶剂包含极性溶剂。在一个实施方式中，极性溶剂包含乙醇。在一个实施方式中，第二卧式离心机包含延伸的分离路径。在一个实施方式中，接触在少于300巴的压力下进行。在一个实施方式中，非极性溶剂进一步从所述PPC组合物亚组分提取脱油PPC组合物。在一个实施方式中，乙醇将磷脂组合物和蛋白水解物组合物从所述脱油PPC组合物分离。在一个实施方式中，脱油PPC在少于10小时的时间内从PPC分离。在一个实施方式中，脱油PPC在少于5小时的时间内从PPC分离。在一个实施方式中，脱油PPC在少于2小时的时间内从PPC分离。在一个实施方式中，水解甲壳动物材料包含水解磷虾材料。在一个实施方式中，分离所述水解甲壳动物材料在约1,000-1,800g之间的离心力下进行。在一个实施方式中，分离所述低氟化物水解材料部分在约5,000-10,000g之 间的离心力下进行。在一个实施方式中，该方法生成包含范围在约40％-50％之间的脂质和少于0.5mg/kg的氟化物的磷脂-肽复合物(PPC)组合物。在一个实施方式中，该方法生成一种油组合物，其包含约400-500克/kg的磷脂、约200-260克/kg的Omega-3脂肪酸、少于0.5mg/kg的氟化物、约15克/kg的溶血磷脂酸、和少于约8克/kg的游离脂肪酸。在一个实施方式中，该方法生成脱油磷脂-肽复合物(PPC)组合物，其包含约300-400克/kg的脂质，其中约0.1-1.0％为游离脂肪酸和范围在约20-28％(w/w)之间的Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该方法生成包含至少75％磷脂的甲壳动物脂质组合物。在一个实施方式中，脂质组合物包含范围在约75％-90％之间的磷脂。在一个实施方式中，脂质组合物包含范围在约75％-80％之间的磷脂。在一个实施方式中，该方法生成包含约70-80％蛋白质、约1.5-3.0％脂质和约5-7％灰分的干燥蛋白水解物组合物。
在一个实施方式中，本发明考虑一种系统，其包括：a)包含至少一种非极性溶剂进口的溶剂单元；b)与溶剂单元流体连通的提取罐单元，其中该罐包括经配置接收磷脂-蛋白质复合物组合物的进口；c)包括经配置释放低氟化物油组合物和残余共溶剂的出口的分离器单元，其中该分离器与罐流体连通；d)与该分离器单元流体连通的吸收剂单元，其中该吸收剂单元能够回收非极性溶剂。在一个实施方式中，非极性溶剂是超临界流体。在一个实施方式中，该超临界流体包含二氧化碳。在一个实施方式中，该超临界流体包含二甲醚。在一个实施方式中，该溶剂单元进一步包含共溶剂进口。在一个实施方式中，共溶剂是极性溶剂。在一个实施方式中，极性溶剂时乙醇或丙酮。在一个实施方式中，至少一个非极性溶剂进口包括未使用的非极性溶剂进口。在一个实施方式中，至少一个非极性溶剂进口包括回收的非极性溶剂进口。在一个实施方式中，溶剂单元进一步包括流体泵。在一个实施方式中，罐单元通过流体泵增压。在一个实施方式中，溶剂单元进一步包括加热器。在一个实施方式中，罐单元中的磷脂-蛋白质复合物组合物通过加热器加热。在一个实施方式中，分离器出口与蒸发器流体连通。在一个实施方式中，分离器进一步包括卧式离心机。在一个实施方式中，卧式离心机是具有延伸的分离路径的沉降式离心机。在一 个实施方式中，磷脂-蛋白质复合物组合物是低氟化物甲壳动物磷脂-蛋白质复合物组合物。在一个实施方式中，低氟化物甲壳动物磷脂-蛋白质复合物组合物是低氟化物磷虾磷脂-蛋白质复合物组合物。
在一个实施方式中，本发明考虑处理甲壳动物特别是磷虾的方法，在该方法中，甲壳动物被粉碎成较小的颗粒，将淡水加入粉碎的材料，加热水和粉碎的材料并加入酶(一种或多种)用于水解该粉碎的材料，且所述酶(一种或多种)是失活的，该方法进一步包括步骤：a)从水解材料中除去固体以减少材料的氟化物含量；b)将磷脂-肽复合物材料和浓缩的水解产物部分彼此分离；c)干燥所述磷脂-肽复合物材料；和d)通过至少使用超临界CO₂作为溶剂提取(一次或多次)将干燥的产物或PPC分成多个组分，其中甲壳动物的处理在甲壳动物捕获物一被铺到轮船或小船的甲板上就开始。在一个实施方式中，含氟化物的固体通过沉降式离心机从水解材料中除去。在一个实施方式中，磷脂-肽复合物材料和浓缩的水解产物部分通过具有高离心力和长净化/分离区的双锥筒体离心机(sedicanter)彼此分离以避免乳化。在一个实施方式中，该方法进一步包括在提取中除了超临界CO₂之外使用乙醇作为共溶剂来分离：i)由磷脂和甘油三酯组成的磷虾油，或中性油，和ii)来自PPC的蛋白水解物。在一个实施方式中，溶剂的压力为至多300巴。在一个实施方式中，提取包括两个步骤：i)首先只使用超临界CO₂作为溶剂从PPC分离脱油PPC；和ii)其次只使用乙醇作为溶剂从脱油PPC分离磷脂和蛋白水解物。在一个实施方式中，所述脱油PPC从PPC提取的步骤持续时间为至多3小时。在一个实施方式中，该方法生成含有约40％-50％脂质和约0.5mg/kg氟化物的磷脂-肽复合物(PPC)组合物。在一个实施方式中，脂质包含磷脂。在一个实施方式中，该方法生成油组合物，其包含约400-500克/kg的磷脂、约200-260克/kg的Omega-3脂肪酸、约0.5mg/kg的氟化物、约15克/kg的溶血磷脂酸和少于约8克/kg的游离脂肪酸。在一个实施方式中，该方法生成脱油磷脂-肽复合物(PPC)组合物，其包含约300-400克/kg的脂质，其中约0.1-1.0％为游离脂肪酸和约22-27％(w/w)为Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该方法生成包含约75％极性脂质的甲壳动物磷脂组合物。在一个实施方式中，该方法生成包含约70-80％蛋白质、约1.5-3.0％脂质和约5-7％ 灰分的干燥蛋白水解物组合物。
定义
如本文所使用的术语“粉碎的材料”是指任何生物材料，其已经进行过机械破坏和/或分裂产生具有约1-25毫米之间、优选约3-15毫米之间、更优选约5-10毫米之间且最优选约8毫米粒径的组合物。
如本文所使用的术语“水解材料”是指已经进行过高热和/或酶处理的任何生物材料。此类水解材料将预期具有从甲壳质的外骨骼组分物理分离的磷脂/肽组分。
如本文所使用的术语“甲壳动物”是指具有包围肉质内部的硬质外壳的任何海洋有机体，其为活的有机体。更具体地，通常认为甲壳动物是一大类主要是水生的节肢动物，其具有甲壳质的或钙质的和甲壳质的外骨骼、在每节上一对通常更加改进的附肢，和两对触角。例如，甲壳动物可包括但不限于磷虾、龙虾、河虾、蟹、木虱、水蚤和/或藤壶。
术语“卧式离心机”是指能够在Z面(如相对于常规离心机的X-面和/或Y-面)上旋转混合物的任何装置。这种旋转由在管形外壳内被水平排列的螺旋形传送元件产生。引起的离心力接着将较重的颗粒分层到外壳的外侧边缘，而较轻的颗粒形成较靠近外壳的中心的层。一些卧式离心机被改良以包括延伸的分离路径并引起高重力(例如，双锥筒体离心机，sedicanter)。
如本文所使用的术语“极性溶剂”是指任何与水混溶的化合物或化合物混合物。此类极性溶剂化合物包括但不限于乙醇、丙醇和/或乙酸乙酯。
如本文所使用的术语“非极性溶剂”是指任何不与水混溶的化合物或化合物混合物。此类非极性溶剂化合物包括但不限于己烷、戊烷、二甲醚和/或CO₂。二甲醚或CO₂可在超临界相中使用。
术语“超临界”是指任何混合物，其包含处于流体状态同时保持在或高于其临界温度和临界压力——在此其特性膨胀以像气体一样填充容器但具有像液体一样的密度——的化学品(例如，二氧化碳(CO₂)或二甲醚)。例如，二氧化碳在高于31.1℃和72.9atm/7.39MPa时变 成超临界流体。二氧化碳在标准温度和压力(STP)下空气中通常表现为气体，或冷冻时表现为被称为干冰的固体。如果温度和压力均从STP升高至二氧化碳的临界点或高于二氧化碳的临界点，其可采用气体和液体之间的特性。如本文考虑的，除了其低毒性和最小的环境影响，超临界CO₂在化学提取过程中可被用作商业和工业溶剂。处理的相对低的温度和CO₂的稳定性还允许大多数化合物(即，例如，生物化合物)伴随着少许的损坏和变性被提取。此外，由于许多在CO₂中被提取的化合物的溶解性可随着压力变化，超临界CO₂可用于进行选择性提取。
如本文可交换地使用的术语“氟化物”是指任何包含有机氟化物和/或无机氟化物的化合物。
如本文所使用的术语“高氟化物固体部分”是指水解和粉碎的甲壳动物材料的低重力(例如，约1,000-1,800g之间)卧式离心分离后包含绝大多数甲壳动物的外骨骼的组合物。该部分包含甲壳动物外骨骼的小颗粒，其在这些有机体中保留绝大多数氟化物(即，例如，50-95％之间)。
如本文所使用的术语“低氟化物”可指从原料减少氟化物约10倍(即，例如，从5ppm至0.5ppm)的任何方法和/或处理的产物。例如，‘低氟化物甲壳动物磷脂-蛋白质复合物’包含比‘低氟化物水解和粉碎的甲壳动物材料’少10倍的氟化物。
如本文所使用的术语“低氟化物水解材料部分”是指水解和粉碎的甲壳动物材料的低重力(例如，约1,000-1,800g之间)卧式离心分离后包含绝大多数甲壳动物肉质内部材料的组合物。该部分包含磷脂、中性脂质、蛋白质和/或肽的小颗粒，其很大程度上不含任何氟化物(即，例如，在原水解和粉碎材料的5％-50％之间)。
如本文所使用的术语“低氟化物磷脂-肽复合物组合物亚组分”是指低氟化物水解材料部分的高重力(例如，约5,000-10,000g之间)卧式离心分离后包含绝大多数脂质材料的低氟化物组合物。
如本文所使用的术语“浓缩的水解产物组合物亚组分”是指低氟化物水解材料部分的高重力(例如，约5,000-10,000g之间)卧式离心分离后包含绝大多数水溶性的贫材料(lean material)的低氟化物组合 物。
如本文所使用的术语“低氟化物油”是指通过使用选择性提取过程如用超临界二氧化碳流体提取磷脂-肽复合物组合物亚组分产生的富含脂质的组合物。这样的处理从原水解和粉碎的甲壳动物材料除去约10倍的氟化物。
如本文所使用的术语“脱油磷脂-肽复合物”是指通过使用选择性提取过程如用超临界二氧化碳流体提取磷脂-肽复合物组合物亚组分产生的含有绝大多数干物质组合物的低氟化物组合物。脱油PPC与PPC相比一般包含减少的甘油三酯含量。
如本文所使用的术语“磷脂组合物”是指通过使用共溶剂如乙醇提取脱油磷脂-肽复合物产生的包含高百分比的极性脂质(例如，约75％)的低氟化物组合物。
如本文所使用的术语“蛋白水解物”是指通过使用共溶剂如乙醇提取脱油磷脂-肽复合物产生的包含高百分比蛋白质(例如，约70-80％)的低氟化物组合物。
如本文所使用的术语“立即”是指将拖网包和/或网中的甲壳动物捕获物铺在甲板上连同直接转移到合适的粉碎机之间的最小实际时间段。例如，该最小实际时间段应优选不超过60分钟，更优选不超过30分钟，甚至更优选不超过15分钟。
如本文所使用的术语“水解”是指粉碎的甲壳动物材料的蛋白质结构中发生的任何断裂或破裂，其中在天然存在的蛋白质中序列变得更短(即，例如，通过断裂氨基酸序列一级结构的肽键)和/或变性(即，例如，打开氨基酸序列的二级、三级和/或四级结构)。该过程可通过水解酶(一种或多种)控制。例如，一种或多种外源蛋白水解酶(例如，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和衍生自微生物或植物物种的酶)可被用在该过程中。可根据使用的酶添加辅因子如具体的离子。选择的酶(一种或多种)还可被选择用于降低由于原料中高浓度的磷脂产生的乳液。除温度外，水解在最佳或接近最佳pH和足够时间内进行。例如，外源酶碱性蛋白酶最佳pH约为8，最佳温度约60℃且水解时间40-120分钟。
术语“溶剂单元”是指任何经配置以加热和加压超临界二氧化碳 流体和/或共溶剂(例如，乙醇)的混合物的封闭体积。这种封闭体积可用任何合适的材料构造，这些材料包括但不限于金属(例如，不锈钢、铝、铁等)、塑料(例如，聚碳酸酯、聚乙烯等)、玻璃纤维(等)。
术语“提取罐”是指任何经配置经受充分加热和加压以从原生物质使用超临界二氧化碳流体提取脂质和蛋白质的封闭体积。如所设计的，本文考虑的提取罐被配置使得包含提取的脂质和蛋白质的溶剂上升到灌顶用于转移到分离器单元。这种封闭体积可用任何合适的材料构造，这些材料包括但不限于金属(例如，不锈钢、铝、铁等)、塑料(例如，聚碳酸酯、聚乙烯等)、玻璃纤维(等)。
术语“分离器单元”是指任何配置有能够分离从提取罐接收的提取的脂质和蛋白质的组分的离心机的封闭体积。各个提取组分经由出口端离开分离器单元使得剩余溶剂(即，超临界CO₂)被转移到吸收剂单元用于回收。这种封闭体积可用任何合适的材料构造，这些材料包括但不限于金属(例如，不锈钢、铝、铁等)、塑料(例如，聚碳酸酯、聚乙烯等)、玻璃纤维(等)。
术语“吸收剂单元”是指任何配置有将从超临界CO₂流体除去污染物的材料的封闭的体积。此类材料可包括但不限于炭(charchol)、木炭(coal)、净化气、塑料聚合物树脂和/或包括单平或双平挤出网的过滤筒(filtration cartridge)(Tenax UK有限公司，Wrexham,North Wales LL139JT,UK)。这种封闭的体积可用任何合适的材料构造，这些材料包括但不限于金属(例如，不锈钢、铝、铁等)、塑料(例如，聚碳酸酯、聚乙烯等)、玻璃纤维(等)。
术语“流体连通”是指流体可以通过其从一个位置运送到另一个位置的任何装置。此类装置可包括但不限于管、桶和/或槽。这种装置可用任何合适的材料构造，这些材料包括但不限于金属(例如，不锈钢、铝、铁等)、塑料(例如，聚碳酸酯、聚乙烯等)、玻璃纤维(等)。
附图说明
图1示出制备低氟化物甲壳动物材料的方法的一个实施方式的流程图。
图2示出具有延伸的分离路径的纵向离心机。该具体实例是 FLOTTWEG SEDICANTER卧式沉降式离心机。
图3绘出适合在本公开方法中使用的提取设备的一个实例。例如，该设备包括溶剂单元(21)、提取罐(22)、分离器(23)和吸收剂(24)。
图4示出显示根据本发明的一个实施方式的两种不同操作的提取效率的示例性数据。
具体实施方式
本发明涉及处理富含脂质的甲壳动物(即，例如，磷虾)以制备包含磷脂、蛋白质养分和油(即，例如，中性的脂质和/或甘油三酯)的低氟化物、三甲胺和三甲胺氧化物的组合物的方法。
磷虾油包含用溶剂从磷虾生物质提取的脂质。磷虾生物质可为新鲜的完整的磷虾(WO2008/06163A1)、冷冻的完整的磷虾(Neptune Technologies&Bioresources公司，加拿大)、冻干的完整的磷虾(JP2215351)或磷虾粉(US20080274203)。用于从磷虾生物质提取脂质的溶剂已被报道为丙酮+乙醇(WO2000/23546；WO2002/102394)、乙醇+己烷(Enzymotec有限公司)、单乙醇(JP2215351；Aker BioMarine ASA，挪威)或超临界CO₂+乙醇共溶剂(US2008/0274203；WO2008/060163)。用于得到磷虾油的无溶剂技术也已被开发(US20110224450A1)。磷虾油包括原磷虾生物质的脂质部分，其基本上不含蛋白质、碳水化合物和/或矿物质。磷虾油还包含中性脂质(例如，主要为甘油三酯)、极性脂质(例如，主要为磷脂)和类胡萝卜素虾青素。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为磷虾油的脂质和/或脂肪酸组合物根据季节变化。
在一些实施方式中，本发明考虑具有意料之外的发现的处理甲壳动物生物质的方法，其包括但不限于：i)从甲壳动物生物质除去大部分外骨骼，在PPC组合物中产生低水平氟化物并在通过非极性溶剂(例如，超临界CO₂)和任选地极性共溶剂(例如，乙醇)从PPC组合物提取的磷虾油中产生极低水平的氟化物；ii)与具有约5-100ppm的氟化物含量的常规磷虾油相比，甲壳动物油中的氟化物水平少于0.5ppm；iii)通过超临界CO₂和乙醇共溶剂从PPC提取的甲壳动物油具 有最少的棕色，表明发生了最少的虾青素降解或三元氧化产物的形成；iv)如在Hunter L*规格上测定的降低的深/棕色；v)如通过570nm处的吸收测定的降低的吡咯含量；vi)最低含量的游离脂肪酸(即，例如，0.8g/100g油(～0.8％w/w))和溶血卵磷脂(即，例如，1.5g/100g油(～1.5％w/w))。这些发现表明甲壳动物生物质的脂质在制备PPC的最初处理步骤过程中经历最少的水解。
I.甲壳动物处理方法的历史回顾
公布GB 2240786公开用于处理磷虾的方法，其包括除去磷虾的部分氟化物含量。该除去是基于使电流经过粉末状的磷虾。然而，含氟化物的固体颗粒保留在材料中。
公布US2011/0224450(Sclabos Katevas等人，以引用方式并入本文)公开从完整的原磷虾使用烹调、用沉降式离心机分离和挤压以及其它方式得到磷虾油的方法。不使用溶剂和提取。
公布WO 2008/060163(Pronova Biopharma AS)公开了使用超临界CO₂和作为共溶剂的乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇得到磷虾油的方法。新鲜的或预加热的(约90℃)完整的磷虾被用作提取进料物。
公布WO 02/102394(Neptune Technologies&Bioresources)公开使用不同相的丙酮和乙醇或例如乙酸乙酯作为溶剂得到磷虾油的方法。冷冻的完整的磷虾被用作进料物。
公布JP 2215351(Taiyo Fishery)公开使用乙醇作为溶剂得到磷虾油的方法。冻干的完整的磷虾被用作进料物。
公布US 2008/0274203(Aker Biomarine ASA，Bruheim等人)(以引用方式并入本文)公开了从磷虾粉在两个阶段的过程中使用超临界流体提取得到磷虾油的方法。阶段1通过用纯的超临界CO₂或CO₂加上约5％的共溶剂提取除去中性脂质。阶段2使用超临界CO₂结合约20％的乙醇提取真正的磷虾油。
与这些常规已知的提取磷虾脂质的技术相关的问题有许多，其包括但不限于：i)完整甲壳动物生物质包含高氟化物外骨骼颗粒导致产生氟化物污染的甲壳动物油；ii)可由于在甲壳动物生物质处理过程中将虾青素暴露于过量的热而产生褐色调颜色的甲壳动物油。具体地，棕色可产 生于虾青素的降解和/或非酶催化的褐化终产物的积累(例如，斯特雷克尔氨基酸降解产物或聚合的吡咯)。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为该非酶催化过程产生的棕色是因为二级脂质氧化产物与氨基酸或蛋白质的氨基反应氧化降解生成所谓的三级氧化产物；iii)运输到提取设备的冷冻甲壳动物生物质可产生相对的稳定性，但已知随着时间推移产品会发生一些变化，例如，冷冻磷虾的一个特征变化是脂质的部分水解，其导致由甘油三酯、磷脂和/或溶血磷脂、特别是溶血卵磷脂(LPC)降解产生的、卵磷脂水解产生的游离脂肪酸(FFA)的积累；和iv)加热和冷冻贮存的使用可导致甲壳动物生物质中脂质和蛋白质的氧化，其中一级氧化导致二级氧化产物的形成，其是挥发性的且可在磷虾油中作为异味或不受欢迎的气味被探测到；和v)从进料物分离磷虾油十分低效，其中只可提取约一半的油。
II.低氟化物甲壳动物材料的制备
在一个实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括在将捕获物呈现在小船和/或轮船(即，例如，渔船)的船板(例如，甲板)上后立即从甲壳动物(即，例如，磷虾)形成磷脂-肽复合物(PPC)组合物。生成PPC组合物的过程包括将甲壳动物粉碎成包含较小颗粒的粉碎的材料(即，例如，约1-25毫米之间)，加水，加热该粉碎的材料，加酶(一种或多种)水解该粉碎的材料，失活该酶(一种或多种)，从该酶处理的材料除去固体(即，例如，外骨骼、外壳和/或甲壳)以降低材料的氟化物含量，分离并干燥该PPC组合物。优选地，将PPC组合物转移到岸边装置(即，鱼油提取设备)，在此低氟化物甲壳动物油使用溶剂从PPC组合物分离，该溶剂包括但不限于超临界CO₂和/或乙醇。使用替代的提取，也从PPC组合物分离脱油PPC组合物、磷脂和/或蛋白水解物。
-本发明一些实施方式的优点是这些甲壳动物产品，如磷虾油，具有低氟化物含量。这是由于固体甲壳动物外骨骼颗粒(即，例如，外壳和/或甲壳)被有效地从待处理的物质除去的事实。
-本发明的另一个优点是甲壳动物油可有效地几乎完全在提取过程中从粉碎的甲壳动物材料(例如，进料物)分离。这是由于这样的事实：在用例如超临界CO₂溶剂提取过程中，进料物包含PPC组合物。尽管不 是必须理解本发明的机制，但是认为进料物的磷脂嵌在水解蛋白的基质中，这表示磷脂和疏水的/磷酸化的蛋白质之间的紧密联系被破坏从而有助于脂质的提取。
-本发明的一个优点是可在提取中使用相对低的压力和温度，其表示较低的生产成本。
-本发明的进一步的优点是在使用超临界CO₂作为溶剂时避免了残余溶剂的清理，在使用其他更常规的脂质溶剂时普遍需要清理残余溶剂。
-本发明的进一步的优点是磷脂酰丝氨酸(PS)、游离脂肪酸(FFA)和溶血卵磷脂(LPC)含量在终产物中非常低。
-本发明的进一步的优点是低氟化物甲壳动物油产品(即，例如，低氟化物磷虾油)具有非常淡的棕色。本领域中认为甲壳动物油的棕色外观表明进料物(例如，粉碎的甲壳动物材料)的制备过程中发生不利的过程。
A.甲壳动物的处理
本发明提供处理甲壳动物捕获物的工业方法，其包括多个步骤，开始是非常早的且基本上完全除去甲壳动物外骨骼(即，例如，硬外皮、甲壳和/或外壳)。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为甲壳动物的外骨骼包含有机体中绝大多数的氟化物。因此，从而该步骤使得氟化物从甲壳动物材料大量除去。该方法还使用纵向离心技术，其防止处理具有高含量的磷脂的原料时由乳液引起的分离问题。
根据本发明的方法在甲壳动物捕获物铺到甲板上后立即开始。重要的是根据本发明的方法在甲壳动物捕获物一铺到甲板上就开始，因为氟化物立即从外骨骼向甲壳动物的肉和体液泄露/扩散。
当术语“立即”与开始根据本发明的过程一起使用时，这涉及从甲壳动物捕获物被铺到甲板上到开始粉碎甲壳动物的时间段。此时间段应保持最小，并且应优选不超过60分钟，更优选不超过30分钟，甚至更优选不超过15分钟，且应包括甲壳动物捕获物从拖网包/网到合适的粉碎器的直接转移。甲壳动物材料的粉碎器可为常规的打浆、磨粉、磨碎或切碎机。
甲壳动物捕获物最初装载到粉碎装置中，其中甲壳动物捕获物进行 打浆、磨粉、磨碎和/或切碎以产生粉碎的甲壳动物材料。粉碎过程的温度大约为水的环境温度(即，例如，约-2和+1℃之间，但更优选在约+0℃至+6℃之间)并可通过任何方便的粉碎方法进行。该粉碎过程还通过先前已知的处理方法方便地完成，且代表根据现有技术的一个障碍，因为其从甲壳动物制备大量的外骨骼颗粒，混合在研磨的材料中并产生具有高氟化物含量的粉碎的糊状物。然而，此高氟化物含量是为什么现有技术处理的甲壳动物材料具有有限的应用并与其他海洋原料例如远洋鱼相比较不适用于食物、饲料或对应于食物或饲料的添加剂的原因之一。
根据本发明甲壳动物材料被分离为适用于进一步分离步骤的粒径，该进一步分离步骤不干预随后的提取步骤。粉碎过程连续进行并产生高至25mm的粒径，优选的粒径范围在约0.5-10mm之间且更优选的粒径范围在约1.0-8mm之间。
尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为该小粒径分布代表本发明的优点之一，因为氟化物具有从研磨的材料泄露并与剩余的原料混合的趋势。然而，该泄露过程费时且不够快以对随后的酶水解步骤产生消极影响，假如水解步骤在关于时间和最佳或接近最佳条件的特定参数中进行，如pH和温度并任选地加上辅因子如根据使用的酶的具体离子。
根据本发明，粉碎的材料的温度可升高至适用于随后酶水解的温度。优选地，温度可在粉碎步骤后数秒(例如，1-300秒，更优选1-100秒，甚至更优选1-60秒，最优选1-10秒)内增加以降低处理时间，从而防止氟化物扩散并用于制备用于酶水解的材料。
根据本发明酶可在粉碎过程前、中或后直接加入粉碎的材料或通过加水或二者加入。
根据本发明，外源蛋白水解酶(例如，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和来自包括但不限于枯草杆菌和/或黑曲霉的微生物的酶、和/或衍生自植物物种的酶)可在粉碎前、中或后，和加热该粉碎的材料前、中或后加入。加入的酶(一种或多种)可为一种单一的酶或多种酶的混合物形式。水解的条件应匹配加入的酶(一种或多种)的最佳水解条件，且用于选择的外源水解酶(一种或多种)的最佳条件的选择为本领域技术人员已知。举个例子，外源酶碱性蛋白酶具有约8的最佳pH，60℃的最佳温度和40-120分钟的水解时间。选择的酶或酶组合还应被选择用于减少由于原 料中高含量的磷脂产生的乳液。
蛋白水解酶(一种或多种)的有效量将在处理和产物最优化过程后设定，其取决于具体选择的商业的酶或多种酶混合的效率。商业的酶典型的按重量计的量，作为粉碎的原料重量的量的比率，为优选在0.5％和0.05％之间，更优选在0.3％和0.07％之间且最优选在0.2％和0.09％之间。该水解步骤由外源(天然)酶辅助，因为快速的不受控制的自溶在新鲜捕获的甲壳动物中是熟知的。
在一个实施方式中，外源酶分解粉碎的物质中的蛋白质材料并加速和/或促进材料的水解以避免和/或排除氟化物从外壳、甲壳和硬外皮的泄露。这些水解酶或水解酶的组合还应仔细地选择以减少分离过程中的乳液。例如，此类酶可选自外肽酶和/或内肽酶。如果使用酶的混合物，则这样的混合物还可包含一种或多种壳多糖酶用于随后使得含壳多糖部分(一个或多个)更服从进一步的下游处理。如果使用壳多糖酶，必须注意勿增加氟化物从甲壳动物的外壳/硬外皮/甲壳到其他部分的泄露。然而，由于此类氟化物泄露耗时，在优选时间参数内可以进行这样的酶催化处理。在最初水解步骤的酶混合物中包含壳多糖酶的更方便的替代将是在分离步骤后处理分离的含壳多糖的部分。
在一个实施方式中，通过在从加入外源酶(一种或多种)开始计算的100分钟、优选60分钟、最优选45分钟的时间间隔内完成粉碎/水解步骤，避免氟化物从研磨的外骨骼材料泄露到研磨的肉质材料。加入的酶(一种或多种)的量与使用的酶产品类型有关。举个例子，可以提到酶碱性蛋白酶可以以原料的0.1-0.5％(w/w)的量加入。这将与加入的外源酶一起并入上下文中，因为加入更多的酶将减少水解步骤的时间间隔。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为短的水解持续时间减少氟化物从外骨骼颗粒到蛋白质材料的扩散时间。
水解处理步骤后或连同水解处理步骤一起，使水解的和粉碎的甲壳动物材料穿过通过重力操作的颗粒除去装置如纵向离心机(即，例如，沉降式离心机)。该第一分离步骤从已水解的或正在水解的甲壳动物材料除去含有相当大量的氟化物的精细颗粒以生产固体部分。离心机用1,000和1,800g之间、更优选1,200和1,600g之间且最优选1,300和1,500g之间的g力操作。通过该颗粒除去步骤，从蛋白质甲壳动物部分除去相 当大量的氟化物。如与具有1,500ppm的典型的氟化物含量的常规的甲壳动物粉相比，氟化物干重基准的减少可高至50％，甚至更优选高至85％，最优选高至95％。
酶催化水解可通过在分离步骤前、中或后将水解材料加热(温育)至超过90℃、优选92-98℃之间且最优选92-95℃之间的温度而终止，只要水解持续时间在上文给出的界限内。水解在精细颗粒除去步骤前、中或后、最优选在精细颗粒除去步骤后终止。在一个实施方式中，第一离心颗粒除去步骤的温度取决于酶的最佳活性温度(在酶催化水解步骤通过精细颗粒分离步骤后的加热终止的情况下)。
现有技术处理的磷虾蛋白质材料中的氟化物含量(例如，～1,500ppm)具有有限的应用并较不适用于食品或饲料或相应的食品或饲料的添加剂。在一个实施方式中，从外骨骼材料除去氟化物含量可接着进行材料如壳多糖、壳聚糖和虾青素的进一步分离/纯化。此类隔离程序在本领域中已知。还可使用技术——包括但不限于透析、纳米过滤、电泳或其他合适的技术——也采取步骤以进一步从隔离的外骨骼材料减少氟化物含量。
水解酶(一种或多种)的失活可以以不同的方式进行，如加入抑制剂、除去辅因子(例如，关键离子通过透析)、通过热灭活和/或通过任何其他失活方法。在这些中，由于将蛋白质材料加热到水解酶变性和失活的温度，优选热失活。然而，如果需要相关天然蛋白质不变性的产物，应选择除加热以外的其他方法用于使水解酶失活。
第一离心形成脱氟化物水解和粉碎的甲壳动物材料部分和固体部分(例如，含有高氟化物的外骨骼颗粒)。如下文所描述的，低氟化物水解和粉碎的甲壳动物材料部分可随后被分离(例如，通过第二离心)以形成低氟化物磷脂-肽复合物(PPC)组合物部分和贫的低氟化物浓缩的水解产物部分(CHF)，其可被用作食品和/或饲料添加剂，且脂质部分主要由中性脂质组成。PPC组合物亚组分富含脂质，像没有颗粒的光滑的乳脂，其中脂质在肽组分中良好地悬浮。该悬浮在不同的PPC组合物组分之间有小的密度差别，从而使其难以用普通离心分离器和/或沉降式分离器进一步分离PPC组合物。这在渔汛期的下半期对甲壳动物捕获物尤其突出。
普通的盘离心分离器(即，在X和Y面中产生旋转力)不恰当地工作以将PPC组合物亚组分分离成其各自的组分，因为用水清空和必要的清洗周期将干扰分离区。常规的离心分离过程导致形成不需要的具有高磷脂(PL)含量和低干物浓度的乳液产物。标准沉降式离心机不能将PPC组合物亚组分分离成其各个组分，这是由于低g力限制、短分离区和从机器排出重相时轻重相的混合。
在一个实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括使用具有延伸的分离路径的卧式沉降式离心机将低氟化物PPC材料分离成亚组分。参见图2。可用于本发明的卧式离心机(例如，在Z面产生旋转力)包括改良的常规沉降式离心机。例如，PPC组合物亚组分将从碗状物通过在分离区中部位于中间的进料管进入普通的沉降式离心机。相比之下，当使用如本文考虑的卧式离心机时，PPC组合物亚组分在出口(1)的末端和对侧进入。这个修改通过提供比普通沉降式离心机明显更长的纯化/分离区并利用机器的全部可用分离长度(2)，提供分离过程的显著改善。驱动能够提供高g力：小机器为10,000g且高容量机器为5,000至6,000g，促进非常精细、慢沉淀的PPC组合物亚组分的分离而无乳化的复杂情况。在即将从挡板(3)下进入前，PPC组合物亚组分将受到最高的g力。从PPC组合物亚组分分离的不同液层通过机器(4)产生的g力压力沿着卧式离心机的轴线逐渐集中从而从挡板(3)下离开机器。PPC组合物亚组分分离成包含约27-30％干物的层使下游处理在操作/稳健性方面有效率并还经济地考虑将干物制备成粉组合物的产量和成本。PPC组合物亚组分分离还产生包含贫水解产物的层，其可蒸发成超过60％的浓缩的水解产物。
B.磷虾的处理
根据本发明的一个实施方式被描绘成处理磷虾的流程图。参见图1。根据本方法的作用，或根据本发明的处理过程在磷虾捕获物一被抬到船上就立即开始。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为氟化物立即开始从甲壳质的外骨骼向死掉的磷虾的肉和体液泄露/扩散。“立即”在这里是指最多60分钟的一段时间，在实践中，例如，15分钟。在这个时间段中，将磷虾捕获物从拖网/网转移到合适的粉碎器。在粉碎器中，磷 虾材料被压碎成相对小的颗粒。粉碎可通过任何方便的方法进行：打浆、磨粉、磨碎或切碎。粉碎过程的温度大约为水的环境温度，即，在-2℃和+10℃之间，优选在+0℃和+6℃之间。粉碎在剩下的磷虾材料中产生大量的甲壳质碎片，从而有助于高氟化物含量。
粉碎的磷虾材料的粒径分布是显著的，因为上文提到的氟化物从甲壳质碎片向剩下的原料泄露。认为较小的粒径引起固体部分从粉碎的磷虾材料更完全地分离。出于这个原因，粒径的优选范围为1.0-8mm。然而，泄露过程相对慢且在接下来的处理阶段中没有时间实现。
接着，将淡水加入粉碎的磷虾材料(步骤11)。例如，在随后的酶水解处理阶段过程中加入的水的体积/L与待处理的粉碎的磷虾材料的重量/kg相同。随着加入的水增加粉碎的磷虾材料的温度使得其适用于水解并加入酶(一种或多种)。加热在粉碎步骤后至多五分钟内快速进行以减少处理时间并从而防止氟化物的扩散和制备用于酶水解的材料。酶(一种或多种)在加热步骤前、中或后可被直接加入或通过加入的水或二者加入粉碎的磷虾材料。
如本文所使用的术语“水解”表示粉碎的物质中的蛋白质结构发生断裂，且蛋白质链变短。该过程由水解酶(一种或多种)控制。例如，一种或多种外源蛋白水解酶(例如，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和衍生自微生物或植物物种的酶)可被用在过程中。可根据使用的酶加入辅因子如特定的离子。选择的酶(一种或多种)还可为了减少原料中高含量磷脂产生的乳液而被选择。除了温度以外，水解在最佳或接近最佳pH和足够的时间内进行(例如，外源酶碱性蛋白酶的最佳pH约为8，最佳温度约为60℃且水解时间为40-120分钟)。
蛋白水解酶(一种或多种)的量将在处理/产物最优化后设定，且自然地取决于选择的酶或酶混合的效率。加入的商业的酶重量与粉碎的磷虾材料的重量的典型比率为0.05％和0.5％之间，优选在0.1％和0.2％之间。已知新鲜捕获的磷虾快速和不受控制的自溶，或通过外源(天然)酶的细胞破坏，出于此原因，本文描述的处理必须在捕获物未被冷冻时毫不延迟地进行。
酶催化水解还引起磷虾软组织和外骨骼之间连接的除去。如果使用酶混合物，混合物还可包含一种或多种壳多糖酶以促进含壳多糖的部分 的进一步处理。壳多糖酶是在壳多糖中破坏糖苷键的酶。
酶催化水解从加入外源酶(一种或多种)开始的100分钟内完成。优选的水解持续时间Δt较短，例如45分钟(步骤12)。相对短的水解持续时间是重要的，因为在该情况下减少氟化物从外骨骼颗粒到其他材料的扩散。
水解通过失活水解酶(一种或多种)停止(步骤13)。有许多失活酶的方法。这里使用的是热失活：使酶催化处理材料的温度升高至超过90℃，优选在92-98℃之间，在该情况下，水解酶变性。实践中水解酶(一种或多种)的失活还可在固体颗粒除去过程中或之后进行。
固体颗粒(例如，磷虾外骨骼)通过穿过基于离心力的设备如常规的卧式离心机和/或沉降式离心机从酶催化水解和粉碎的磷虾材料除去(步骤14)。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为这些固体颗粒或固体来自于磷虾的外骨骼并如提到的包含相当多大的氟化物。沉降式离心机用1,000和1,800g之间、优选1,300和1,500g之间的力操作。通过该颗粒除去步骤，从磷虾材料除去超过90％的相当大量的氟化物。沉降式离心机内的温度为例如90℃，且如果酶(一种或多种)的失活在固体除去后进行，沉降式离心机内的温度接着增加至例如93℃。
接着，具有低氟化物含量的水解和粉碎的磷虾材料通过穿过延伸的分离路径卧式离心机(即，例如，双锥筒体离心机)改性。参见图1步骤15和图2。在双锥筒体离心机中，水解和粉碎的磷虾材料被分离成有价值的脂肪部分、或PPC(磷脂-肽复合物)材料部分、和CHF部分(浓缩的水解产物部分)。
因为磷虾材料内的小密度差别，水解和粉碎的磷虾材料分离成PPC材料是困难的。双锥筒体离心机是改良的卧式离心机，其包括长水平净化/分离区并产生高离心力(5,000至6,000g)。这些特征促进精细、慢沉淀的PPC分离而无乳化。后者在具有短分离区和较低力的普通离心机中是个问题，且其中水被用于清空和清洗周期。从双锥筒体离心机压出的PPC材料的干物质浓度约为27-30％。
然后可将PPC材料干燥成粉以避免脂质氧化。图1，步骤16。干燥过程是温和的具有低温(0-15℃，优选2-8℃)和惰性条件，其给予长链多不饱和Omega-3脂肪酸降低的氧化压力。冻干过程也将是合适的，因 为它避免了产品过热。
PPC磷虾粉，或简称PPC，接着在氮气气氛中包装到气密密封袋中用于稍后直接使用和继续处理。
处理的原贫南极磷虾的典型物质平衡在下文表I中示出：
表I：南极磷虾的典型物质平衡

分离前水解和粉碎的磷虾材料中氟化物含量为1.2g/kg，而分离后，PPC为至多0.5g/kg且通常为0.3g/kg。因此，已除去约三分之二的氟化物。
当进一步处理PPC时，组分可通过提取隔离。在该阶段中，可使用溶剂。图1，步骤17。例如，为了从PPC获得磷虾油，可单独或组合使用超临界CO₂和/或乙醇。除磷虾油外，提取过程还产生蛋白水解物(步骤18)。
将材料(例如，二氧化碳或二甲醚)压缩并加热到超过其临界温度和压力产生超临界流体。其密度介于液体和气体之间并可作为温度和压力的函数变化。因此，可调整超临界流体的溶解度使其可获得选择性提取。由于类似气体的特性，由于扩散速率较高，与液体提取相比，可实现快速提取。由于CO₂能够容易达到其临界参数，其为常用的超临界流体。例如，一个报告已经证明，通过在500巴压力和100℃温度使用超临界流体提取，磷虾磷脂具有低产量。Yamaguchi(1986)。第二份报告提供特定处理条件的数据，其包括压力和温度范围(例如，300至500巴和60至75℃)。这些数据来自中试规模过程，其中实现了磷虾总脂质的84至90％的提取。Bruheim等人，美国专利申请公开号2008/0274203(以引用方式并入本文)。
超临界CO₂还是不易燃的、廉价的和惰性的，其中当考虑工业适用性时此类因素是相关的。惰性导致提取过程中不稳定化合物的低等级的氧化。CO₂还具有低表面张力，其为一个优点，使得提取介质可有效地渗透材料。为了提取更多极性的物质，CO₂可与极性溶剂如乙醇混合。改性剂的水平可变化以也提供额外的选择性。
因此，使用高温和高压的目前可用工业规模超临界流体提取过程已导致常规磷虾粉的低提取效率，从而提供不足的油产量以提供用于磷虾提取的商业可用溶液。另外，这些目前可用提取过程无法解决本文讨论的关于提供低氟化物粉和/或油组合物问题。
因此，已经研发本文描述的改善的溶剂提取方法。在一个实施方式中，共溶剂与超临界CO₂或超临界二甲醚单独或乙醇、己烷、丙酮的各种组合一起使用。例如，如果将乙醇单独用作提取溶剂，已经观察到，相比用超临界CO₂提取，对磷虾材料有较少选择性。Pronova等人，WO2008/060163A1。结果，不需要的物质被提取到磷虾油中，导致需要额外的提取后净化/处理。另外，只用乙醇提取的磷虾油倾向于具有较高的粘性和较深的颜色，其与油的虾青素含量不相关。
在一些实施方式中，本发明考虑具有意料之外的发现的方法，其包括但不限于：i)使用低压力(即，例如，约177至300巴之间)和低温(即，例如，约33和60℃之间)提取PPC；和ii)产生高产量脂质提取(数据可用)。似乎包含水解的蛋白质的磷虾粉允许更简单地提取相关的脂质特别是富含磷脂部分的磷虾油。
本文提出的数据示出发现超临界CO₂为选择性提取方法，因为与由单乙醇提取和/或丙酮+乙醇提取制备的磷虾油相比，其产生包含甘油三酯、磷脂和虾青素的具有最少棕色和优异感官质量的高纯度提取物。认为磷虾油的棕色是不合需要的。棕色的提取源未知，但认为其与磷虾粉磷脂制备过程中磷虾脂质的氧化和/或类胡萝卜素虾青素的降解有关。
此类超临界流体的特性可通过改变压力和温度改变，允许选择性组分的提取。超临界CO₂的提取条件超过31℃的临界温度和74巴的临界压力。改性剂的加入可轻微地改变这些值。例如，中性脂质和胆固醇可用高至370巴压力和高至45℃温度的CO₂从蛋黄提取，而使用更高的温度，例如55℃，将引起磷脂提取率增加。CO₂具有高工业适用性因为其 是不易燃的、廉价的和惰性的。惰性导致提取过程中不稳定化合物的低氧化。
如所提到的，超临界CO₂或超临界二甲醚都是流体。其密度介于液体和气体之间并可作为温度和压力的函数变化。因此，可调整超临界流体的溶解度使其可获得选择性提取。由于类似气体的特性，与液体提取相比，可实现快速提取。在本方法中提取是有效的：分离甚至95％的PPC中存在的磷虾油。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为进料物的磷脂嵌在水解蛋白的基质中，其表示磷脂和疏水/磷酸化的蛋白质之间的紧密联系被破坏，因此促进脂质的提取。此外，在CO₂提取过程中最少量的氟化物含量被转移到油。例如，PPC的氟化物含量为约0.3g/kg，但CO₂提取后，磷虾油的氟化物含量少于0.5mg/kg。
可选地，当只使用超临界CO₂作为溶剂时，可从PPC组合物亚组分分离甘油三酯和/或中性油。图1，步骤19。在一个实施方式中，单独超临界CO₂提取还产生低氟化物“脱油PPC”组合物。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为脱油PPC是PPC组合物亚组分最有价值的部分。在那之后，脱油PPC组合物可使用乙醇作为溶剂提取，其中还产生磷脂亚组分和蛋白水解物部分。参见图1，步骤1A。
在一个实施方式中，本发明考虑包含提取设备的系统，其包括但不限于溶剂单元21、垂直罐22、分离器23和吸收剂24。参见图3。使标准的CO₂和可能的共溶剂进料到溶剂单元，其包括泵以产生某一压力(p)并且包括加热器以产生某一温度(T)。超临界CO₂和可能的共溶剂接着进料到罐22的下端。进料物，在该情况中为PPC，通过泵方法进料到罐。被溶剂影响的材料流出罐的上端。分离器22将提取产物例如磷虾油分离到系统的出口。如果乙醇被用作共溶剂，其适当地跟随提取物并必须被蒸发掉。CO₂接着循环到吸收剂23，其在次被清理，并在那之后回到溶剂单元21。
在一个实施方式中，本发明考虑包含但不限于极性脂质(～43％w/w)和/或中性脂质(～46％w/w)的低氟化物PPC组合物。例如，PPC中性脂质范围可在约40-50％(w/w)之间。在一个实施方式中，极性脂质包括但不限于磷脂酰乙醇胺(～3％w/w)、磷脂酰肌醇(～<1％w/w)、磷脂酰丝氨酸(～1％w/w)、卵磷脂(～38％w/w)和/或溶血卵磷脂(～2％ w/w)。在一个实施方式中，中性脂质包括但不限于甘油三酯(～40％w/w)、甘油二酯(～1.6％w/w)、甘油单酯(～<1％w/w)、胆固醇(～2％w/w)、胆固醇酯(～0.5％w/w)、游离脂肪酸(～2％w/w)和脂肪(～48％w/w)。在一个实施方式中，中性脂质脂肪包含约75％的脂肪酸。在一个实施方式中，中性脂质脂肪脂肪酸包含但不限于饱和的脂肪酸(～28％w/w)、单烯脂肪酸(～22％w/w)、n-6多不饱和脂肪酸(～2％w/w)和/或n-3多不饱和脂肪酸(～26％w/w)。参见，实施例XIII。
建立磷脂分布(profile)以评估通过本文描述的方法提取的低氟化物磷虾油。例如，核磁共振技术已确定卵磷脂是磷虾油最大的磷脂组分且其比例相对稳定。数个磷虾油样本经历独立的分析。参见，实施例XII。在一个实施方式中，本发明考虑包含约39-52％(w/w)磷脂的低氟化物磷虾油。在一个实施方式中，磷脂包含范围在约65-80％(w/w)之间的卵磷脂。在一个实施方式中，磷脂包含范围在约6-10％(w/w)之间的烷基酰基卵磷脂。在一个实施方式中，磷脂包含范围在约0.3-1.6％(w/w)之间的磷脂酰肌醇。在一个实施方式中，磷脂包含范围在约0.0-0.7％(w/w)之间的磷脂酰丝氨酸。在一个实施方式中，磷脂包含范围在约2.4-19％(w/w)之间的溶血卵磷脂。在一个实施方式中，磷脂包含范围在约0.6-1.3％(w/w)之间的溶血酰基烷基卵磷脂。在一个实施方式中，磷脂包含范围约1.4-4.9％(w/w)之间的磷脂酰乙醇胺。在一个实施方式中，磷脂包含范围约0.0-2.1％(w/w)之间的烷基酰基磷脂酰乙醇胺。在一个实施方式中，磷脂包含范围在约1-3％(w/w)之间的心磷脂和N-酰基磷脂酰乙醇胺的组合。在一个实施方式中，磷脂包含范围约0.5-1.3％(w/w)之间的溶血磷脂酰乙醇胺。在一个实施方式中，磷脂包含范围约0.0-0.3％(w/w)之间的溶血烷基酰基磷脂酰乙醇胺。
如上所述，低氟化物甲壳动物油的非极性溶剂提取产生低氟化物脱油磷脂-蛋白质复合物组合物(脱油PPC)。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为低氟化物脱油磷脂-蛋白质复合物包含与低氟化物PPC复合物类似的氟化物含量(例如，约200-500ppm之间)。脱油PPC的组分分析包含但不限于极性脂质(～69％w/w)和/或中性脂质(～20％w/w)。在一个实施方式中，极性脂质包括但不限于磷脂酰乙醇胺(～4.2％w/w)、磷脂酰肌醇(～<1％w/w)、磷脂酰丝氨酸(～<1％w/w)、卵磷脂(～62％ w/w)和/或溶血卵磷脂(～2％w/w)。在一个实施方式中，中性脂质包括但不限于甘油三酯(～17％w/w)、甘油二酯(～0.6％w/w)、甘油单酯(～<1％w/w)、胆固醇(～1％w/w)、胆固醇酯(～0.5％w/w)、游离脂肪酸(～1％w/w)和脂肪(～35％w/w)。在一个实施方式中，中性脂质脂肪包含约69％的脂肪酸。在一个实施方式中，中性脂质脂肪脂肪酸包含但不限于饱和脂肪酸(～21％w/w)、单烯脂肪酸(～13％w/w)、n-6多不饱和脂肪酸(～2％w/w)和/或n-3多不饱和脂肪酸(～31％w/w)。参见，实施例IX。
III.低三甲胺甲壳动物材料的制备
三甲胺(TMA)是包含化学式N(CH₃)₃的有机化合物。TMA是无色、吸湿和易燃的叔胺，其在低浓度时可具有强烈的腥味且在较高浓度时具有类似氨水的气味。TMA可商业制备并且还是植物和/或动物分解的天然副产物。它是主要造成通常与腐烂的鱼、一些感染物、和难闻气味相关的味道的物质。它还与摄取大剂量的胆碱和肉碱相关联。
化学上，TMA包含含氮碱基并可容易地被质子化以给出三甲胺阳离子。三甲基氯化铵是从盐酸制备的吸湿无色固体。三甲胺是良好的亲核物质，且该反应是其大部分应用的基础。
三甲胺N-氧化物(TMAO)是包含化学式(CH₃)₃NO的有机化合物。通常遇到的该无色固体为二水合物。TMAO是TMA的氧化产物，其为动物的常见代谢物。TMAO还是咸水鱼、鲨鱼和魟、拟软体动物和甲壳动物中发现的渗透质。进一步，TMAO可用作蛋白质稳定剂，其可用于抵消脲——鲨鱼、鳐鱼和魟的主要渗透质。TMAO在深海鱼和甲壳动物中具有高浓度，其中它可抵消压力的蛋白质不稳定效果。Yancey，P。“Organic osmolytes as compatible,metabolic,and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses”J.Exp.Biol.208(15):2819-2830(2005)。TMAO分解为三甲胺(TMA)，其是变质海鲜的特征的主要有气味的物质。
从甲壳动物产品除去TMA/TMAO化合物提供有用的优点，因为这些化合物提供给甲壳动物油强烈的难闻气味。因此，与传统制备的甲壳动物油相比，低TMA/TMAO化合物具有改善的商业适用性。
在一个实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括提取低氟化物蛋白质肽复合物(PPC)，其为用于通过用任意组合的溶剂提取生产磷虾油的合适的原料，溶剂包括但不限于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氧化碳或二甲醚，以制备低氟化物、低三甲胺甲壳动物产品。在一个实施方式中，低氟化物、低三甲胺甲壳动物产品包含油。在一个实施方式中，低氟化物、低三甲胺甲壳动物产品包含脱油PPC。
二甲醚(DME)先前已被报道为用于多不饱和脂肪的提取溶剂，但不用于低TMA产物的制备。Catchpole等人“Extraction Of Highly Unsaturated Lipids With Liquid Dimethyl Ether”WO 2007/136281。当DME为超临界形式时，溶剂具有足够的溶剂能力以提取磷脂，产生快速温和的提取。与其他超临界流体如CO₂相比，DME可被用在湿原料上并可在低压力下操作。在一个实施方式中，本发明考虑包含具有低TMA/TMAO甲壳动物油的磷虾油的甲壳动物提取产物。在一个实施方式中，该低TMA/TMAO甲壳动物油为磷虾油。
IV.配制的组合物
在一些实施方式中，本发明考虑如本文描述的包含低氟化物甲壳动物PPC的组合物或包含低氟化物甲壳动物脱油PPC组合物和/或蛋白水解物的组合物。在一个实施方式中，该组合物包含甲壳动物PPC复合物、甲壳动物脱油PPC和蛋白水解物任意组合的混合物。尽管不是必须理解本发明的机制，但是认为混合比可为任何比率但优选约1:1的比率。在一个实施方式中，混合物包含研磨的精细粉末。在一个实施方式中，该粉末具有约250μm的粒径。在一个实施方式中，因为较低的过氧化物(例如，<0.1％；mEq/kg)和/或酰茴香醛水平(<0.1％，w/w)，该组合物具有改善的稳定性。在一个实施方式中，因为较低的微生物污染，该组合物具有改善的稳定性。在一个实施方式中，该组合物进一步包含微胶囊化的多不饱和Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该组合物进一步包含氧化锌。在一个实施方式中，该组合物进一步包含海洋肽。在一个实施方式中，该组合物进一步包含至少一种补充氨基酸。
在一些实施方式中，本发明考虑配制如本文描述的包含低氟化物甲壳动物PPC和/或低氟化物甲壳动物脱油PPC和/或蛋白水解物的组合物 的方法。在一个实施方式中，该组合物是粉末。在一个实施方式中，该组合物是片剂。在一个实施方式中，该组合物是胶囊。在一个实施方式中，该方法进一步包括将粉末与食品混合。在一个实施方式中，该混合进一步包含微胶囊化的多不饱和Omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，该混合进一步包含氧化锌。在一个实施方式中，该混合进一步包含海洋肽。在一个实施方式中，该混合进一步包含至少一种补充氨基酸。
实验
实施例I
低氟化物磷虾油的制备
进料物，“翠绿色磷虾粉”颗粒(或如本文描述制备的低氟化物PPC)提供在密封塑料袋中，包含约25kg。进料物保持冷冻直到在提取中使用。颗粒具有通常2-5mm范围内的尺寸分布，但也存在一些精细的部分。颗粒摸起来油腻但仍在压缩下破坏而不是涂开。
5kg批量的进料物以颗粒的形式，如使用超临界CO₂作为溶剂和共沸食品级乙醇作为共溶剂处理，乙醇的重量为CO₂重量的23％。设备预加压到只用CO₂的操作压力，且乙醇在CO₂循环开始时加入。溶剂与进料物的比率为25:1或更大且共溶剂与进料物的比率为5:1。操作在两个提取条件下进行：300巴60℃，和177巴40℃。参见，表II。
表II-磷虾油提取条件


提取的磷虾油材料穿过两个分别保持在90巴和45-50巴的串联的分离容器。将从两个分离器收集的最终磷虾油材料合并在一起并蒸发乙醇。残余的进料物与起始进料物相比包含具有减少的脂质含量的脱油进料物(例如，脱油PPC)。参见，实施例IX。
乙醇蒸发后，通过独立分析在提取操作过程中采用的每个样本生成两个操作1和操作2的磷虾油累积提取曲线。参见，表III。
表III-进步的磷虾油提取样本点和产量

所有操作获得进料物的41-42wt％的总产量。在300巴和60℃进行的操作具有较高的起始提取率。曲线表明在累积CO₂使用范围在21.5-22.0kg每kg进料物之间后的样本编号5处提取实质上完成。估计的最大提取在CO₂:进料比率为26.5:1的点处实现。参见，图3(估计的最大提取用箭头标出)。对于300巴的操作共沸乙醇与CO₂的比率为0.24:1，且对于较低压力的操作略高为0.26:1。
该方法的磷虾油生产得到的结果是总脂质从磷虾粉几乎完全提取(例如，约95％的中性脂质和90％的磷脂)。对于高和低压力操作最终产量相似，但中性脂质在较高的压力下被更快提取。磷脂提取速率在两种提取条件下相似。如下文详细描述的，在该提取过程中，合并的磷虾油总脂质具有刚超过40％的总体磷脂水平且磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸被很少提取。
各种磷虾材料组合物的磷脂分布接着使用传统的柱色谱技术确定。 参见，表IV。
表IV-磷虾组合物的比较的磷脂分布(操作1)

第一列示出分析的特定磷脂。第二列示出起始进料物的磷脂分布(例如，如本文描述制备的低氟化物PPC，或)。第三-第八列(提取物1-6)示出如上文描述的提取过程中采用的每种磷虾油样本的磷脂分布。最后两列示出从磷脂提取柱上和/或下采样的残余提取的进料物的磷脂分布。
数据示出提取的磷虾油样本中主要磷脂是卵磷脂(PC)，范围约从总磷脂的72.7％至80.4％，包含烷基酰基卵磷脂(AAPC)和溶血卵磷脂(例如，LPC和/或LAAPC)的贡献。较少量的磷脂酰乙醇胺(PE)在 进料物(列1，～5.3％)中和磷虾油提取物样本((列3-8)，～3.5-4.5％)中存在。烷基酰基和溶血形式的PE(AAPE，LPE)也在进料物和磷虾油提取物中存在。磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)在进料物中存在，但由于它们在乙醇中溶解差，这些磷脂被很少提取并因此集中在提取的进料物残余物中(例如，与进料物相比在残余的PPC中具有较高水平，参见列9和10)。
进一步分析确定提取的磷虾油的总体相对脂质组分比例。参见，图V。
表V-提取的磷虾油的主要脂质组分(％w/w)