败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用.pdf

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1、10申请公布号CN104059134A43申请公布日20140924CN104059134A21申请号201410106983722申请日20140321201310095061620130322CNC07K14/285200601C07K16/12200601C12N15/31200601A61K39/102200601A61K39/116200601A61K39/295200601A61P31/04200601A61P11/02200601G01N33/68200601G01N33/56920060171申请人施怀哲维克生物科技股份有限公司地址中国台湾台北市内湖区内湖路一段120巷18号4。

2、楼72发明人杨滢臻郭村勇74专利代理机构北京天平专利商标代理有限公司11239代理人孙刚54发明名称败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用57摘要本发明关于一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用，包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；当该抗原决定位为复数个时，各抗原决定位的间可由连接子连接。该重组蛋白进一步可包含至少一个单元的补体裂解片段C3D的氨基酸序列，且该抗原决定位与该补体裂解片段C3D的氨基酸序列可以连接子连接。本发明并关于一种编码如上述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的核苷酸序列，以及一种含有上述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物。66本国优先权数据51INTCL权利。

3、要求书2页说明书21页序列表24页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书21页序列表24页附图3页10申请公布号CN104059134ACN104059134A1/2页21一种败血性巴氏杆菌PASTEURELLAMULTOCIDA毒素重组蛋白，包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位EPITOPES。2如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位系选自于由SEQIDNOS2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38。

4、、39、40、41及42所组成的群组中至少一个。3如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，当该至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位为复数个时，各该败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位之间由连接子连接。4如权利要求3所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该连接子系各自独立选自于由GLYGLY、GLYSER及SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19所组成的群组。5如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白进一步包含至少一个单元的补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列或全长氨基酸序列。6如权利要求5所述的。

5、败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位与该补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列或全长氨基酸序列系以连接子连接。7如权利要求6所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该连接子系各自独立选自于由GLYGLY、GLYSER及SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19所组成的群组。8如权利要求5所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，当该至少一个单元的补体裂解片段C3D的氨基酸序列为复数个时，各该补体裂解片段C3D的氨基酸序列之间由连接子连接。9如权利要求8所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该连接子系各自独立选。

6、自于由GLYGLY、GLYSER及SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19所组成的群组。10如权利要求5所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该补体裂解片段C3D系选自于由SEQIDNOS6、7、8及9所组成的群组。11如权利要求5所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白包含如SEQIDNO10或11所示的氨基酸序列。12一种败血性巴氏杆菌PASTEURELLAMULTOCIDA毒素重组蛋白，其系以下式表示AMC3D片段N；式I其中每一个A代表一个独立的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；其中每一个C3D片段代表一个独立的补体。

7、裂解片段C3D的氨基酸序列；其中M是代表从1至约30的整数；其中N是代表从0至约10的整数。13如权利要求12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，每一个A系各自独立选自于由SEQIDNOS2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所组成的群组。权利要求书CN104059134A2/2页314如权利要求12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，每一个C3D片段系各自独立选自于由SEQIDNOS6、7、8及9所组成的群组。15如权利要求12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其。

8、特征在于，每一个A之间以一个连接子连接，每一个连接子系各自独立选自于由GLYGLY、GLYSER及SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19所组成的群组。16如权利要求12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，每一个C3D片段之间以一个连接子连接，每一个连接子系各自独立选自于由GLYGLY、GLYSER及SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19所组成的群组。17如权利要求12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，A与C3D片段的间以一连接子连接，该连接子系选自于由GLYGLY、GLYSER及SEQIDNOS5、12、13、14、。

9、15、16、17、18、19所组成的群组。18如权利要求12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白包含与式I具有至少80序列同源性的氨基酸序列。19一种编码如权利要求1或12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的核苷酸序列。20一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物，包含如权利要求1或12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及一药学上可接受的载剂。21如权利要求20所述的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，其特征在于，该猪萎缩性鼻炎免疫组合物进一步包含一支气管败血性博德氏杆菌BORDETELLABRONCHISEPTICA、一败血性巴氏杆菌A型菌PASTEURELLAMULTOCIDAT。

10、YPEA以及一败血性巴氏杆菌D型菌PASTEURELLAMULTOCIDATYPED。22如权利要求20所述的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，其特征在于，该猪萎缩性鼻炎免疫组合物进一步包含其他病原抗原，该病原抗原系选自由下列群组所组成者猪环状病毒第二型PCV2抗原、猪流感病毒SIV抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒PRRSV抗原、猪霉浆菌MYCOPLASMA、猪小病毒PARVOVIRUS,PPV、猪丹毒ERYSIPELAS、猪胸膜肺炎放线杆菌ACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIA，APP，以及伪狂犬病AUJESZKYSDISEASE。23一种动物对抗猪萎缩性鼻炎的方法，包含使用如权利要求。

11、20所述的免疫组合物以施予一动物，以增强该动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫力。24一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素的抗体，系藉由如权利要求1或12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白所制备而得。25如权利要求24所述的抗体，该抗体包含至少下列其中一种一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。26一种猪萎缩性鼻炎的检测试剂盒，包含一侦测单元，该侦测单元系选自于下列群组所组成中至少一者一如权利要求1或12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及一藉由如权利要求1或12所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白所制备的抗体。27如权利要求26所述的检测套组，其中该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白系置于一盘上。28如权利要求2。

12、6所述的检测套组，其中该抗体包含至少下列其中一种一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。权利要求书CN104059134A1/21页4败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及其应用技术领域0001本发明关于败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白在动物保健领域上的应用，特别是关于含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物在动物保健领域上的应用。背景技术0002猪萎缩性鼻炎ATROPHICRHINITIS,AR为猪只呼吸系统的三大主要传染病之一。猪萎缩性鼻炎会造成受感染的猪只的颜面骨畸形及慢性化脓性鼻炎，而引起鼻甲介骨的萎缩。在严重感染时，鼻腔、颔骨、上颔骨亦会发生病变。下鼻甲骨的下游窝状部位最常受感。

13、染。上鼻甲、下鼻甲骨、鼻中膈或筛骨等部位均会被感染。0003猪萎缩性鼻炎AR是由支气管败血性博德氏杆菌BORDETELLABRONCHISEPTICA以及败血性巴氏杆菌PASTEURELLAMULTOCIDAA型菌PMA及D型菌PMD所引起，尤其是败血性巴氏杆菌D型菌PMD所产生的毒素PASTEURELLAMULTOCIDATOXIN,PMT。取PMT毒素分别以肌肉、腹腔及鼻腔接种等方式接种于四周龄小猪，均可以引致鼻甲介骨萎缩的病变产生，此外也会波及全身性骨骼发育而使生长迟缓，甚至高剂量接种时，会导致肝脏受损而造成猪只黄疸及死亡。0004猪萎缩性鼻炎AR遍及世界各养猪地区，患猪生长缓慢，饲料利。

14、用效率降低。单独感染时虽然死亡率不高，但污染率却很大，而且容易诱发其他合并症或病原的感染，造成高死亡率，增加生产成本。在猪萎缩性鼻炎AR严重感染的养猪场，其经济损失约为1538，且在重度感染的养猪场有较明显的生长障碍情形，平均日增重约较正常猪只少58。因此开发有效的猪萎缩性鼻炎疫苗，以预防猪只罹患猪萎缩性鼻炎AR可以说是刻不容缓且极为重要的事。发明内容0005本发明于第一部分提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RECOMBINANTPMT,RPMT，该重组蛋白包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位EPITOPES，以诱导动物产生抗败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗体。该败血性巴氏杆菌。

15、毒素重组蛋白RPMT可进一步含有补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列，以增加特异性免疫反应。且各个该败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位之间、各个该补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列之间、以及败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位与补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列之间可进一步由连接子连接。0006本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT，可以由下式所表示0007AMC3D片段N；0008其中每一个A代表一个独立的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位，每一个A系各自独立选自于由SEQIDNOS2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3。

16、0、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所组成的群组；0009其中每一个C3D片段代表一个独立的补体裂解片段C3D的氨基酸序列，每一个C3D说明书CN104059134A2/21页5片段系各自独立选自于SEQIDNOS6、7、8及9所组成的群组；0010其中M是代表从1至约30的整数；0011其中N是代表从0至约10的整数。0012本发明于第二部分提供一种编码一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的核苷酸序列。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列。00。

17、13本发明于第三部分提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物。该猪萎缩性鼻炎免疫组合物含有一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT以及一药学上可接受的载剂。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位EPITOPES，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列。该猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步含有支气管败血性博德氏杆菌BBRONCHISEPTICA、败血性巴氏杆菌A型菌PMA以及败血性巴氏杆菌D型菌PMD。0014本发明于第四部分中提供一种动物对抗猪萎缩性鼻炎的方法，包含使用有效量的上述免疫组合物以施予动物，以增强该动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫力，进。

18、而提升、改善其临床症状、存活率、及增重趋势。0015本发明于第五部分中提供一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素PMT的抗体，系藉由本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT所制备或衍生而得；该抗体包括但不限于单株抗体、多株抗体，以及经基因重组的抗体。0016本发明于第六部分中提供一种猪萎缩性鼻炎的检测套组，该检测套组系用以侦测检验样本是否含有败血性巴氏杆菌D型菌毒素PMT或侦测检验样本内是否含有抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素PMT的抗体。0017本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，与其他习用技术相互比较时，更具有下列的优点0018本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物含有一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋。

19、白RPMT。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位EPITOPES以及补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT远比败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的全长氨基酸序列短，在生物表现系统中较容易表达，且重组蛋白的产率较高，可降低制造疫苗的成本。0019此外，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物所含的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT具有补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列，因此可以增加特异性免疫反应，经试验结果显示，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可提高动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫性及效率。0020本发明系以下面的实施例予。

20、以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。附图说明0021图1为以酵素连结免疫分析ELISA测定抗败血性巴氏杆菌毒素PMT抗体力价的结果；第1组为负对照组；第2组为含有实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌、败血性巴氏杆菌A型菌及败血性巴氏杆菌D型的免疫组合物BBPMAPMD组；第3组为实施例一所得的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT组；第4组为含有败血性巴氏杆菌毒素说明书CN104059134A3/21页6重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物BBPMAPMDRPMT组；第5组为市售猪萎缩性鼻炎疫苗BAYOVAC组。符号代表两组之间具有显著差异P0010022图2为中和抗体试验分析结果；图2A为以含。

21、胎牛血清FBS的DMEM培养液培养VERO细胞的细胞形态负对照组；图2B为以含4倍最小毒性剂量MTD的败血性巴氏杆菌毒素PMT处理VERO细胞的细胞形态正对照组，可见到细胞呈现典型的结节样；图2C为以免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物BBPMAPMDRPMT组的小鼠血清稀释40倍后与4倍最小毒性剂量MTD的败血性巴氏杆菌毒素PMT中和后，加入VERO细胞共培养的细胞形态。0023图3为以酵素连结免疫分析ELISA测定抗败血性巴氏杆菌毒素PMT抗体力价的结果；第1组为负对照组；第2组为含有实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌、败血性巴氏杆菌A型菌及败血性巴氏杆菌D型的免疫。

22、组合物BBPMAPMD组；第3组为含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的猪萎缩性鼻炎免疫组合物BBPMAPMDRPMT组。符号代表两组之间具有显著差异P001。具体实施方式0024本发明提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT，包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位，以诱导动物产生抗败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗体。0025于一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位系分别具有如SEQIDNOS20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所示的氨基酸序列，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白。

23、PMT的抗原决定位可为1至约30个，且各抗原决定位氨基酸序列自蛋白质N端到C端的排列顺序并不限于依照序列辨识号SEQIDNO的顺序排列。0026于一较佳实施例中，分别以三段较长的抗原决定位氨基酸序列涵盖部分上述败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位，该三段较长的抗原决定位氨基酸序列系分别如SEQIDNOS2、3、4所示。于一实施例中，本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT含有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于另一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT含有如SEQIDNO3所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于另一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT含有如SEQ。

24、IDNO4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于再一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT含有如SEQIDNOS2及/或3及/或4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位。于一较佳实施例中，本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT含有二个以上该较长的抗原决定位氨基酸序列。此外，各抗原决定位氨基酸序列自蛋白质N端到C端的排列顺序并不限于依照序列辨识号SEQIDNO的顺序排列。0027于一较佳实施例中，当该败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位及/或该较长的抗原决定位氨基酸序列为复数个2时，各败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位及/或该较长的抗原决定位氨基酸序列之间可进一步由连接子LINKER。

25、连接，该连接子至少含有一个以上的甘氨酸GLYCINE,GLY，该连接子包含但不限于GLYGLY、GLYSER、SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19。于一实施例中，该连接子具有如SEQ说明书CN104059134A4/21页7IDNO5所示的氨基酸序列。然而，该复数个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位及/或该复数个较长的抗原决定位氨基酸序列之间，不必然要由连接子所连接。0028于一实施例中，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT进一步含有补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列，以增加特异性免疫反应。于一实施例中，该补体裂解片段C3D的全长氨基酸序列。

26、为小鼠补体裂解片段C3D的全长序列MC3D，具有如SEQIDNO8所示的氨基酸序列。于一较佳实施例中，该补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列为小鼠补体裂解片段C3D第211个氨基酸至第238个氨基酸片段序列MC3DP28，具有如SEQIDNO6所示的氨基酸序列。于另一实施例中，该补体裂解片段C3D的全长氨基酸序列为猪补体裂解片段C3D的全长序列PC3D，具有如SEQIDNO9所示的氨基酸序列。于另一较佳实施例中，该补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列为猪补体裂解片段C3D第201个氨基酸至第231个氨基酸片段序列PC3DP31，具有如SEQIDNO7所示的氨基酸序列。本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒。

27、素重组蛋白RPMT具有1至10个单元重复的上述补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列，该补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列较佳为1至重复10个单元，更佳为重复4至8个单元。0029当该补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列为数个时，各补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列之间可由连接子连接，该连接子至少含有一个以上的甘氨酸GLY，该连接子包含但不限于GLYGLY、GLYSER、SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19。于一实施例中，该连接子的氨基酸序列为GLYSER。然而，该复数个补体裂解片段C3D的全长或部分氨基酸序列之间，不必然要由连接子所连接。003。

28、0本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT，可以由下式所表示0031AMC3D片段N；式I0032其中每一个A代表一个独立的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位，每一个A系各自独立选自于由SEQIDNOS2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所组成的群组；0033其中每一个C3D片段代表一个独立的补体裂解片段C3D的氨基酸序列，每一个C3D片段系各自独立选自于SEQIDNOS6、7、8及9所组成的群组；0034其中M是代表从1至约30的整数；0035其中N是代表从0至约10的整数。00。

29、36于一实施例中，每一个A之间进一步以一个连接子连接，该每一个连接子系各自独立选自于GLYGLY、GLYSER、SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19。0037于一实施例中，每一个C3D片段之间以一个连接子连接，该每一个连接子系各自独立选自于GLYGLY、GLYSER、SEQIDNOS5、12、13、14、15、16、17、18、19。0038于部分实施态样中，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT与上述式I所表示的氨基酸序列具有至少大约80序列同源性，较佳者，具有大约85序列同源性，更佳者，具有大约90序列同源性，甚至是大约91、大约92、大约93、大约。

30、94、大约95、大约96、大约97、大约98、大约99序列同源性。0039于一较佳实施例中，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT具有三个分别如SEQIDNO2、3、4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位，以及重复6个单元的小鼠补体裂解片段C3D第204个氨基酸至第231个氨基酸片段序列MC3DP28，且各抗说明书CN104059134A5/21页8原决定位EPITOPES的C端以连接子序列如SEQIDNO5所示连接，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT具有如SEQIDNO10所示的氨基酸序列。0040于另一较佳实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT具有三个分别如SEQIDNO。

31、2、3、4所示的氨基酸序列所涵盖的抗原决定位，以及重复6个单元的猪补体裂解片段C3D第201个氨基酸至第231个氨基酸片段序列PC3DP31，且各抗原决定位EPITOPES的C端以连接子序列如SEQIDNO5所示连接，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT具有如SEQIDNO11所示的氨基酸序列。0041本发明并提供一种编码本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的核苷酸序列。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列。该编码本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的核苷酸序列，系由本发。

32、明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的氨基酸序列衍生而来。将本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT氨基酸序列上的各个氨基酸置换为遗传密码表GENETICCODETABLE所列的编码该氨基酸的核苷酸序列包含各种简并密码子DEGENERATECODONS，或称同义密码子，SYNONYMOUSCODONS，即可得到本发明所提供的该核苷酸序列。例如，本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT氨基酸序列上的丝胺酸SERINE可由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC等核苷酸序列所编码。本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT氨基酸序列上的各个氨基酸，可由以下各核苷酸序列所编码0042说明。

33、书CN104059134A6/21页90043此外，本发明亦提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物。该猪萎缩性鼻炎免疫组合物含有一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT。该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT包含至少一个败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位EPITOPES，以及重复0至10个单元的补体裂解片段C3D的部分氨基酸序列。于一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT具有如SEQIDNO10所示的氨基酸序列。于另一实施例中，该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT具有如SEQIDNO11所示的氨基酸序列。0044本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT包含但不限于由基因选殖方式或以胜肽。

34、合成仪PEPTIDESYNTHESIZER合成而得；以基因选殖方式获得该重组蛋白的方式可为，但不限于将编码败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的DNA序列选殖到表说明书CN104059134A7/21页10现载体中，各形成含有编码败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的核苷酸序列的质体，再将该质体转殖到生物表现宿主中，经蛋白质表现后而得到的抗原蛋白。0045该表现载体系统包含但不限于PET载体系统以及PGEX载体系统等；该生物表现系统宿主包含但不限于原核表现系统如大肠杆菌ECOLI、真核表现系统如动物细胞昆虫细胞或哺乳类动物细胞、植物细胞。0046于一实施例中，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物进。

35、一步含有支气管败血性博德氏杆菌BBRONCHISEPTICA、败血性巴氏杆菌A型菌PMA以及败血性巴氏杆菌D型菌PMD。于一较佳实施例中，该支气管败血性博德氏杆菌BBRONCHISEPTICA、败血性巴氏杆菌A型菌PMA以及败血性巴氏杆菌D型菌PMD由行政院农业委员会家畜卫生试验所台湾分让而来。然而，该支气管败血性博德氏杆菌BBRONCHISEPTICA、败血性巴氏杆菌A型菌PMA以及败血性巴氏杆菌D型菌PMD的来源不限于上述来源，其他来源的菌株亦可搭配本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT，例如，该支气管败血性博德氏杆菌BBRONCHISEPTICA亦可为如美国标准生物品收藏中心AMER。

36、ICANTYPECULTURECOLLECTION,ATCC编号ATCC31437，该败血性巴氏杆菌A型菌PMA亦可为如英国国家标准生物品收藏中心NATIONALCOLLECTIONOFTYPECULTURES,NCTC编号NCTC12177，以及该败血性巴氏杆菌D型菌PMD亦可为如英国国家标准生物品收藏中心NCTC编号NCTC12178等菌株，或源自野外分离所得的菌株。0047本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步包含其他病原抗原，该病原抗原系选自由下列群组所组成者猪环状病毒第二型PCV2抗原、猪流感病毒SIV抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒PRRSV抗原、猪霉浆菌MYCOPLASMA、猪。

37、小病毒PARVOVIRUS,PPV、猪丹毒ERYSIPELAS、伪狂犬病AUJESZKYSDISEASE，以及猪胸膜肺炎放线杆菌ACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIA，APP。0048另，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步包含一或多种选自于下列药学上可接受的载剂，包括溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、黏结剂、赋形剂、安定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂、界面活性剂、佐剂、生物型载体等。0049该药学上可接受的载剂包含一或多种选自于下列的试剂溶剂SOLVENT、乳化剂EMULSIFIER、悬浮剂SUSPENDINGAGENT、分解剂DECOMPOSER、黏结剂。

38、BINDINGAGENT、赋形剂EXCIPIENT、安定剂STABILIZINGAGENT、螯合剂CHELATINGAGENT、稀释剂DILUENT、胶凝剂GELLINGAGENT、防腐剂PRESERVATIVE、润滑剂LUBRICANT、界面活性剂SURFACTANT、佐剂ADJUVANT，及其他类似或适用本发明的载剂。0050该药学上可接受的赋形剂可为适合于肠外、肠内或滴鼻施用的药学上可接受的有机或无机载体物质，且该赋形剂不会与活性组合物产生有害的反应。适合的赋形剂包含但不限于水、盐类溶液、蔬菜油、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、脂肪酸单甘酯和甘油、脂肪酸酯。

39、、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。0051该药学上可接受的佐剂包含但不限于水性氢氧化铝胶、明矾、FREUND氏不完全佐剂、油质佐剂、水溶性佐剂、或水包油包水双相佐剂WATERINOILINWATER,W/O/W；于一实施例中，该佐剂为水性氢氧化铝胶。0052进一步地，本发明提供一种动物对抗猪萎缩性鼻炎的方法，包含使用有效量的上述免疫组合物以施予动物，以增强该动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫力，进而提升、改善其临说明书CN104059134A108/21页11床症状、存活率、及增重趋势。0053本发明并提供一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素PMT的抗体，系藉由本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPM。

40、T所制备或衍生而得；该抗体包括但不限于单株抗体、多株抗体，以及经基因重组的抗体。于一实施例中，该抗体系为经由将本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT施打于一动物体内而得到的多株抗体。本发明并提供一种猪萎缩性鼻炎的检测套组，该检测套组系用以侦测检验样本是否含有败血性巴氏杆菌D型菌毒素PMT或侦测检验样本内是否含有抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素PMT的抗体。该检测套组包含但不限于1一抗原，该抗原系为本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT，于一实施例中，该抗原系置于一抗原盘上；及/或2一抗体，该抗体系由该本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT所衍生、制备而得的单株抗体或多株。

41、抗体。0054该检测套组的形式包含但不限于酵素连结免疫分析ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY,ELISA套组、微晶片检验套组MICROCHIPKIT、免疫萤光分析法IMMUNOFLUORESCENTASSAY,IFA检测套组、或其他藉由该败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT所制得的检测套组。于一实施例中，该检测套组至少包含一含有本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的抗原盘，可用以检验样本中是否含有抗败血性巴氏杆菌毒素PMT的抗体。0055于本发明中所使用的单数形式一、及该包含复数形式，除非文中另有清楚指明者。因此，例如，当提及一样本时，包含复数个该等样本及对。

42、该领域具有通常技艺者所知的同等物。0056本文所使用的约、大约或近乎一词实质上代表所述的数值或范围位于20以内，较佳为于10以内，以及更佳者为于5以内。于本文所提供的数字化的量为近似值，意旨若术语约、大约或近乎没有被使用时亦可被推得。0057本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。0058本发明系以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。0059实施例一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT的构筑00601败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白1RPMT1氨基酸序列的设计0061首先以败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT全长氨基酸序列如SE。

43、QIDNO1所示为模板，利用抗原决定位EPITOPES预测网站例如，但不限于BCPREDHTTP/AILABCSIASTATEEDU/BCPREDS/预测败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位。0062EPI预测出的抗原决定位如表1所示SEQIDNOS2042，将这些抗原决定位划分为三个区段，分别编号为EPI1、EPI2及EPI3，其氨基酸序列分别如SEQIDNO2、3、4所示；EPI1、EPI2及EPI3分别含括了表1所示的各个抗原决定位。0063表1败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的抗原决定位预测结果0064划分区段序列SEQIDNOEPI1SSDSSDGN20说明书CN104059134A。

44、119/21页12EPI1YSVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQI21EPI1FSSSDSSDGNVFHYNSLSES22EPI1GKEGAYYPDHDYGPEYNPVW23EPI1LMNIFVERYFDDWDLLNSLA24EPI1SSSDSSDGNVFHYN25EPI1GKEGAYYPDHDYGP26EPI1VERYFDDWDLLNSL27EPI1YNPVWGPNEQIYHS28EPI1VGKEGAYYPDHDYGPEYNPV29EPI2HSDNSVPPFNNPYK30EPI2LLNSTPGTGRPMP31EPI2TVVDSDGA32EPI2TPGTGRPMPGLVQYL。

45、KIPAT33EPI2HSDNSVPPFNNPYKSLYYKG34EPI2LNSTPGTGRPMPGL35EPI2STPGTGRPMPGLVQYLKIPA36EPI3LLNSTPGTGRPMP31EPI3TVVDSDGA32EPI3VASSR37EPI3VLTPPQG380065划分区段序列SEQIDNOEPI3TPGTGRPMPGLVQYLKIPAT33EPI3TELENWQVLTPPQGKILGLK39说明书CN104059134A1210/21页13EPI3PDVASSRVPIEVTE40EPI3LNSTPGTGRPMPGL35EPI3NWQVLTPPQGKILG41EPI3STPGTG。

46、RPMPGLVQYLKIPA36EPI3RVPIEVTELENWQVLTPPQG420066接着以EPI1、EPI2、EPI3不同组合的氨基酸序列设计败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT。分别在EPI1SEQIDNO2、EPI2SEQIDNO3、EPI3SEQIDNO4的氨基酸序列C端各加上一段连接子序列，该连接子具有如SEQIDNO5所示的氨基酸序列，再由N端至C端依序连接EPI1、EPI2、EPI3；并且在EPI3的连接子序列C端加上六个MC3DP28分子佐剂BIOADJUVANT序列SEQIDNO6，每个MC3DP28分子佐剂序列皆以GS连接子连接；得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT。

47、氨基酸序列如SEQIDNO10所示，并以合成仪合成该氨基酸序列或以基因选殖表现方式进行之。00672败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白2RPMT2氨基酸序列的设计0068败血性巴氏杆菌毒素蛋白PMT的的抗原决定位EPITOPES的预测如上述。以EPI1、EPI2、EPI3的氨基酸序列设计败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白RPMT。分别在EPI1SEQIDNO2、EPI2SEQIDNO3、EPI3SEQIDNO4的氨基酸序列C端各加上一段连接子序列，该连接子具有如SEQIDNO5所示的氨基酸序列，再由N端至C端依序连接EPI1、EPI2、EPI3；并且在EPI3的连接子序列C端加上六个PC3DP31分子佐剂BI。

48、OADJUVANT序列如SEQIDNO7所示，每个PC3DP31分子佐剂序列皆以GS连接子连接；得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白2RPMT2氨基酸序列如SEQIDNO11所示，并以合成仪合成该氨基酸序列或以基因选殖表现方式进行之。0069实施例二支气管败血性博德氏杆菌BORDETELLABRONCHISEPTICA及败血性巴氏杆菌PASTEURELLAMULTOCIDA的培养00701支气管败血性博德氏杆菌BBRONCHISEPTICA的培养0071于本实施例中，支气管败血性博德氏杆菌BBRONCHISEPTICA由行政院农业委员会家畜卫生试验所台湾分让而来。0072先将该支气管败血性博德氏杆。

49、菌BBRONCHISEPTICA接种于TSB固体培养基上含5V/V酵母抽出液YEASTEXTRACT、10V/V血清、大豆分解蛋白质干酪素培养基TRYPTICSOYBROTH,TSB，BD公司，美国，于37下培养隔夜后，挑选单一菌落接种于脑心浸出液BRAINHEARTINFUSION,BHI液体培养基内BD公司，美国，于37下震荡培养隔夜；接着取菌液再接种于BHI液体培养基内，于37下震荡培养隔夜，并计算菌落形成单位COLONYFORMINGUNIT,CFU值；最后加入甲醛FORMALDEHYDE，于室温下震荡24至36小时，对菌液进行不活化作用。00732败血性巴氏杆菌PMULTOCIDA的培养0074于本实施例中，败血性巴氏杆菌A型菌PMA及败血性巴氏杆菌D型菌PMD由行政院农业委员会家畜卫生试验所台湾分让而来，且该败血性巴氏杆菌D型菌PMD说明书CN104059134A1311/21页14具有产生毒素能力。0075先将败血性巴氏杆菌A型菌PMA及败血性巴氏杆菌D型菌PMD分别接种于TSB固体培养基上含5V/V酵母抽出液、10V/V血清、大豆分解蛋白质干酪素培养基TSB，BD公司，美国，于37下培养隔夜后，挑选单一菌落接种于脑心浸出液BHI液体培养基内BD公司，美国，于37下震荡培养隔夜；接着取01V/V菌液再接种于BHI。