雷帕霉素二醛化合物 本发明涉及可作为神经营养剂用于治疗实体瘤和高增生性血管病的非免疫抑制性雷帕霉素二醛化合物、其制备方法和含有其的药物组合物。
雷帕霉素是一种由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环三烯抗生素，已发现其具有体外和体内抗真菌活性，特别是抗白色念珠菌的活性[C.Vezina等人，J.Antibiot.28，721(1975)；S.N.Sehgal等人，J.Antibiot.28，727(1975)；H.A.Baker等人，J.Antibiot.31，539(1978)；美国专利3,929,992；和美国专利3,993,749]。此外，单独的雷帕霉素(美国专利4,885,171)或与溶血链球菌(美国专利4,401,653)组合的雷帕霉素也显示出抗肿瘤活性。
雷帕霉素的免疫抑制作用已在FASEB 3，3411(1989)中公开。其他大环分子Cyclosporin A和FK-506也显示出可有效用作免疫抑制剂，并由此可用于预防移植排斥[FASEB 3，3411(1989)；FASEB 3，5256(1989)；R.Y.Calne等人，Lancet 1183(1978)；和美国专利5,100,899]。R.Martel等人[Can.J.Physio.Pharmacol.55,48(1977)]公开了雷帕霉素可有效用于实验性过敏脑脊髓炎模型，这是一种多发性硬化的模型；用于佐剂关节炎模型，这是一种类风湿性关节炎的模型；并有效地抑制IgE样抗体的形成。FK-506和一些合成的FKBP-12结合性配体显示出具有神经保护性和神经再生性[US5696135，US5721256，US5780484，US5811434和US5840736]。
雷帕霉素也可用于预防或治疗全身性红斑狼疮[美国专利5,078,999]，肺部炎症[美国专利5,080,899]，胰岛素依赖型糖尿病[美国专利5,321,009]，皮肤病，比如牛皮癣[美国专利5,286,730]，肠病[美国专利5,286,731]，继血管损伤之后的平滑肌细胞增生和内膜肥厚[美国专利5,288,711和5,516,781]，成人T细胞白血病/淋巴瘤[欧洲专利公开525,960 A1]，眼部炎症[美国专利5,387,589]，恶性癌症[美国专利5,206,018]，心脏炎性疾病[美国专利5,496,832]，贫血[美国专利5,561,138]和增长性轴突赘疣[Parker，E.M.等，Neuropharmacology 39，1913-1919，2000]。
一种雷帕霉素酯，即与3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸形成的雷帕霉素42-酯[在美国专利5,362,718中公开]，亦称CCI-779，已被揭示在体内动物肿瘤模型和I期临床试验中具有针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。[Gibbons，J.，Proc.Am.Assoc.Can.Res.40：301(1999)；Geoerger，B.，Proc.Am.Assoc.Can.Res.40：603(1999)；Alexandre，J.，Proc.Am.Assoc.Can.Res.40：613(1999)；和Alexandre，J.，Clin.Cancer.Res.5(十一月增刊)：摘要7(1999)]。
【发明内容】
本发明提供如此处所述的非免疫抑制性雷帕霉素二醛化合物以及其使用方法。如此处定义，术语＂雷帕霉素二醛化合物＂意指一类包含基本雷帕霉素核的神经营养性化合物(如下所示)。这些化合物缺乏与完整雷帕霉素核相关联的免疫抑制性。本发明的雷帕霉素二醛化合物包括可能经化学或生物改性为雷帕霉素二醛核衍生物而同时仍保持神经营养性的化合物。因此，术语＂雷帕霉素二醛化合物＂包括雷帕霉素的酯、醚、肟、腙和羟胺，以及其中雷帕霉素二醛核上官能团已例如通过还原或氧化而被改性的雷帕霉素二醛化合物。术语＂雷帕霉素二醛化合物＂也包括雷帕霉素二醛化合物的可药用盐，其中所述的雷帕霉素二醛化合物因包含酸性结构部分或碱性结构部分而能够形成上述盐。
雷帕霉素二醛
优选的是由雷帕霉素二醛核42-和/或31-位羟基形成的雷帕霉素二醛的酯和醚，由27-位羟基(继27-酮化学还原之后)形成的雷帕霉素二醛的酯和醚，以及由雷帕霉素二醛核42-位酮(继42-羟基氧化之后)和27-酮形成的肟、腙和羟胺。
优选的用作相应雷帕霉素二醛化合物起始材料的雷帕霉素42-和/或31-酯和醚公开在如下专利中，全部这些文献特此通过引述并入本文：雷帕霉素的烷基酯(美国专利4,316,885)；氨烷基酯(美国专利4,650,803)；氟化酯(美国专利5,100,883)；酰胺酯(美国专利5,118,677)；氨基甲酸酯(美国专利5,118,678)；甲硅烷基醚(美国专利5,120,842)；氨基酯(美国专利5,130,307)；缩醛(美国专利5,51,413)；氨基二酯(美国专利5,162,333)；磺酸酯和硫酸酯(美国专利5,177,203)；酯(美国专利5,221,670)；烷氧基酯(美国专利5,233,036)；O-芳基、-烷基、-链烯基和-炔基醚(美国专利5,258,389)；碳酸酯(美国专利5,260,300)；芳基羰基和烷氧羰基氨基甲酸酯(美国专利5,262,423)；氨基甲酸酯(美国专利5,302,584)；羟基酯(美国专利5,362,718)；受阻酯(美国专利5,385,908)；杂环酯(美国专利5,385,909)；偕二取代酯(美国专利5,385,910)；氨基链烷酸酯(美国专利5,389,639)；磷酰基氨基甲酸酯(美国专利5,391,730)；氨基甲酸酯(美国专利5,411,967)；氨基甲酸酯(美国专利5,434,260)；脒基氨基甲酸酯(美国专利5,463,048)；氨基甲酸酯(美国专利5,480,988)；氨基甲酸酯(美国专利5,480,989)；氨基甲酸酯(美国专利5,489,680)；受阻N-氧化物酯(美国专利5,491,231)；生物素酯(美国专利5,504,091)；O-烷基醚(美国专利5,665,772)；和PEG酯(美国专利5,780,462)。这些酯和醚的制备方法在上列专利中公开。可以使用这些专利中所述地方法，从雷帕霉素起始，继之以本文所述开环反应，完成相应的雷帕霉素二醛酯和醚的制备。一种改进的雷帕霉素42-酯和醚合成方法在美国专利6,277,539中公开，该文献特此通过引述并入本文。
相应地，雷帕霉素二醛化合物的例子包括式(II)所示雷帕霉素二醛以及42-和/或31-酯和醚化合物：
其中，RA和RB各自选自氢和如上述任一美国/欧洲专利公开的酯或醚形成基团(例如，酰基和任选取代的烷基)。
优选的用作相应雷帕霉素二醛化合物起始材料的雷帕霉素27-酯和醚公开在美国专利5,256,790中，该文献特此通过引述并入本文。这些酯和醚的制备方法在上列专利中公开。可以使用这些专利中所述的方法，从雷帕霉素起始，继之以本文所述开环反应，完成相应的雷帕霉素二醛酯和醚的制备。相应地，雷帕霉素二醛27-酯和醚化合物的例子包括式(III)所示化合物：
其中RC是氢或如美国专利5,256,790中公开的酯或醚形成基团。
优选的雷帕霉素肟、腙和羟胺公开在美国专利5,373,014、5,378,836、5,023,263、5,023,264和5,563,145中，这些文献特此通过引述并入本文。这些用作相应雷帕霉素二醛化合物起始材料的肟、腙和羟胺的制备方法在上列专利中公开。可以使用这些专利中所述的方法，从雷帕霉素起始，继之以本文所述开环反应，完成相应的雷帕霉素二醛肟、腙和羟胺的制备。
特别优选的雷帕霉素二醛化合物包括雷帕霉素二醛，与3-羟基2-(羟甲基)-2-甲基丙酸形成的雷帕霉素二醛42-酯[见美国专利5,362,718和6,277,539，用3-羟基2-(羟甲基)-2-甲基丙酸制备雷帕霉素42-酯]，和42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素二醛[见美国专利5,665,772，制备42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素]。
适用时，若所述雷帕霉素化合物包含适宜的碱性结构部分，可药用盐可以由有机和无机酸如乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、苹果酸、苯二甲酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟脑磺酸以及同样已知可接受的助剂形成。若所述雷帕霉素化合物包含适宜的酸性结构部分，盐也可由有机和无机碱形成，如碱金属盐(例如，钠、锂或钾)，碱土金属盐，铵盐，含1-6个碳原子的烷基铵盐或在各烷基中含1-6个碳原子的二烷基铵盐，以及在各烷基中含1-6个碳原子的三烷基铵盐。
如根据本发明使用，有关提供本发明范围内化合物或物质的术语＂提供＂意指将这一化合物或物质直接给药，或以将会在机体内形成有效量的这一化合物或物质的前药、衍生物或类似物给药。
本发明的化合物可以由一种雷帕霉素利用可商购起始材料制得，或者由可按照文献方法制备的起始材料制得。所需的雷帕霉素二醛化合物可以经如下方式制备：在对反应进程进行监测的情况下，用氧化剂如OsO4/高碘酸钠或臭氧处理所述雷帕霉素化合物，直至形成所需的产品。
相应地，本发明提供一种如本文所述制备雷帕霉素二醛化合物的方法，包括如下步骤之一：
a)在非###中臭氧分解雷帕霉素化合物(例如，雷帕霉素、与3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸形成的雷帕霉素42-酯、或42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素)，以便生成雷帕霉素二醛化合物(例如，雷帕霉素二醛、与3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸形成的雷帕霉素二醛42-酯、或42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素二醛)；
或者
b)用酰化剂(例如，含上述RA或RB基团的酰化剂)酰化在活性取代基上任选被保护的雷帕霉素二醛，以便得到雷帕霉素二醛化合物，例如式(II)所示雷帕霉素二醛42-、31-或42，31-酯衍生物：
其中RA和RB各自是所选酯形成基团(例如，酰基)或者RA和RB之一是氢，然后去除任何保护基；
或者
c)用醚化剂(例如，含上述RA或RB基团的醚化剂)醚化在活性取代基上任选被保护的雷帕霉素二醛，以便得到雷帕霉素二醛化合物(例如，上式(II)所示雷帕霉素二醛42-、31-或42，31-醚衍生物，其中RA和RB各自是所选醚形成基团或者RA和RB之一是氢)，然后去除任何保护基。
在臭氧分解氧化过程中，除产生所述雷帕霉素二醛化合物之外，还生成相应雷帕霉素29-烯醇。雷帕霉素29-烯醇的结构如下。
雷帕霉素29-烯醇
此外，在雷帕霉素化合物臭氧分解过程中，生成具有如下结构的(2E，4S，6R)-6-[(5S，6R)-5-羟基-6-甲氧基-4-甲基-2，3，7-三氧杂双环[2.2.1]庚-1-基]-4-甲基庚-2-烯醛(实施例3)。
用标准药理学测试方法，通过评价本发明代表性化合物雷帕霉素二醛(实施例1)和雷帕霉素29-烯醇(实施例2)在体外抗SH-SY5Y细胞的活性，确证本发明化合物的神经再生活性[Gold等人，Exp Neurol147：269-278，1997]。简言之，将SH-SY5Y细胞置于已用阿非迪霉素处理的6孔板中5天，然后再经测试化合物处理。对照孔是未经处理的，或经单独的神经生长因子(NGF)处理。测试孔用NGF连同实施例1和实施例2或者雷帕霉素处理。在168小时，对细胞照相。使用与装有适宜软件(Bioquant IV，R&M Biometrics，Nashville，TN)的IBM XT计算机相连的Houston Instrument HI-PAD数字化标牌刻写板，在相片上分析轴突长度。使用ANOVA(STATVIEW，Abacus Concepts，Inc.，Berkeley，CA)比较轴索面积平均值。在下表中总结了所得结果。
表1. 168小时后的平均轴突长度 轴突长度(μm)未处理细胞 109.5±2.6a (n＝115)NGF 196.5±7.7* (n＝112)雷帕霉素+NGF 261.4±13.1** (n＝119)实施例1+NGF 229.8±9.5** (n＝141)实施例2+NGF 239.7±10.0** (n＝155)
a数值为平均值±SEM(以μm表示)。n，细胞数目。
*与未处理细胞相比，p＜0.05
**与NGF和未处理细胞相比，p＜0.05
标准药理学测试方法中得到的结果证明，本发明化合物可用作神经营养剂，特别可用于促进神经元再生和功能恢复，以及刺激轴突生长，由此可用于治疗多种神经病理状态，包括由如下因素引致的外周神经和中枢神经系统损伤：物理损伤(例如，脊髓损伤和创伤，坐骨神经或面神经损害或损伤)，疾病(例如，糖尿病性神经病)，癌症化疗(例如，通过长春花碱和阿霉素)，与中风相关的脑损伤和与中风相关的局部缺血，以及神经系统紊乱，包括但不限于，各种与神经变性有关的外周神经病理紊乱和神经系统紊乱，包括但不限于：三叉神经痛，舌咽神经痛，贝尔麻痹，重症肌无力，肌营养不良，肌萎缩性侧索硬化，进行性肌萎缩，进行性延髓遗传肌萎缩，突出、破裂或脱垂脊椎盘综合征，颈椎关节强直，丛病症，胸腔出口破坏综合征，外周神经病，例如由如下因素引起的外周神经病：铅，丙烯酰胺，γ-二酮(glue-sniffer氏神经病)，二硫化碳，氨苯砜，蜱，卟啉症，吉-巴综合征，痴呆，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，和亨廷顿氏舞蹈病。
通过评价本发明代表性化合物(实施例1-5)在体外针对六种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性，确证了本发明的抗肿瘤活性。简言之，将来自六种肿瘤细胞系的肿瘤细胞置于96孔微量滴定板的各孔中。使用了如下肿瘤细胞系：3T3(卵巢肿瘤)，3T3/H2N(对顺铂耐药的卵巢肿瘤)，A431(外阴表皮样瘤起源)，SW620(结肠肿瘤)，SKBR3(乳腺肿瘤)，和MDA-435(乳腺肿瘤)。在待评价化合物的系列稀释液存在下，使肿瘤细胞生长48小时，使用比色法(sulforhrodamine B)测定细胞生长。通过与加入测试化合物当时的细胞数目比较，计算生长抑制。结果以IC50(μg/ml)表示，在表2中列出。
表2.抗肿瘤活性(IC50，μg/ml)细胞系实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5 3T3 0.72＞5 4.11 1.5＞5 3T3/H2N 0.68＞5 ＞5 0.724.96 A431 0.91＞5 3.01 2.64＞5 SKBR3 0.52＞5 2.05 0.362.69 MDA435 1.23＞5 4.13 1.1＞5 SW620 1.41＞5 ＞5 3.04＞5
此标准药理学测试方法的结果证明本发明化合物可用作抗肿瘤药。本发明化合物特别可用于抗实体瘤，包括肉瘤和癌症在内；更特别可用于抗星形细胞瘤，前列腺癌，乳腺癌，结肠癌，小细胞肺癌，和卵巢癌；以及成人T细胞白血病/淋巴瘤。
本发明化合物还可用于治疗或抑制高增生性血管病如再狭窄。
当用于再狭窄时，优选将本发明化合物用于治疗继血管成形术后发生的再狭窄。当用于治疗这种继血管成形术后发生的再狭窄时，可在术前、术中、术后或者这些期间任意组合，给药本发明化合物。
应理解雷帕霉素二醛化合物的有效剂量可随具体使用的化合物、给药方式、条件、所治病症的严重程度、以及各种与所治个体相关的生理因素而改变。在根据本发明使用时，若所述雷帕霉素二醛化合物以活性化合物口服日剂量接近于0.1μg/kg-100mg/kg、优选0.001-25mg/kg、更优选0.01-5mg/kg的设计日剂量给药，则可得到满意的结果。应理解设计日剂量将随给药途径而改变。
当雷帕霉素二醛化合物用作组合方案的一部分时，在目标治疗期间给予该组合中的各组分。组合中各组分可以以含全部两个组分的整体剂型或作为单独的剂量单元同时给药；组合中各组分也可在治疗期间的不同时间给药，或其中之一可以以另一组分前处理形式给药。
可以以任何可用于将本文所述活性化合物导向接受者血流的方式给药，包括经口服、植入物、肠胃外(包括静脉内、腹膜内和皮下注射)、直肠、鼻内、阴道和透皮给药。为本发明公开目的，应理解透皮给药包括所有穿越体表和包括上皮和粘膜组织在内的机体通道的内层的给药。可使用本发明化合物或其可药用盐以洗剂、霜剂、泡沫剂、贴片剂、悬液剂、溶液剂和栓剂实现上述给药。
含本发明活性化合物的口服制剂可包括任何常规使用的口服形式，包括片剂，胶囊剂，颊的形成，圆锭剂，糖锭剂和口服液剂，悬液剂或溶液剂。胶囊剂可以包含活性化合物与惰性填料和/或稀释剂的混合物，所述惰性填料和/或稀释剂例如为可药用淀粉(例如，玉米淀粉、土豆淀粉或木薯淀粉)，糖，人工甜味剂，粉状纤维素比如结晶纤维素和微晶纤维素，面粉，白明胶，树胶等等。可用的片剂制剂可通过常规压缩、湿造粒或干造粒方法并利用如下成分制得：可药用的稀释剂，粘合剂，润滑剂，崩解剂，表面改性剂(包括表面活性剂在内)，悬浮剂或稳定剂，包括但不限于，硬脂酸镁，硬脂酸，滑石，十二烷基硫酸钠，微晶纤维素，羧甲基纤维素钙，聚乙烯吡咯烷酮，明胶，藻酸，阿拉伯树胶，黄原胶，柠檬酸钠，配合硅酸盐，碳酸钙，甘氨酸，糊精，蔗糖，山梨糖醇，磷酸二钙，硫酸钙，乳糖，高岭土，甘露醇，氯化钠，滑石，干淀粉和糖粉。优选的表面改性剂包括非离子型和阴离子型表面改性剂。代表性表面改性剂的例子包括，但不限于，泊洛沙姆188，烷基苄基二甲基氯化铵，硬脂酸钙，十六醇十八醇混合物，聚西托醇乳化蜡，脱水山梨糖醇酯，胶态二氧化硅，磷酸盐，十二烷基硫酸钠，硅酸镁铝，和三乙醇胺。更优选使用泊洛沙姆188作为表面改性剂。此处口服制剂可以采用标准的延迟或定时释放制剂，以改变活性化合物的吸收。优选的雷帕霉素口服制剂在美国专利5,559,121；5,536,729；5,989,591；和5,985,325中公开，这些文献特此通过引述并入本文。
有时，可能希望将所述化合物以气雾剂形式直接向呼吸道给药。
本发明化合物也可经肠胃外或经腹膜内给药。以游离碱和可药用盐形式存在的这些活性化合物的溶液或混悬液可在适当混有表面活性剂如羟丙基纤维素的水中制得。分散体也可在甘油、液态聚乙二醇及其在油中的混合物中制得。在普通保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂，以防止微生物生长。
适用于注射的药物形式包括无菌水溶液和分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且流动性必须达到易于注射的程度。它在制造和保存条件下必须稳定，必须作抗微生物如细菌和真菌污染防护。载体可以是含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、其适宜混合物以及植物油的溶剂或分散介质。优选用于雷帕霉素给药的肠胃外制剂在美国专利5,530,006；5,516,770；和5,616,588中公开，这些文献特此通过引述并入本文。
栓剂可由常规材料制备，包括可可脂，其添加有或未添加改变栓剂熔点的蜡，和甘油。也可使用水溶性栓剂基底，如不同分子量的聚乙二醇。
当将雷帕霉素二醛化合物用于治疗或抑制高增生性血管病如再狭窄时，优选经由已涂覆或渗透了所述雷帕霉素二醛化合物的血管支架或分流器提供雷帕霉素二醛化合物。
本发明代表性化合物的制备方法如下。
实施例1(方法A)
雷帕霉素二醛
使雷帕霉素(5.0g，5.5mmole)溶于100mL二噁烷和35mL水中。然后加入61mg OsO4，在室温下进行反应。搅拌30分钟后(溶液变为深绿色)，在30分钟内分批加入偏高碘酸钠(2.34g，10.9mmole)。将反应物搅拌过夜。用200mL CH2Cl2萃取反应混合物使反应终止，搜集得到5.1g粗品(总峰面积的66％为题述化合物，12％为未反应的雷帕霉素)。采用制备HPLC，在Prep Nova-pak HR Cl8柱(300×19mm)上经梯度法纯化组品，其中在梯度法中初始5分钟使用65％A和35％B，然后在30分钟内由65％A和35％B改为10％A和90％B。缓冲剂A为90％水和10％乙腈。缓冲剂B为10％水和90％乙腈。流速为20mL/分钟。收集20-21分钟时的级分，用二氯甲烷萃取。用无水硫酸钠干燥有机层。使用旋转蒸发系统去除有机溶剂。将残留物溶于3mL二氯甲烷，并加入15mL己烷进行沉淀。过滤后，将白色固体置于变速真空(speed-vac)中干燥过夜。如果产品纯度不够，在相同柱上使用51％B和49％A再次纯化。收集13分钟时的峰，重复上文所述搜集。得到白色固体。
测定化合物I，DMSO-d6，400MHz(13C：100MHz) C# δ13C 主峰 δ13C 副峰 δ1H 主峰δ1H副峰1H相关峰 HMBC 1 163.34 6.91 2，36 3，35，36，50 2 131.37 6.12 1，3 3，36 3 194.38 9.52 2 2 4 192.08 191.92 10.02 5 5 5 127.54 128.07 6.06 6.00 4 4，7，45 6 160.98 161.23 7 81.78 81.87 3.78 3.76 8 5 8 39.41 39.08 1.62；1.62 9 65.97 3.74 10 32.81 1.76(eq) 1.15(ax) 11 26.33 1.50 12 34.68 34.49 2.00 14 99.27 99.98 14(OH) 6.44 6.53 12，13，15 15 198.98 199.45 16 166.06 166.89 18 43.42 37.94 3.51(eq) 3.10(ax) 4.22(eq) 2.56(ax) 19 24.30 1.63(eq) 1.27(ax) 20 20.70 1.75 21 26.87 2.14(eq) 1.64(ax) 22 50.92 54.78 4.96 4.46 23 169.47 168.77 C# δ13C 主峰 δ13C 副峰 δ1H 主峰 δ1H副峰 1H相关峰 HMBC 25 74.10 5.17 26，37 26 39.95 2.72 2.67 27 208.15 208.37 28 45.51 3.45 29 126.06 5.21 28，48(w) 30 138.00 31 75.95 4.01 31-OH，32 31(OH) 5.26 31 30，32 32 86.04 3.78 33 212.53 34 40.05 2.80 35 37.63 2.56；1.22 36 33.85 2.55 37 32.55 1.83 38 38.08 1.16；1.02 39 32.42 1.32 40 35.24 35.20 1.94(eq) 0.62(ax) 41 83.77 2.83 42 73.06 3.19 42(OH) 4.53 43 32.81 1.74(eq) 1.22(ax) 44 30.92 1.59(eq) 0.88(ax) 45 11.82 2.06 46 15.61 0.69 47 15.70 1.00 48 11.38 1.70 49 15.29 0.95 50 19.76 1.06 51 15.06 0.80 52 55.93 3.11 53 57.55 3.19 54 56.57 3.30
使用负和正电雾化模式分别观测到如下伪分子离子：m/z 944的[M-H]-离子，和m/z 963的[M+NH4]+离子。
实施例1(方法B)
雷帕霉素二醛
使雷帕霉素(1.0g，1.09mmole)溶于250mL二氯甲烷中。将圆底烧瓶置于干冰浴中。使臭氧气体穿过上述溶液鼓泡6分钟(6L/分钟，控制钮设置在输出7)。然后，将反应混合物搅拌1小时。加入二甲硫(100μL)，将反应物再搅拌1小时。向反应混合物中加入200mL水使反应终止。搜集后得到约0.97g粗品(灰白色固体，总峰面积的44％为题述化合物)。LC/MS证实了主峰为题述化合物。
实施例2和3
雷帕霉素29-烯醇(实施例2)和(2E，4S，6R)-6-[(5S，6R)-5-羟基-6-甲氧基-4-甲基-2，3，7-三氧杂双环[2.2.1]庚-1-基]-4-甲基庚-2-烯醛(实施例3)
除用臭氧气体鼓泡50分钟外，采用与实施例1B相同的方法处理雷帕霉素(1.3g，1.40mmol)。搜集后得到约1.1g粗品(灰白色固体，总峰面积的44％为实施例2的二醛)。通过制备HPLC分离出两个主峰(9.5分钟和14分钟)。得到实施例2(14分钟)，为白色固体(50mg)；和实施例3(9.5分钟)，为无色油状物(23mg)。
测定实施例2，DMSO-d6，于30℃，400MHz(13C：100MHz) C# δ13C主峰 δ13C副峰 δ1H主峰 δ1H副峰 4 192.24 192.07 10.02 10.01 5 128.29 127.57 6.07 5.99 6 161.10 161.46 7 81.94 81.79 3.76 3.77 8 39.22 39.04 1.60；1.60 1.74；1.74 9 65.97 65.97 3.73 3.73 10 30.85 30.93* 1.27 1.27 11 227.23 27.23 1.45 1.50 12 34.82 34.66 2.09 2.01 14 99.34 99.04 14(OH) 6.56 6.48 15 199.18 199.59 16 166.12 166.85 18 43.54 37.90 3.44(eq) 3.13(ax) 4.16(eq) 2.60(ax) 19 24.17 24.51 1.55(eq) 1.34(ax) 1.59(eq) 1.21(ax) 20 21 26.49 26.32 2.12(eq) 1.58(ax) 2.08(eq) 1.56(ax) 22 51.00 55.93 4.92 4.44 23 169.61 168.82 25 75.56 75.33 5.29 5.22 C# δ13C主峰 δ13C副峰 δ1H主峰 δ1H副峰 26 35.94 36.74 2.87 2.66 2.76 2.76 27 196.03 196.03 28 115.12 114.96 29 157.38 157.16 7.83 7.78 29-OH 10.76 10.76 37 32.77 33.15 1.86 1.81 38 38.39 38.49 1.24 1.07 1.21 1.02 39 31.04 30.93* 1.33 1.30 40 35.49 34.49 1.96(eq) 0.64(ax) 1.94(eq) 0.61(ax) 41 83.87 83.87 2.83 2.81 42 75.56 75.33 3.18 3.12 42(OH) 4.60 4.44 43 32.99 32.99 1.76(eq) 1.17(ax) 1.55(eq) 1.34(ax) 44 30.63 30.52 1.60(eq) 0.88(ax) 1.60(eq) 0.88(ax) 45 11.51 12.04 2.05 2.06 46 15.40 15.50 0.68 0.73 47 7.73 7.76 1.55 1.55 51 15.03 15.36 0.90 0.85 52 55.99 56.11 3.10 3.11 54 56.59 56.62 3.31 3.31
观测到化合物II的如下伪分子离子：m/z 706的[M-H]-离子，和碎片离子424。
对于实施例3，1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ9.5(1H，-CHO)，6.8(1H，C＝CH)，6.1(1H，C＝CH)，5.07(1H，OH)，3.88，3.76，3.3(3H，-OCH3)，2.6，2.2，1.7，1.5，1.4，1.10.13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ194.7，163.5，131.6，112.0，110.4，81.1，73.9，59.0，35.6，28.0，20 3，14.0.
使用负和正电雾化模式分别观测到实施例3的如下伪分子离子：m/z301的[M-H]-离子，和m/z 320的[M+NH4]+离子。
实施例3即(2E，4S，6R)-6-[(5S，6R)-5-羟基-6-甲氧基-4-甲基-2，3，7-三氧杂双环[2.2.1]庚-1-基]-4-甲基庚-2-烯醛的化学结构
实施例4和5
42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素二醛(实施例4)和42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素29-烯醇(实施例5)
使42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素(10mg，0.01mmole)溶于10mL二氯甲烷中。将圆底烧瓶置于干冰浴中。使臭氧气体穿过上述溶液鼓泡1分钟(2L/分钟，控制钮设置在输出7)。然后，将反应混合物搅拌1小时。加入二甲硫(5μL)，将反应物再搅拌0.5小时。搜集后得到约9mg粗品。经制备HPLC处理后，得到0.5mg实施例4和0.24mg实施例5。
实施例4的阴离子模式显示m/z 988.6的[M-H]-离子。采用雷帕霉素和42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素作为内标物，测得所述非已知离子的精确质量为988.5612 Da，元素组成为C53H82NO16(理论质量为988.5634，Δ＝2.2mDa)。与42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素相比较，实施例4化合物多含两个氧原子。正电雾化模式显示m/z 1007.6的强[M+NH4]+离子，从而进一步确证了分子量。
实施例5显示出m/z 769.4的伪分子离子([M+NH4]+)。测得其精确质量为769.4487Da，元素组成为C39H65N2O13(理论质量为769.4487，Δ＝0.0mDa)。