两种温度敏感可逆溶解成相聚合物、 其制备方法及形成的 再生型两水相体系 技术领域 本发明涉及成相聚合物技术领域， 更具体地， 涉及温度敏感可逆溶解成相聚合物 技术领域， 特别是指两种温度敏感可逆溶解成相聚合物、 其制备方法及形成的再生型两水 相体系。
背景技术
两水相体系 (aqueous two-phase systems， 简称 ATPS) 是基于液 - 液萃取理论并 考虑保持生物活性而开发的一种新型液 - 液萃取分离技术， 该技术在生物化工分离领域有 极好的应用前景。与传统的有机溶剂萃取相比， 两水相萃取技术具有分离条件温和、 易操 作、 可调节因素多以及可借助传统溶剂萃取的成功经验等优点， 被认为是生物下游工程中 一种极有前途的初级分离单元操作， 具有非常广阔的工业应用前景。 然而， 由于现有的两水 相体系成相聚合物存在着难以回收的问题， 从而阻碍了两水相体系的应用。如何制备溶解 可逆的高聚物， 使其适用于两水相萃取或生物转化便成为两水相分离技术的关键。解决两 水相体系成相聚合物循环使用问题成为研究热点。
Josefine 和 Tjerneld 研究小组将 EO-PO( 是环氧乙烷 (EO) 和环氧丙烷 (PO) 的无 规共聚物 ) 两端用憎水基团 (C14H29) 修饰， 单独用这种修饰过的共聚物 (HM-EO-PO) 就可形 成水两相体系， 上相几乎含 100％水分， 下相含 5-7％的 HM-EO-PO。 并用该体系纯化溶菌酶、 牛血清蛋白及 Apolopoprotein-1， 通过控制 pH 或盐浓度来调节蛋白质的分配系数， 被分离 的蛋白相可用水反萃取， 而成相高聚物可通过温度诱导来回收。但这个体系属于表面活性 剂水胶束体系。该小组又将这种修饰的 HM-EO-PO 与 EO-PO 组成两水相体系， 则可使两种高 聚物均得到回收， 其中 EO-PO 在两相中的回收率是 73％， HM-EO-PO 的回收率是 97.5％。但 这样组成的两水相体系中有一个成相聚合物的回收率太低， 没有应用意义。 之后， 该小组又 合成了聚 (N- 异丙基丙烯酰胺 )(PNIPAM)、 聚乙烯己内酰胺 (poly-VCL) 以及 NIPAM 与带有 乙烯咪唑 (VI) 的 VCL 共聚物 (poly-NIPAM-VI)， 以期获得更理想的热促相分离两水相体系。 在其实验中， 用 poly-NIPAM-VI 与 HM-EO-PO 组成两水相时， 其回收率分别是 poly-NIPAM-VI 为 53％而 HM-EO-PO 为 92％。Poly-NIPAM-VI 的回收率较低是由于该聚合物具有高的浊点 和高的溶解度。
Berlo 等利用挥发性盐类进行相体系回收 (Mos V.B.， Karel C.A.M.L.， Lunk A.M.V.D.W.， J.Chromatogr.B.， 1998， 711 ： 61-68)。通过 CO2 和 NH3 在含蛋白质的 PEG 的水 溶液形成氨基甲酸铵 (NH4NH2CO2)， 达一定浓度时可形成两水相。 之后， 解除压力使 NH4NH2CO2 挥发分解并加以重新回收。但这种两水相体系在操作上并不方便， 且另一相高聚物仍无法 回收。
上述方法是解决聚合物的回收问题的各种尝试。 但均没有获得高回收率的溶解可 逆聚合物。因此， 研发高回收率 ( 大于 95％ ) 的两水相成相聚合物成为本领域亟待解决的 问题。发明内容 本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足， 提供两种温度敏感可逆溶解 成相聚合物、 其制备方法及形成的再生型两水相体系， 该两种成相聚合物温度敏感可逆溶 解， 由此形成的再生型两水相体系为温敏性， 两成相聚合物可以高效回收， 大大降低了使用 成本， 且回收简便， 适于大规模推广应用。
为了实现上述目的， 在本发明的第一方面， 提供了一种温度敏感可逆溶解成相聚 合物 I， 其特点是， 所述温度敏感可逆溶解成相聚合物 I 的分子量为 105 ～ 106， 由式 (1) 所示 化合物、 式 (2) 所示化合物和式 (3) 所示化合物经无规共聚而得到， 其中所述式 (1) 所示化 合物、 所述式 (2) 所示化合物和所述式 (3) 所示化合物的摩尔比为 90 ～ 80 ∶ 4 ～ 2 ∶ 1，
其中， R1、 R2 分别选自 H 或 C1 ～ C6 的烷基 ； R3 为 OH。
较佳地， 所述 R1、 所述 R2 分别选自 H 或 C1 ～ C3 的烷基。
更佳地， 所述 R1 为异丙基， 所述 R2 为亚甲基。
较佳地， 所述式 (1) 所示化合物、 所述式 (2) 所示化合物和所述式 (3) 所示化合物 的摩尔比为 90 ～ 80 ∶ 3 ∶ 1。
更佳地， 所述式 (1) 所示化合物、 所述式 (2) 所示化合物和所述式 (3) 所示化合物 的摩尔比为 84 ∶ 3 ∶ 1。
在本发明的第二方面， 提供了一种制备上述的温度敏感可逆溶解成相聚合物 I 的 方法， 其特点是， 将所述式 (1) 所示化合物、 所述式 (2) 所示化合物和所述式 (3) 所示化合 物按摩尔比 90 ～ 80 ∶ 4 ～ 2 ∶ 1 加入溶剂中， 以偶氮二异丁腈为引发剂， 在惰性气体存在 下， 于 50℃～ 70℃进行聚合反应得到。
较佳地， 所述溶剂为苯、 无水乙醚、 四氢呋喃或甲醇， 所述惰性气体为氮气。
较佳的， 所述式 (1) 所示化合物、 所述式 (2) 所示化合物和所述式 (3) 所示化合 物按摩尔比 84 ∶ 3 ∶ 1， 引发剂占三种化合物总质量 0.5％ -2％， 溶剂为三种单体总体积 10-40 倍， 聚合反应进行 12 ～ 24 小时。
反应结束后， 取出除去溶剂， 然后产物以少量丁酮溶解将溶液倾入搅拌的 15-20 倍的正己烷中， 将得到的聚合物于真空干燥箱中干燥至恒重， 得最终聚合物。所得固体物 即为本发明所说的一对可构成全回用两水相体系的成相聚合物中的一种， 简记为共聚物 PNBAa。共聚物 PNBAa 为一种温度敏感型共聚物， 即通过升高温度可将其从两水相体系中回收。
在本发明的第三方面， 提供了一种种温度敏感可逆溶解成相聚合物 II， 其特点是， 4 5 所述温度敏感可逆溶解成相聚合物 II 的分子量为 10 ～ 10 ， 由式 (4) 所示化合物、 式 (5) 所示化合物和式 (6) 所示化合物经无规共聚而得到， 其中所述式 (4) 所示化合物、 所述式 (5) 所示化合物和所述式 (6) 所示化合物的摩尔比为 15 ～ 20 ∶ 3 ～ 5 ∶ 4 ～ 2，
其中， R4、 R5 分别选自 H 或 C1 ～ C6 的烷基 ； R6 为 H 或 C1 ～ C4 的烷基。 较佳地， 所述 R4 为 H 或 C1 ～ C3 的烷基， R5 为 H 或 C1 ～ C3 的烷基， R6 为 C3 ～ C6 的烷基。 更佳地， 所述 R4 为甲基， 所述 R5 为乙基， 所述 R6 为二甲氨基。
较佳地， 所述式 (5) 所示化合物、 所述式 (6) 所示化合物和所述式 (7) 所示化合物 的摩尔比为 17 ∶ 4 ∶ 3。
在本发明的第四方面， 提供了一种制备上述的温度敏感可逆溶解成相聚合物 II 的方法， 其特点是， 将所述式 (4) 所示化合物、 所述式 (5) 所示化合物和所述式 (6) 所示化 合物按摩尔比 15 ～ 20 ∶ 3 ～ 5 ∶ 4 ～ 2 加入溶剂中， 以偶氮二异丁腈为引发剂， 在惰性气 体存在下， 于 50℃～ 70℃进行聚合反应得到。
较佳地， 所述溶剂为苯、 无水乙醚、 四氢呋喃或甲醇， 所述惰性气体为氮气。
较佳的， 所述式 (4) 所示化合物、 所述式 (5) 所示单体化合物和所述式 (6) 所示化 合物按摩尔比 17 ∶ 4 ∶ 3， 引发剂占三种单体总质量 0.5％ -2％， 溶剂为三种单体总体积 10-40 倍， 聚合反应进行 12 ～ 24 小时。
反应结束后， 将产物倾入 15-20 倍的石油醚中沉淀产物， 将得到的聚合物于真空 干燥箱中干燥至恒重， 得最终聚合物。所得固体物经干燥后即为本发明所说的一对可构成 全回用两水相体系的成相聚合物中的一种， 简记为共聚物 PNDB。共聚物 PNDB 为另外一种温度 敏感型共聚物， 即通过提高温度可将其从两水相体系中回收。
在本发明的第五方面， 提供了一种再生型两水相体系， 其特点是， 由上述的或上述 方法制备的温度敏感可逆溶解成相聚合物 I 和上述的或上述方法制备的温度敏感可逆溶 解成相聚合物 II 配制而成。
将上述的聚合物 PNBAa 或由上述方法制备的聚合物 PNBAa 与上述的聚合物 PNDB 或由 上述方法制备的聚合物 PNDB 在水或缓冲溶液中以一定的浓度配伍即可构成全回用两水相体 系， 即上述的再生型两水相体系。本发明设计并合成的可用于两水相分离系统的两种共聚 物， 均为温度敏感型共聚物， 30℃～ 50℃加以回收， 回收率均在 95％以上。
在本发明的第六方面， 提供了上述的再生型两水相体系在分离生物产品中的应 用。
在本发明中 ： 式 (1) 所示化合物和式 (4) 所示化合物是以丙烯酸为起始原料， 首先 经酰氯化试剂酰氯化获得丙烯酰氯， 然后再与相应胺反应后制得 ； 式 (5) 所示化合物是由 丙烯酸与相应的醇经酯化反应制得 ； 式 (2) 所示化合物、 式 (3) 所示化合物以及式 (6) 所示 化合物为市售品。
本发明的有益效果具体为 ： 本发明的设计并合成的可用于两水相分离系统的两种 共聚物 ： 聚合物 I 和聚合物 II， 均为温度敏感型共聚物， 温度敏感可逆溶解， 由此形成的再 生型两水相体系为温敏性， 两成相聚合物可以在 30℃～ 50℃高效回收， 回收率均高达 95％
以上， 因此可以通过提高温度回收两个成相聚合物， 大大降低了两水相体系分离生物产品 或进行相转移生物催化反应的使用成本， 回收操作简便， 适于大规模推广应用。 附图说明
图 1 是本发明的温度敏感可逆溶解成相聚合物 I 和温度敏感可逆溶解成相聚合物 II 构成水相的相图。
图 2 是本发明的温敏性两水相体系的一具体实施例的温度敏感可逆溶解成相聚 合物 I 和温度敏感可逆溶解成相聚合物 II 的五次回收率图。 具体实施方式
为更好的理解本发明的内容， 下面结合具体实施例作进一步说明。
实施例 1 温度敏感型共聚物 PNBAa 制备
将 3.0gN- 异丙基丙烯酰胺 (NIPA)( 根据上述方法自制 )、 0.12mL 甲基丙烯酸丁 酯 (BMA)( 上海凌峰化学试剂有限公司， AR)、 0.05mL 丙烯醇 (Aa)( 上海菲达工贸有限公司， AR) 加入具塞三角烧瓶中， 以 50mL 苯作为反应溶剂， 引发剂为 1.0％ mol 的偶氮二异丁腈 (AIBN)， 搅拌下使其充分溶解并充氮除氧 15min。 在 60℃， 120rpm 转速下密封反应容器水浴 振荡反应 24 小时。结束后除去溶剂， 然后以 20ml 丁酮溶解产物， 并按 1 ∶ 4 比例将产物溶 液倾入正己烷中。 所得产物经过重结晶处理后置于真空干燥箱中， 干燥至恒重， 得最终产物 4 聚合物， 由乌氏粘度计测得其粘均分子量为 3.49×10 。PNBAa 最低临界温度为 26.8℃。 实施例 2 温度敏感型共聚物 PNDB 制备
将 3.0gN- 异丙基丙烯酰胺 (NIPA)( 根据上述方法自制 )、 0.6mL 2- 甲基丙烯酸二 甲氨基乙酯 (DMAEMA 或者 DM)( 上海菲达工贸有限公司， AR)、 0.4mL 甲基丙烯酸丁酯 (BMA) 加入具塞三角烧瓶中， 溶剂为 50mL 四氢呋喃 (THF)， 引发剂为 1.0％ mol 的偶氮二异丁腈 (AIBN)， 搅拌下充分溶解并进行 15min 充氮除氧。在 60℃， 180rpm 转速下密封反应容器水 浴振荡反应 24 小时。以大量石油醚沉淀产物， 然后将产物置于真空干燥箱中， 室温下真空 干燥至恒重， 所得产物为最终聚合物， 由乌氏粘度计测得其粘均分子量为 2.60×104。 PNDB 最 低临界温度为 30.1℃。
实施例 3 温敏性再生型两水相体系的配制
将分别由实施例 1 和 2 制得的聚合物 PNBAa 与聚合物 PNDB 按图 1 所示的相图进行配 制， 聚合物 PNBAa 和聚合物 PNDB 在水中浓度达到图 1 中双结线以上时， 可形成两水相。两相中 两种聚合物的浓度可以通过排阻层析的方法测量得到。PNBAa-PNDB 的回收率可以通过热回收 的沉淀蒸干至恒重而得。通过上述方法计算得聚合物 PNBAa 的回收率可达 97％以上， 聚合物 PNDB 的回收率分别为 96.0％以上， 理论上可以循环使用至少 60 次。
实施例 4 温敏性再生型两水相体系的配制、 使用和回收
配 制 两 水 相 体 系， 上 相 为 1ml 10wt ％ 的 PNBAa( 由 实 施 例 1 制 得 )， 下 相 为 2ml 10wt％的 PNDB 分配溶质去甲基金霉素， 初始浓度为 1.0mg/mL， 混匀后低速离心以促进两相 形成， 分别吸出 1ml 下相溶液， 稀释至 10ml， 通过紫外分光光度法在 363nm 处测量上下相溶 液的吸光值， 通过去甲基金霉素的标准曲线， 计算出下相中去甲金霉素的浓度， 从而计算出 去甲基金霉素在两水相中的分配系数为 2.29。证明该聚合物应用于两水相萃取可以实行。
利用聚合物温度敏感的特性， PNBAa 最低临界温度为 26.8℃， 聚合物 PNDB 最低临界温 度为 30.1℃， 分别将聚合物进行溶解、 在高于临界温度 10℃时加热回收， 反复循环回收五 次， 五次回收率见图 2， 可以看出两种聚合物均能多次回收， 且回收率很高， 其中聚合物 PNBAa 的回收率明显优于聚合物 PNDB， 五次回收率均能保持在 97％以上， 聚合物 PNDB 前两次回收率 较低， 为 94.2％左右， 但是随着回收次数的增加， 回收率也显著增加， 达到 96％以上， 聚合 物 PNBAa 回收率随着回收次数的增加回收率也有所增加， 可能是由于多次回收对聚合物有提 纯的效果， 这也是该两水相系统的优势所在。
综上所述， 本发明的两种温度敏感可逆溶解成相聚合物均温度敏感可逆溶解， 由 此形成的再生型两水相体系为温敏性， 两成相聚合物可以高效回收， 大大降低了使用成本， 且回收简便， 适于大规模推广应用。
在此说明书中， 本发明已参照其特定的实施例作了描述。 但是， 很显然仍可以做出 各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此， 说明书和附图应被认为是说明性的 而非限制性的。