一种枯草芽孢杆菌及其在降解十溴联苯醚中的应用 技术领域 ：
本发明属于微生物应用领域， 具体涉及一种枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis DB-2) 及其在降解十溴联苯醚中的应用。 背景技术 ：
十溴联苯醚 (BDE2209 或 DeBDE) 是市场上需求量最大的一类多溴联苯醚， 作为一 种溴系阻燃剂 (brominated flame retardants， BFRs)， 广泛用作耐冲击性聚苯乙烯、 聚酯、 聚酰胺、 纺织品和电子产品的添加剂。 近年来， 十溴联苯醚的需求不断的增加， 据统计， 1999 年全世界对 BDE2209 的需求量占对多溴联苯醚总需求量的 81％， 2001 年为 83％。到 2001 5 年为止， 我国阻燃剂总产量约为 1.5×10 t， 而 BDE2209 的销售量已达 1.35×104t。全球自 然环境中十溴联苯醚含量呈显著增长态势。 溴代阻燃剂具有难溶于水， 长距离迁移能力， 难 以生物降解等理化特点。 多溴联苯醚同时具有明显的生物蓄积特性， 生理上表现出致癌性、 神经毒性、 内分泌干扰毒性、 免疫功能紊乱致使性等危害。十溴联苯醚排放到环境中后， 经 光解、 高温分解、 生物及微生物降解等过程， 会转化为多溴二苯并二噁英、 多溴二苯并呋喃 以及低溴代的联苯醚， 这些降解物更容易进入生物体， 也引起更强的毒性作用。 环境中存在 的十溴联苯醚已逐渐成为一种生态安全威胁。 因此， 必须发掘可以高效、 安全降解十溴联苯 醚的方法。
生物降解是利用自然界存在的微生物分解物质， 对环境不会造成负面影响。目前 报道的具有十溴联苯醚降解能力的菌株， 包括有 White rot fungi， Rhodococcus jostii RHA1 和 Burkholderia xenovorans LB400 等， 但是它们降解速率很低， 功能不强。因此， 发 掘可以高效、 安全降解十溴联苯醚的功能菌株具有重要的意义。
到目前为止， 没有报道枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 的具有降解十溴联苯 醚的能力。 发明内容 ：
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis DB-2) 以及其在降 解十溴联苯醚中的应用， 该枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis DB-2) 能够高效、 安全降解 十溴联苯醚， 不会产生多溴二苯并二噁英、 多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性 的二次污染物。
本发明的 Bacillus subtilis DB-2 是从广东汕头贵屿河床底泥分离、 纯化得到 的：
该菌的理化参数如下 ：
1、 菌体的形态特性 ：
a. 采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察， Bacillus subtilis DB-2 菌株为革兰氏阳性， 杆状， 单个菌体细胞 0.7 ～ 0.8×2 ～ 3 微米大小， 周生鞭毛， 能运 动。b. 在 LB 固体培养基平板上培养 24h 后， 菌落表面粗糙不透明， 污白色， 在液体培养 基中生长时， 常形成皱醭。需氧菌芽孢 0.6 ～ 0.9×1.0 ～ 1.5 微米， 椭圆到柱状， 位于菌体 中央或稍偏。
2、 Bacillus subtilis DB-2 主要的理化特性 ：
Bacillus subtilis DB-2 菌株的生长温度 15-40℃， pH 范围 4-9.5， 严格好氧生 长， 氧化酶阳性。
3、 Bacillus subtilis DB-2 主要的遗传特征 ：
对 Bacillus subtilis DB-2 的 16S rRNA 测 序， BLAST 比 对 发 现， 本发明的 Bacillus subtilisDB-2 的 16S rRNA 基因序列与 Bacillus subtilis 已有模式菌株具有较 高的相似性， 其中与 Bacillus subtilis DSM10 的序列相似性为 98.5％。
综合上述的生理生化特性、 16S rRNA 基因序列结果， 本发明的 Bacillus subtilis DB-2 应归属枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)， 命名为 Bacillus subtilis DB-2。
本发明人通过实验证实， 本发明的 Bacillus subtilis DB-2 具有十溴联苯醚脱溴 能力， 对十溴联苯醚具有较强的降解能力。
本发明的 Bacillus subtilis DB-2 菌株对十溴联苯醚具有较强的降解能力， 能对 十溴联苯醚脱溴， 而产生游离的溴离子。因此十溴联苯醚经过该菌生物降解处理后不会产 生多溴二苯并二噁英、 多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染物。所以 可以将该菌株用于环境中治理十溴联苯醚污染， 从而为化工污泥或废水中十溴联苯醚的处 理提供一种低成本、 高效率不发生二次污染的十溴联苯醚降解菌。 本发明的 Bacillus subtilis DB-2 于 2009 年 11 月 27 日， 保藏于中国典型培养 物保藏中心 (CCTCC， 地址 ： 中国武汉市武汉大学 )， 其保藏编号为 CCTCC NO ： M 209286。
具体实施方式 ：
一、 Bacillus subtilis DB-2 菌株的分离和鉴定
1、 Bacillus subtilis DB-2 菌株的分离 ：
培养基 ：
基础盐培养基： 每 升 培 养 基 中 含 有 KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl1.0g， NaCl0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O0.15g， 微量元素盐溶液 2mL， 余量为水。
微量元素盐溶液： 每 升 微 量 元 素 盐 溶 液 中 含 有 Na2MoO430mg， ZnCl250mg， CuCl2·2H2O10mg， H3BO331mg， MnCl2·5H2O30mg， NiCl2·6H2O20mg， CoCl2·6H2O36mg， 余量为 水。
本发明的 Bacillus subtilis DB-2 菌株是从广东汕头贵屿河床底泥经过分离、 纯 化而得。
其分离纯化方法如下 ：
取 1g 河床底泥放在 100ml 添加有十溴联苯醚 2.0mg/L， 乳酸钠 1.0g/L， 酵母抽提 物 0.1g/L 的基础盐培养基中富集培养。富集培养过程通过离子色谱监测培养液中溴离子 的浓度变化指示富集效果， 富集培养是先在 30℃， 避光静置培养 14 天， 监测出明显的溴离 子释放， 然后转接到含有十溴联苯醚 2.0mg/L， 乳酸钠 2.0g/L， 酵母抽提物 0.1g/L 的基础盐 培养基里继续在 30℃， 避光静置培养 14 天。然后从上步富集培养的培养液里取混合菌群液涂布到添加含有乳酸钠 2.0g/L 固体基础盐培养基 ( 含有 20g/L 琼脂 ) 中 30℃温箱进行 培养， 从中挑取优势单菌落进行脱溴降解筛选， 纯化， 最后获得 Bacillus subtilis DB-2 菌 株。
2、 Bacillus subtilis DB-2 菌株特征 ：
(1) 菌体的形态特性 ：
a. 采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察， Bacillus subtilis DB-2 菌株为革兰氏阳性， 杆状， 单个菌体细胞 0.7 ～ 0.8×2 ～ 3 微米大小， 周生鞭毛， 能运 动。
b. 在 LB 固体培养基平板上培养 24h 后， 菌落表面粗糙不透明， 污白色， 在液体培养 基中生长时， 常形成皱醭。需氧菌芽孢 0.6 ～ 0.9×1.0 ～ 1.5 微米， 椭圆到柱状， 位于菌体 中央或稍偏。
(2)Bacillus subtilis DB-2 主要的理化特性 ：
Bacillus subtilis DB-2 菌株的生长温度 15-40℃， pH 范围 4-9.5， 严格好氧生 长， 氧化酶阳性。
(3)Bacillus subtilis DB-2 主要的遗传特征 ：
具体方法参考分子克隆实验指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001) 中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的 Bacillus subtilis DB-2 分子分类地位 ：
采用 DNA 小量提取方法提取 Bacillus subtilis DB-2 细菌总 DNA， 采用 16S rRNA 通用引物 27F 和 1522r 扩增其 16S rRNA 基因， 将 PCR 产物直接测序， 其序列如 SEQ ID NO.1 所示， 将该序列输入 GenBank， 通过 BLAST 程序与数据库中的所有序列进行比对分析， 结果 发现本发明 Bacillus subtilis DB-2 的 16S rRNA 基因序列与 Bacillus subtilis 已有模 式菌株具有较高的相似性， 其中与 Bacillus subtilis DSM10 的序列相似性为 98.5％。
综 合 上 述 的 生 理 生 化 特 性、 16S rRNA 基 因 序 列 比 对 结 果， 本 发 明 Bacillus subtilis DB-2 应归属枯草芽孢杆菌属 (Bacillus subtilis)， 命名为 Bacillus subtilis DB-2。
本发明的 Bacillus subtilis DB-2 于 2009 年 11 月 27 日， 保藏于中国典型培养 物保藏中心 (CCTCC， 地址 ： 中国武汉市武汉大学 )， 其保藏编号为 CCTCC NO ： M 209286。
二、
实施例一 ：
Bacillus subtilis DB-2 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解试验 ：
降解基础培养基配方 ： 每 升 培 养 基 中 含 有 蛋 白 胨 1g， 酵 母 抽 提 物 0.5g， KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl1.0g， NaCl0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O0.15g， 余量为水。
1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
在 100ml 三角瓶中添加 300mg/L 用二氯甲烷溶解的十溴联苯醚储存液 1ml， 避光待 二氯甲烷挥发， 然后在三角瓶中添加 30ml 降解基础培养基， 摇匀后得到 30ml 降解实验培养 基。
即降解实验培养基的配方 ： 每升培养基中含有十溴联苯醚 10mg， 蛋白胨 1g， 酵母 抽提物 0.5g， KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl1.0g， NaCl0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O0.15g，余量为水。
2、 将本发明的 Bacillus subtilis DB-2 纯菌划 LB 板培养， 然后从固体 LB 平板上 挑取单菌落接种到 30ml 降解实验培养基中， 30℃， 150 转 / 分避光培养， 培养 48h 后， 取培养 液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 溴离子测定标准曲线的绘制及测定 ：
用 18.2mΩ 的 mini-Q 无菌水分别配制 0.00、 100、 250、 500、 750、 1000μg/L 溴化 钠标准梯度溶液， 用戴安 ICS-1500 型离子色谱进行色谱分析， 分析柱 AS19， 分析样品量 50μL， 分析时间 30min， 具体数据如表 1 所示 ：
表1
溴化钠标准溶液浓度 测定溴离子浓度
0.00 0.000100 98.68250 252.45500 499.82750 747.761000 1001.291500 1498.65由此得出标准曲线方程 ： y ＝ 0.0027x-0.0027。R2 ＝ 1.0， x 为溴离子浓度 ( 单位 μg/L)， y 为溴离子积峰面积 (μS*min)。4、 Bacillus subtilis DB-2 降解率的测定 ：
从三个平行样品中分别取 2mL 经过 48h 上述培养的培养液， 用 0.22μm 的无菌滤 膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后进行戴安 离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。按上述标准曲线方程计算， 可得 48h 后 Bacillus subtilis DB-2 培养液中溴离子浓度分别为 733.0μg/L， 487.8μg/L， 636.4μg/L， 平均值 为 619.0μg/L。
实施例二 ：
Bacillus subtilis DB-2 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解试验 ：
1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。
2、 将本发明的 Bacillus subtilis DB-2 纯菌划 LB 板培养， 然后从固体 LB 平板挑 取单菌落接种至 30ml 降解实验培养基中， 于 30℃， 150 转 / 分避光培养， 培养 60h 后， 取培 养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 Bacillus subtilis DB-2 降解率的测定 ：
从三个平行样品中分别取 2mL 经过 60h 上述培养的培养液， 用 0.22μm 的无菌 滤膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后进 行戴安离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。根据实施例一的标准曲线方程计算， 可得 60h 后 Bacillus subtilisDB-2 培养液中溴离子浓度分别为 1236.4μg/L， 1050.2μg/L， 1015.4μg/L， 平均值为 1100.7μg/L。
实施例三 ：
Bacillus subtilis DB-2 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解试验 ：
1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。2、 将本发明的 Bacillus subtilis DB-2 纯菌划 LB 板常规培养， 然后从固体 LB 平 板上挑取单菌接种至 30ml 降解实验培养基中， 30℃， 150 转 / 分避光培养 72h 后， 取培养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 Bacillus subtilis DB-2 降解率的测定 ：
从三个平行样品中分别取 2mL 经过 72h 上述培养的培养液， 用 0.22μm 的无菌滤 膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后进行戴安 离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。 按实施例一的标准曲线方程计算， 可得 72h Bacillus subtilis DB-2 培养液中溴离子浓度分别为 1381.2μg/L， 1199.2μg/L， 1098.5μg/L， 平均 值为 1226.3μg/L
序列表
<110> 广东省微生物研究所
<120> 一种枯草芽孢杆菌及其在降解十溴联苯醚中的应用
<160>1
<210>1
<211>1448
<212>DNA <213> 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis DB-2) <400>1 gtgcaggatg ctatacatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60 cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120 accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc 180 ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240 aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360 agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420 caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540 aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600 gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660 tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720 gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780 gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840 taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960 ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg 1020 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080 acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 1140 ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200 tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc 1260tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat 1320 cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380 cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaac 1440 gtgatcac 14488