发明内容
本发明的目的是提供5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮晶型。
本发明的另一个目的是提供5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮晶型的制备方法。
本发明还有一个目的是5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮晶型在制备治疗肿瘤药物中的应用。
发明人在研究5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮(式I或式II)精制方法及结晶条件时发现其至少有两种5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的晶型，一是5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的P晶型(以下称P晶型)，另一为5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的L晶型(以下称L晶型)。
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式I. 式II.
P晶型的粉末X射线衍射图谱中衍射峰的晶面间距d值及相对强度(I/I0)见表1；
表1.P晶型X射线粉末衍射数据
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其红外光谱中包含的吸收峰为2802(br)，1869，1812，1617(br)，1433，1374，1260，1221，676和628cm-1；差示扫描量热分析中的吸热峰为277.9℃。
更进一步，该P晶型的粉末X射线衍射图谱中衍射峰的晶面间距d值及相对强度(I/I0)见表2；红外光谱中包含的吸收峰为2802(3268～2100，br)，1869，1812，1648，1617(br)，1489，1456，1433，1374，1260，1221，1091，986，970，917，860，839，789，676，628和534cm-1；差示扫描量热分析中的吸热峰为277.9℃。
表2.P晶型X射线粉末衍射数据
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L晶型粉末X射线衍射图谱中衍射峰的晶面间距d值及相对强度(I/I0)见表3；
表3.L晶型X射线粉末衍射数据
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更进一步，该L晶型粉末X射线衍射图谱中衍射峰的晶面间距d值及相对强度(I/I0)见表4；红外光谱中包含的吸收峰为3095，2990，2826，2537，1676，1618，1494，1449，1421，1342，1317，1277，1219，1199，1094，857，823，813，786，681，534和438cm-1；差示扫描量热分析中的吸热峰为280.6℃。
表4.L晶型X射线粉来衍射数据
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上述粉末X-射线衍射测试条件为：
仪器型号：ARL X′TRA型转靶X-射线衍射仪
测试条件：管压：30KV；管流：50mA；靶型：Cu
扫描速度：10°/min；扫描起始角3°，扫描终止角50°；
步进间隔：0.02°
红外光谱的测试条件：
仪器型号：VECTOR 22型红外光谱仪
测试条件：KBr压片法
差示扫描量热分析的测试条件：
仪器型号：Perkin ElmerPyris 1DSC型
测试条件：升温速度10℃/min；温度范围50-300℃
发明人通过“碱溶-酸析”结晶法制备P晶型，该制备方法包括以下步骤：
i)将5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮溶解于碱性溶液中；
ii)维持混合溶液在10～12℃，加入酸性溶液中和，调节溶液pH至4.0～4.5；
iii)溶液于18～20℃放置10～12h，析晶；
iv)从该pH＝4.0～4.5溶液中分离结晶即得到5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的P晶型。
所述的制备方法中碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液中的一种或多种；优选浓度为10％氢氧化钠溶液；酸性溶液可以是盐酸溶液、硫酸溶液；优选浓度为5％盐酸溶液、浓度为5％硫酸溶液；
本发明通过使用有机溶剂重结晶，控制在一定温度条件和操作程序下析晶，可得到5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的L晶型，有机溶剂可以是甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种，优选甲醇或乙醇。析晶条件优选：先室温放置8h，后移入冰箱0～4℃放置48h析晶。
一种药物组合物，其含有替加氟、5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的P晶型(或L晶型)、氧嗪酸钾以及与药学可接受的载体。
所述的药物组合物中，替加氟、5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的P晶型(或L晶型)、氧嗪酸钾的摩尔比是1∶0.4∶1。
所述的药物组合物，其剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口崩片、散剂、丸剂、混悬剂；优选为片剂、胶囊。
所述的药物组合物，可作为治疗胃癌、头颈部癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等癌症的药物。
所述的5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型或L晶型在制备治疗癌症药物中的应用。
所述的应用是5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型或L晶型在制备的治疗癌症药物中作为二氢嘧啶脱氢酶抑制剂。这些癌症包括胃癌、头颈部癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌或非小细胞肺癌。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的P晶型和L晶型具有良好的热力学稳定性
(1)P晶型(见图9)和L晶型(见图10)的热重分析(TGA)分析结果表明，在30～200℃范围，图谱近乎呈水平直线，几乎无变化，无失重。P晶型和L晶型在30～200℃范围内稳定。
(2)P晶型和L晶型分别研磨30min，红外光谱检测图谱皆无明显变化。
(3)P晶型和L晶型在105℃加热4h，外观几乎没有任何变化，含量不降低，杂质未见增加。
具体试验方法：将5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型、L晶型(分别按本发明实施例1、2制备)在105℃加热4h，以高效液相色谱法(HPLC)测定其加热前后的含量及杂质变化，观察P晶型、L晶型的热力学稳定性。表5及图11为P晶型加热前的高效液相色谱图及相应数据；表6及图12为L晶型加热前的高效液相色谱图及相应数据；表7及图13为P晶型加热后的高效液相色谱图及相应数据；表8及图14为L晶型加热后的高效液相色谱图及相应数据。
表5.P晶型(加热前)高效液相色谱图(HPLC)数
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表6.L晶型(加热前)高效液相色谱图(HPLC)数据
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表7.P晶型(加热105℃，4h后)高效液相色谱图(HPLC)数据
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表8.L晶型(加热105℃，4h后)高效液相色谱图(HPLC)数据
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结果显示，受热前后的P晶型、L晶型几乎没有任何变化，含量不降低，杂质未见增加。结论：P晶型、L晶型的热力学性质是稳定的。
2、本发明提供的P晶型或L晶型与替加氟、氧嗪酸钾及适当的药用赋形剂制成药用组合物(如胶囊)，P晶型、L晶型皆具有良好的溶出行为(20min溶出度皆≥92％)
具体试验方法：
(1)仪器与试验药品
Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AG285型电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；ZRS-4型智能溶出度试验仪(天津大学无线电厂)。5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型对照品(发明人依据实施例1方法制备，批号：040517，含量为99.6％)；L晶型对照品(发明人依据实施例2方法制备，批号：040525，含量为99.8％)；乳糖(上海华茂乳制品有限公司，批号：050311)；十二烷基硫酸钠(上海运宏化工有限公司，批号：050421)；硬脂酸镁(山东聊城制药厂，批号：050408)。
(2)胶囊的制备
称取替加氟2.00g、5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型(或L晶型)0.58g、氧嗪酸钾1.96g、乳糖6.00g、十二烷基硫酸钠0.40g，过80目筛混合均匀，用1％羟丙甲基纤维素水溶液适量制成软材，24目筛制粒，60℃通风干燥，20目筛整粒，加入硬脂酸镁0.15g，充分混匀，即得颗粒，化验并确定装量，灌装制得含替加氟、5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型(或L晶型)及氧嗪酸钾3种药物的复方胶囊100粒。
(3)溶出度测定方法
取上述胶囊，照溶出度测定法[2005年版中国药典二部附录XC第一法]操作，以水1000ml为溶出介质，转速为100r/min，依法测定，45分钟后取溶液适量，过滤，取续滤液作为供试品溶液；另取5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型(或L晶型)对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成1ml中约含5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮6μg的溶液，作为对照品溶液。照HPLC含量测定法，计算出每粒胶囊中5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的溶出量。
(4)溶出度测定结果
分别取用不同晶型5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮制备的胶囊(批号040706-1，含P晶型；040706-2，含L晶型)，照溶出度测定方法，分别在5、10、20、30、45、60分钟取样测定溶出量。两批胶囊样品中不同晶型5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的溶出结果见表9，溶出曲线见图15。
表9.胶囊制剂中不同晶型5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮的溶出曲线测定结果
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(5)结论
用不同晶型5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮制备的复方胶囊制剂，在20min内5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮在水中的溶出度皆可以达到97.0％以上，均具有良好的溶出行为；5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型和L晶型在相同时间内溶出量无明显差异。
3、本发明提供的P晶型和L晶型在大鼠体内灌胃动力学及其药代动力学参数
大鼠灌胃(i.g)分别给药5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型和L晶型10mg/kg后，测得的半衰期分别为2.15±0.40和1.88±0.13h，AUC0→8分别为4.30±0.51和4.11±0.60μg.h/ml。给药峰浓度分别为1.77±0.23和1.63±0.22μg/ml，给药达峰时间分别为0.86±0.13和0.88±0.14μg/m。
具体试验方法：
1)仪器、试验药品及实验动物
仪器岛津LC-10Avp高效液相色谱仪，LC-10ADvp泵，CTO-10Avp柱温箱，RF-10AXL荧光检测器，HW-2000色谱工作站；Thermo IEC高速离心机(Micromax RF)；Eppendorf 5432旋涡混合器(Netheler+HinzGmbH)。
动物SD大鼠，体重190～220g，雄性。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(沪)2003-0002。
试剂甲醇(色谱纯)为Fisher Scientific公司产品；高氯酸为上海金鹿化工有限公司产品；其余试剂均为市售分析纯。
试验药品5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型(批号CD040608P)和L晶型(批号CD040608L)，江苏省药物研究所提供。灌胃用药物按1ml/100g大鼠体重的容量折算给药体积，用0.5％CMC-Na制成混悬液。
2)动物实验分组及过程
取大鼠14只，体重202.7±5.6g。随机分成2组，每组7只。禁食但可自由饮水10小时后，分别ig 10mg/kg P晶型或L晶型。于给药后0.083、0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、6和8h，眼眶静脉取血0.25ml于肝素化试管中，离心，取血浆90μl用于HPLC-紫外分析。每次取血后，补充等量的生理盐水。
3)结果
(1)血药浓度大鼠i.g 10mg/kg P晶型或L晶型后测得血药浓度-时间数据分别列于表10、表11和图16。
表10.大鼠i.g 10mg/kg P晶型(CD040608P)后血浆中药物浓度(μg/ml)
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表11.大鼠i.g 10mg/kg L晶型(CD040608L)后血浆中药物浓度(μg/ml)
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(2)药代动力学参数由表10、11可见，在给药后8h血药浓度达到峰浓度的1/10-1/20，用0-8h数据按统计矩方法求算相应的药代动力学参数，结果见表12、13，Cmax，Tmax为实测值。
表12.大鼠i.g 10mg/kg P晶型(CD040608P)后药代动力学参数
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表13.大鼠i.g 10mg/kg L晶型(CD040608L)后药代动力学参数
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表14.大鼠i.g 10mg/kg P晶型和L晶型后药代动力学参数比较
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由表14可见，大鼠i.g 10mg/kg 5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮两种晶型(CD040608P、CD040608L)后，估算的半衰期分别为2.15±0.40和1.88±0.13h，AUC0→8分别为4.30±0.51和4.11±0.60μg.h/ml。实测得给药峰浓度分别为1.77±0.23和1.63±0.22μg/ml，实测得给药达峰时间分别为0.86±0.13和0.88±0.14μg/ml，经统计学检验，大鼠灌胃种晶型的5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮后，5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮吸收动力学参数无显著差异(p＞0.05)，提示5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮两种晶型在大鼠体内药代动力学行为是相似的。
附图说明
图1是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型X射线粉末衍射图。
图2是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型X射线粉末衍射数据。
图3是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮L晶型X射线粉末衍射图。
图4是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮L晶型X射线粉末衍射数据。
图5是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型红外光谱图。
图6是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮L晶型红外光谱图。
图7是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型差示扫描量热分析图。
图8是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮L晶型差示扫描量热分析图。
图9是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型热重分析图。
图10是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮L晶型热重分析图。
图11是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型(加热前)高效液相色谱图(HPLC)。
图12是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮L晶型(加热前)高效液相色谱图(HPLC)。
图13是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型(加热105℃，4h后)高效液相色谱图(HPLC)。
图14是本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮L晶型(加热105℃，4h后)高效液相色谱图(HPLC)。
图15是复方胶囊中本发明5-氯-4-羟基-2(1H)-吡啶酮P晶型和L晶型的溶出曲线。
图16是大鼠i.g 10mg/kg P晶型(CD040608P)或L晶型(CD040608L)血浆中药物浓度-时间曲线(Mean±SD)。