7,2"- 脱水葛根素及其盐类衍生物以及其制备方法与应用 技术领域 本发明涉及葛根素衍生物及其制备方法与应用， 尤其涉及 7， 2″ - 脱水葛根素及 其盐类衍生物及其制备方法与应用， 属于医药技术领域。
背景技术 葛根素是从豆科植物野葛、 甘葛藤根中提取的一种异黄酮苷， 研究发现其具 有 清 除 自 由 基 (J.Agric.Food Chem.2002， 50， 7504-7509.)、 降 低 血 清 胆 固 醇 (J.Nat. Prod.2003， 66， 788-792.)、抗 凝 血 以 及 抗 变 态 反 应 (Biol.Pharm.Bull.2002， 25， 1328-1332.) 等活性， 临床上用于治疗冠心病 ( 中国中西医结合杂志 2003， 23， 895-897.)、 心绞痛 ( 中国中西医结合杂志 1998， 18， 282-284.)、 心肌梗死 (Chinese Med.J.1992， 105， 11-17.)、 突发性耳聋 ( 第一军医大学学报 2002， 22， 1044-1045) 以及酒精中毒 (Pharmacol. Biochem.Behav.2003， 75， 593-606 ； Alcohol Clin.Exp.Res.2003， 27， 177-185.) 等。
正因为葛根素具有上述多种药理活性， 引起人们对葛根素及其衍生物的广泛关 注。但是葛根素口服吸收生物利用度较差， 使口服剂型的应用受到限制， 临床主要是用葛 根素的注射液剂型， 为方便应用， 需要改善葛根素溶解性和生物利用度。目前相关文献报 道主要在于进行结构修饰或采用特殊剂型。杨若林等曾对葛根素进行了一系列甲基、 甲 氧基、 异丙基、 苯甲酰基、 三苯甲基等衍生化， 进行兔眼血流量试验表明所得结构修饰后的 化合物中乙酰化和三苯甲基化衍生物可显著增加血流量 ( 中国药科大学学报 1999， 30， 81-85.)。 Dan Li 等利用酶法对葛根素进行了多种糖基化反应， 其衍生物水溶性得到明显改 善 (Carbohydr.Res.2004， 339， 2789-2797.)。娄红祥等对葛根素进行了一系列乙酰水杨酰 基衍生化， 抑制血小板凝集活性实验表明， 7- 乙酰水杨酰基葛根素对人体外血小板聚集反 应具有非常显著的剂量依赖性的抑制作用 (IC50 ＝ 0.91mmol.L-1)， 且抑制作用显著地强于 单用相当量的阿司匹林和葛根素 (CN200410036070.9)。
据文献报道， 许多黄酮碳苷类化合物的酚羟基可与其糖基部分的羟基发生分子内 脱水反应生成具有较强的生物学活性的脱水衍生物 (Tetrahedron 2004， 60， 9357-9379 ； Bioorg.Med.Chem.Lett.2004， 14， 3201-3203 ； Org.Lett.2009， 11， 2233-2236.)。 但是， 经检 索， 目前尚未发现有 7， 2″ - 脱水葛根素衍生物的报道。
葛根素为异黄酮碳苷， 4 ′位显弱酸的羟基为其活性基团， 且由于异黄酮母核为 平面结构， 因此我们选择了可改变葛根素空间结构的 8 位吡喃葡萄糖基团进行结构改 造， 将 2 ″位羟基与 7 位羟基发生分子内 Mitsunobu 反应， 合成 7， 2 ″ - 脱水葛根素 (7， 2″ -dehydrate puerarin)。
发明内容
针对上述现有技术， 本发明要解决的技术问题之一是针对葛根素口服吸收生物利 用度较差、 临床只有注射剂应用的现状， 提供一种葛根素结构修饰衍生物—— 7， 2″ - 脱水 葛根素及其盐类衍生物及其制备方法 ； 本发明要解决的技术问题之二是提供 7， 2″ - 脱水葛根素及其盐类衍生物在制备治疗或 / 和预防心脑血管疾病的药物中的应用， 包括心律失 常、 冠心病、 心绞痛、 心肌梗死、 脑梗死等心脑血管疾病。
本发明是通过以下技术方案实现的 ：
本发明的 7， 2″ - 脱水葛根素结构式如下式 (I) ：
其中， R 为 H。
本 发 明 的 7， 2 ″ - 脱 水 葛 根 素 盐 类 衍 生 物， 是 指 7， 2″ - 脱水葛根素的 4′ 位 羟 基 与 各 种 有 机、 无 机 碱 反 应 生 成 的 盐 类 衍 生 物， 比 如， 反 应 后， R 可 以 为 Na+、 K+、
等离子中的任一种。 本发明的 7， 2″ - 脱水葛根素的制备方法为 ： 将葛根素与 PY3 以及偶氮类化合物按 摩尔比 1 ∶ (1 ～ 4) ∶ (1 ～ 4) 混合， 在有机溶剂中， 发生分子内 Mitsunobu 反应， 制得式 I 化合物， 常规过滤、 浓缩、 硅胶柱层析， 将得到的 7， 2″ - 脱水葛根素分离纯化 ； 其合成反应 示意如下 ：
所述 PY3 中 Y 基团为芳基、 烷基、 杂芳基或烷氧基中的任一种。
所述偶氮类化合物为偶氮二甲酸二异丙酯 (DIAD)、 偶氮二甲酸二乙酯 (DEAD)、 N， N， N′， N′ - 四甲基偶氮二甲酰胺 (TMAD) 或偶氮二甲酰二哌啶 (ADDP) 中的任一种。
所述有机溶剂为四氢呋喃、 二噁烷、 二氯甲烷、 氯仿、 二甲基甲酰胺、 甲苯、 苯或六 甲基磷酰三胺中的任一种。
本发明的的 7， 2″ - 脱水葛根素中 4′位显弱酸的羟基可与各种有机、 无机强碱反 应， 生成 7， 2″ - 脱水葛根素的盐类衍生物， 以增加水溶性和稳定性， 改善其药代动力学参 数。
本发明的的 7， 2″ - 脱水葛根素及其盐类衍生物在制备治疗或 / 和预防心脑血管 疾病的药物中的应用， 包括心律失常、 冠心病、 心绞痛、 心肌梗死、 脑梗死等心脑血管疾病。
用本发明的 7， 2″ - 脱水葛根素及其盐类衍生物可制成任何一种药剂学上所述的 剂型的药物， 在所述的剂型中优选口服制剂或注射剂。
根据文献报道， 许多黄酮碳苷类化合物的酚羟基可与其糖基部分的羟基发生分子 内脱水反应生成具有较强的生物学活性的脱水衍生物 (Tetrahedron 2004， 60， 9357-9379 ； Bioorg.Med.Chem.Lett.2004， 14， 3201-3203 ； Org.Lett.2009， 11， 2233-2236.)。葛根素为 异黄酮碳苷， 4′位显弱酸的羟基为其活性基团， 且由于异黄酮母核为平面结构， 因此发明 人选择了可改变葛根素空间结构的 8 位吡喃葡萄糖基团进行结构改造， 将 2″位羟基与 7 位 羟基发生分子内 Mitsunobu 反应， 合成 7， 2″ - 脱水葛根素。
本发明的 7， 2″ - 脱水葛根素衍生物与葛根素一样， 对心律失常、 冠心病、 心绞痛、 心肌梗死、 脑梗死等多种心脑血管疾病具有良好的预防与治疗作用， 且经实验证明， 其部分 活性明显强于葛根素。本发明的 7， 2″ - 脱水葛根素衍生物改变了葛根素本身的极性和空 间结构， 以影响化合物的水溶性， 改善药物的细胞膜通透功能， 增强在胃肠道中的吸收， 提 高葛根素的口服生物利用度， 克服了目前临床上葛根素口服吸收生物利用度较差的缺陷， 在制备心脑血管疾病治疗与预防药物方面应具有良好的应用前景。 附图说明
图 1 为生理盐水组 ECG ；
图 2 丙二醇溶媒灌胃组 ECG ；
图 3 丙二醇溶媒 iv 组 ECG ；
图 4 葛根素注射液组 ECG ；
图 57， 2″ - 脱水葛根素灌胃组 ECG ；
图 67， 2″ - 脱水葛根素 iv 组 ECG ；
图 77， 2″ - 脱水葛根素 1H NMR ；
图 87， 2″ - 脱水葛根素 13C NMR ；
注： 图 1 ～ 6 中上方标记分别为开始给予 0.1 ％ BaCl2 时的心电图、 给予 0.1 ％ BaCl2 后开始出现心律失常的心电图、 以及从开始给予 0.1％ BaCl2 记录 30min 时的心电图。 具体实施方式
实施例 1 ： 7， 2″ - 脱水葛根素的制备 ：
将 2.9g( 约 7mmol) 葛根素在 N2 保护下溶于 200ml 无水四氢呋喃中， 冰浴条件下， 加入 3.5ml( 约 17.5mmol) 偶氮二甲酸二异丙酯和 4.6g( 约 17.5mmol) 三苯基磷， 缓慢升至 室温， 磁力搅拌 16h。浓缩、 常规硅胶柱层析 (CH2Cl2 ∶ CH3OH ＝ 13 ∶ 1， 8 ∶ 1) 得 2.4g 7， 2″ - 脱水葛根素， 收率为 87.1％。
7， 2″ - 脱水葛根素为白色粉末， 分子式为 C21H18O8， 结构式见式 I， 分子量 398， mp 1 258.4 ～ 260.1℃； H NMR(600MHz， CD3OD) ： δ8.23(d， 1H， J ＝ 8.4Hz)， 8.21(s， 1H)， 7.39(d， 2H， J ＝ 8.4Hz)， 7.13(d， 1H， J ＝ 8.4Hz)， 6.87(d， 2H， J ＝ 8.4Hz)， 5.45(d， 1H， J ＝ 3.6Hz)， 4.81(t， 1H， J ＝ 3.6Hz)， 4.07(dd， 1H， J ＝ 4.8， 9.6Hz)， 3.87(dd， 1H， J ＝ 2.4， 12.0Hz)，13 3.65(m， 2H)， 3.43(m， 1H) ； C NMR(150MHz， CD3OD) ： δ61.8， 68.1， 72.1， 73.6， 79.1， 87.6， 110.1 ， 115.2 ， 116.2 ， 118.9 ， 122.9 ， 125.3 ， 129.9 ， 130.4 ， 153.3 ， 154.1 ， 157.8 ， 166.2 ， + 176.8 ； HRMS(ESI)m/z calcd for C21H18O8[M+Na] 421.0894， found 421.0893.( 如图 7、 图8 所示 )。
实施例 2 ： 7， 2″ - 脱水葛根素的制备 ：
将 2.9g( 约 7mmol) 葛根素在 N2 保护下溶于 200ml 无水四氢呋喃中， 冰浴条件下， 加入 2.4g( 约 14.0mmol)N， N， N′， N′ - 四甲基偶氮二甲酰胺和 3.4ml( 约 14.0mmol) 三正 丁基磷， 缓慢升至室温， 磁力搅拌 16h。浓缩、 常规硅胶柱层析 (CH2Cl2 ∶ CH3OH ＝ 13 ∶ 1， 8 ∶ 1) 得 2.2g 7， 2″ - 脱水葛根素， 收率为 81.4％。
实施例 3 ： 7， 2″ - 脱水葛根素的制备 ：
将 2.9g( 约 7mmol) 葛根素在 N2 保护下溶于 200ml 无水四氢呋喃中， 冰浴条件下， 加入 1.6ml( 约 10.5mmol) 偶氮二甲酸二乙酯和 2.8g( 约 10.5mmol) 三苯基磷， 缓慢升至 室温， 磁力搅拌 16h。浓缩、 常规硅胶柱层析 (CH2Cl2 ∶ CH3OH ＝ 13 ∶ 1， 8 ∶ 1) 得 2.1g7， 2″ - 脱水葛根素， 收率为 77.5％。
试验 1 ： 7， 2″ - 脱水葛根素的抗心律失常试验 ：
(1) 方法 ： 取健康成年 Wistar 大鼠 60 只， 雄性， 180-220g， 按体重随机分为生理 盐水组， 丙二醇溶媒灌胃组， 丙二醇溶媒 iv 组， 葛根素注射液组， 7， 2″ - 脱水葛根素灌胃 组， 7， 2″ - 脱水葛根素 iv 组， 10 只 / 组。静脉注射组每天给药一次， 连续三天 ； 灌胃组每 天给药两次， 给药三天。生理盐水组给予相应体积的 0.9％氯化钠注射液 ； 丙二醇溶媒灌 胃组给药剂量为 14.3％丙二醇 1ml/100g ； 丙二醇溶媒静脉注射组给药剂量为 40％丙二醇 0.5ml/100g ； 葛根素注射液组给药剂量为 50mg/kg ； 7， 2″ - 脱水葛根素灌胃组给药剂量为 60mg/kg， 7， 2″ - 脱水葛根素静脉注射液组给药剂量为 30mg/kg。大鼠腹腔注射 10％水合 氯醛麻醉 (0.35ml/100g)， 背位固定。连接 BL-410 生物机能实验系统， 监测心电变化。暴露 股静脉， 插入头皮针， 连接恒速注射泵， 以恒速注入 0.1％ BaCl2， 0.1ml/100g， 速度为 0.6ml/ min。注射时开始计算时间， 监测并记录 30min 内心电图 (ECG)， 记录心律失常潜伏时间， 心 律失常的持续时间 (30min 内未恢复记录为 30min)。比较各组大鼠间差异， 并用 SPSS 软件 进行统计学分析， P ＜ 0.05 认为有统计学差异。
(2) 结果 ： 心电图如图 1 ～图 6 所示， 数据如表 1 所示， 与生理盐水组比较， 7， 2 ″ - 脱水葛根素灌胃组与 7， 2 ″ - 脱水葛根素 iv 组对 0.1 ％ BaCl2 诱导的心律失常潜 伏时间有所延长， 但无统计学意义。与生理盐水组比较， 7， 2 ″ - 脱水葛根素灌胃组与 7，
2″ - 脱水葛根素 iv 组对心律失常持续时间有明显作用， 可显著缩短心律失常持续时间 ( ＊ ＊ P ＜ 0.01)。 与阳性对照葛根素注射液比较， 也显著缩短心律失常持续时间， 有显著统计学 ## # 意义 ( P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)。此外， 与 7， 2″ - 脱水葛根素 iv 组比较， 7， 2″ - 脱水葛根 素灌胃组更明显的缩短心律失常持续时间， 较 7， 2″ - 脱水葛根素 iv 组效果更显著。
表 17， 2″ - 脱水葛根素预防给药对大鼠心律失常的影响
＊ ＊＊ 与生理盐水组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01. # ##
与葛根素注射液组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01.
(3) 结论 ： 本发明的 7， 2″ - 脱水葛根素衍生物可显著缩短心律失常持续时间， 水 溶性良好， 生物利用度高。
试验 2 ： 7， 2″ - 脱水葛根素的抗凝血试验 ：
(1) 方法 ： 取家兔一只， 称重， 耳缘静脉注射 3％戊巴比妥钠 1ml/kg。麻醉后， 分离 颈动脉， 结扎远心端， 近心端插管， 取血 25ml。分别放入预先加入 50mg/ml 草酸钾 0.5ml 的 试管中， 混匀。另取预先加入相应药物 0.25ml 的小试管 24 只， 向每只小试管中加入上述兔 血 0.9ml， 再各加 2mg/ml CaCl2 0.1ml， 摇匀后立即放入 37±0.5℃的恒温水浴锅中。每隔 30s， 将试管轻轻倾斜一次， 观察记录凝血终点时间 ( 以将试管慢慢倾斜， 血液不致流出为 终点 )。比较各组之间的凝血时间。用 SPSS 软件进行统计学分析， P ＜ 0.05 认为有统计学 差异。
(2) 结果 ： 数据如表 2 所示， 与生理盐水组比较， 溶媒组及药物组明显延长凝血时 间， 有统计学差异。与阳性对照葛根素组比较， 7， 2″ - 脱水葛根素药物中， 高剂量组显著延 ## 长凝血时间， 有显著统计学差异 ( P ＜ 0.01)。 与丙二醇溶媒组比较， 葛根素组及 7， 2″ - 脱 ▲ ▲▲ ▲▲ 水葛根素中， 高剂量组显著延长凝血时间， 有统计学差异 ( P ＜ 0.05， P ＜ 0.01， P ＜ 0.01)
表 27， 2″ - 脱水葛根素体外抗凝血作用研究
＊ ＊＊ 与生理盐水组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01。 # ## 与葛根素组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01。 ▲ ▲▲ 与丙二醇溶媒组比较 ： P ＜ 0.05， P ＜ 0.01。