DON 毒素的制备纯化方法 【技术领域】
本发明涉及一种 DON 毒素的制备纯化方法， 尤其是一种利用禾谷镰刀菌通过液体 种子培养基和液体发酵培养基制备纯化 DON 毒素的工艺。背景技术
真菌毒素是病原菌侵染植物产生的次级代谢产物， 在所有的真菌毒素中单端孢 霉烯族毒素是已知毒性， 致癌性和污染频率都比较高的天然物质之一， 而在单端孢霉烯 族毒素中， 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol， DON) 是最常见的。DON 又名呕吐毒素 (vomitoxin， VT)， 是小麦等谷物受赤霉病菌侵染后产生的一种真菌毒素， 1970 年首先从日 本香川县感染赤霉病的大麦中分离到， 其结构为 3， 7， 15- 三羟基 -12， 13- 环氧单端孢霉 -9 烯 -8 酮 (UenoY 等， 1984)。DON 污染谷物后会造成严重的产量损失， 李大伟 (1989) 报道我 国因毒素污染造成的小麦损失已超过了 80 万吨。DON 还会对人畜造成毒害， 一方面， 会使 动物产生包括嗜睡、 食欲丧失、 呕吐、 肠道损伤、 皮肤坏死、 胃肠功能障碍、 免疫功能障碍和 繁殖功能障碍等症状。在动物中， 猪对 DON 最敏感， 致吐剂量为 0.1mg/kg( 经口 )， 0.05mg/ kg( 腹腔注射 )(Danicke 等， 2004)。1999 年， 王金法等报道， 启东华宝三联牧场以受毒素污 染的大麦作饲料， 致使 4 月龄架子猪中毒并继发传染性胸膜肺炎， 死亡病猪 22 头。另一方 面由于 DON 具有很好的耐热性， 熔点是 151 ～ 153℃， 所以不因常规的加热而破坏， 在许多的 食品如 ： 面包、 蛋糕、 肉、 奶、 蛋上均有残留。
我国是小麦赤霉病的重发区， 尤其是长江中下游麦区、 东北春麦区和黄淮麦区， 小 麦赤霉病流行年的病穗率高达 50％以上， 因此我国谷物中 DON 毒素的污染也很普遍。杜晓 昱在 2005 年对采自我国福建、 江苏、 四川、 河南和黑龙江等麦区的 55 个小麦样品进行了 DON 含量的检测， 结果表明所有样品中都含有 DON， 其含量在 0.1 ～ 5.2mg/kg 之间， 其中有 17 个 样品中的 DON 含量都高于国家标准 1.0mg/kg ； 在我国河北省食管癌、 胃癌高发区居民饮食 中 DON 的污染率和含量均相当高， 检出含量最高者可达 170.22mg/kg。
由于真菌毒素 DON 在小麦等谷物中普遍存在， 除了严重影响粮食的产量和品质， 威胁人畜的健康以外， 还限制着我国农产品的出口。 很多的农产品， 包括 ： 小麦、 大麦、 玉米、 水稻等都是真菌毒素污染的高风险产品。 进口国家对真菌毒素限量标准阻碍了这类农产品 的出口。因此对于 DON 毒素的检测和控制越来越引起广泛的关注。
无论对 DON 毒素进行产生检测研究还是控制研究， 都需要大量的毒素样品。需 要有一种能够大规模、 安全、 廉价的在实验室制备纯化 DON 毒素的方法和技术， 目前， 实验 室制备纯化 DON 毒素的方法中涉及的培养基一般采用麦粒或者米饭培养基， 采用这种培养 需要把禾谷镰刀菌接种于麦粒或者米饭培养基上， 28℃培养 30 天后产生 DON 毒素。采 基， 用这种方法获得的 DON 毒素， 生产周期长， 由于小麦和大米中含有丰富的蛋白质和糖类等 组分， 导致毒素粗提取液中往往存在大量的杂质， 这就导致提取这种方法产生的毒素步骤 复杂， 操作时间长， 有机试剂用量大， 而且会造成后期的纯化困难， 纯毒素的获得率低。发明内容 本发明的目的在于 ： 针对通过麦粒培养基制备纯化 DON 毒素的方法获得的 DON 毒 素往往存在大量杂质的实际问题， 提供一种利用新的培养基制备纯化 DON 毒素的方法。
本发明的目的是这样实现的 ： 一种 DON 毒素的制备纯化方法， 是利用禾谷镰刀菌 生产 DON 毒素， 其特征在于 ： 生产中使用的种子培养基和发酵培养基均为液体培养基， 其 中， 种子培养基由下列组分按照体积百分比混合 ： 蔗糖 1％， 硝酸铵 0.2％， 硫酸镁 0.05％， 硫酸铁 0.02％， 磷酸二氢钾 0.2％， 蛋白胨 0.4％， 酵母浸膏 0.2％， 余量为水 ； 所述的发酵培 养基是由下列组分按照体积百分比混合 ： 硝酸铵 0.1％， 磷酸二氢钾 0.3％， 硫酸镁 0.05％， 氯化钠 0.4％， 蔗糖 2％， 甘油 1％， 硫酸锌 0.002％， 余量为水 ； 具体制备纯化方法是 ：
a) 将谷镰刀菌经活化， 接种于种子培养基中， 25 ～ 28℃， 摇床黑暗培养 3 天， 获得 种子液 ；
b) 将种子液按 5％的接种量接种于发酵培养基中， 25 ～ 28℃， 摇瓶或发酵罐黑暗 培养 15 ～ 20 天， 获得发酵培养液 ；
c) 将发酵培养液离心后取上清， 用乙酸乙酯萃取， 将萃取所得的乙酸乙酯浓缩， 得 DON 毒素的粗提取液 ；
d) 将 DON 毒素粗提取液旋转蒸干后， 用环己烷与乙酸乙酯混合溶液溶解， 过 60-100 目的柱层析硅胶柱， 依次分别用不同配比的环己烷与乙酸乙酯混合洗脱液洗脱， 用 TLC 方法检测每管洗脱液中含有 DON 毒素的情况 ；
e) 选择含有 DON 毒素的几管洗脱液旋转浓缩后， 再过 60-100 目的柱层析硅胶柱， 依次分别用不同配比的环己烷与乙酸乙酯混合洗脱液洗脱， 用 TLC 方法检测每管洗脱液中 含有 DON 毒素的情况 ；
f) 选择只含有 DON 毒素的几管进行合并后旋转蒸干后， 溶于少量的甲醇中， 4℃条 件下形成第一次结晶 ；
g) 把第一次结晶重新溶解于甲醇中， 4℃条件下进行二次结晶， 获得纯化的 DON 毒 素。
在本发明中 ： d 步骤中所述的环己烷与乙酸乙酯混合溶液中， 环己烷与乙酸乙酯 的体积比为 5 ∶ 1 ； d 步骤中所述的不同配比的环己烷与乙酸乙酯混合洗脱液是指 ： 环己烷 与乙酸乙酯的体积比分别为 5 ∶ 1、 8 ∶ 3、 5 ∶ 3、 1 ∶ 1、 3∶5和1∶5； e 步骤中所述的 不同配比的环己烷与乙酸乙酯混合洗脱液是指 ： 环己烷与乙酸乙酯的体积比分别为 8 ∶ 3、 5 ∶ 3、 1 ∶ 1、 3∶5和1∶5； d 步骤和 e 步骤中， 环己烷与乙酸乙酯混合洗脱液的使用顺 序均为 ： 环己烷的比例由大到小逐级递减。
在本发明中 ： d 步骤和 e 步骤中所述的用 TLC 方法检测每管洗脱液中含有 DON 毒 素的情况是指 ： 在收集不同比例洗脱液的样品后， 把每管样品进行旋转浓缩， 再用 TLC 方法 检测每管洗脱液中含有 DON 毒素的情况。
本发明的优点在于 ： 活化后的禾谷镰刀菌在所述的种子培养基中上生长迅速， 25 ～ 28℃培养三天后， 菌丝分散均匀， 无红色色素产生， 便于均匀的接种到发酵培养基中 ； 将种子液按 5％的接种量接种于所述的发酵培养基中， 在三角瓶或发酵罐中， 25℃～ 28℃ 黑暗培养 15-20 天， 即可产生大量的 DON 毒素。
本发明的优点还在于 ： 采用液体发酵培养基， 产生的粗毒素的纯度更高， 杂质更
少， 后期提取纯化更加方便。 附图说明
图 1、 禾谷镰刀菌 GZ3639 在不同培养基中产生的粗提取液的液相色谱图。 图中 ： A 采用本发明的液体种子培养基和液体发酵培养基 ； B 采用麦粒培养基。 图 2、 禾谷镰刀菌 F10 在不同培养基中产生的粗提取液的液相色谱图。 图中 ： A 采用本发明的液体种子培养基和液体发酵培养基 ； B 采用麦粒培养基。具体实施方式
实施例 1
本发明的培养基 ：
种子培养基配方是由下列组分按照体积百分比混合 ： 蔗糖 1％； 硝酸铵 0.2％； 硫酸 镁 0.05％ ； 硫酸铁 0.02％ ； 磷酸二氢钾 0.2％ ； 蛋白胨 0.4％ ； 酵母浸膏 0.2％ ； 余量为水。
发酵培养基是由下列组分按照体积百分比混合 ： 硝 酸 铵 0.1 ％， 磷酸二氢钾 0.3％， 硫酸镁 0.05％， 氯化钠 0.4％， 蔗糖 2％， 甘油 1％， 硫酸锌 0.002％， 余量为水。
实施例 2
禾谷镰刀菌 GZ3639( 该菌株由美国农业部真菌毒素研究中心馈赠 )
A) 采用实施例 1 的种子培养基和发酵培养基
将禾谷镰刀菌从冷藏斜面转接到 PDA 培养基平板上活化， 25 ～ 28℃培养 4 ～ 5 天， 挑取少量的菌丝接种到种子培养基中， 25 ～ 28℃摇床培养 3 天， 获得种子液。
再将种子液按 5％的接种量接种于发酵培养基中， 在三角瓶或发酵罐中， 28℃黑暗 培养 15-20 天， 取 1 升发酵培养液离心后取上清， 用乙酸乙酯萃取， 将萃取所得的乙酸乙酯 浓缩， 得 DON 毒素的粗提取液。
DON 毒素粗提取液用环己烷 ： 乙酸乙酯 (5 ∶ 1) 溶解， 过制备型硅胶柱 (60-100 目 的柱层析硅胶 )， 按顺序分别用环己烷∶乙酸乙酯 (5 ∶ 1)， 环己烷∶乙酸乙酯 (8 ∶ 3) 环己 烷∶乙酸乙酯 (5 ∶ 3)， 环己烷∶乙酸乙酯 (1 ∶ 1)， 环己烷∶乙酸乙酯 (3 ∶ 5)， 环己烷∶ 乙酸乙酯 (1 ∶ 5)， 乙酸乙酯洗脱， 按每管一定数量收集洗脱液， 把收集的洗脱液进行旋转 浓缩， 用 TLC 方法检测每管中含有 DON 毒素的情况。
选择含有 DON 毒素的几管洗脱液旋转浓缩后再过制备型硅胶柱， 按顺序分别用环 己烷∶乙酸乙酯 (8 ∶ 3) 环己烷∶乙酸乙酯 (5 ∶ 3)， 环己烷∶乙酸乙酯 (1 ∶ 1)， 环己烷∶ 乙酸乙酯 (3 ∶ 5)， 环己烷∶乙酸乙酯 (1 ∶ 5)， 乙酸乙酯洗脱， 按每管一定数量收集洗脱液 样品， 把收集的洗脱液样品进行旋转浓缩， 用 TLC 方法检测每管中含有 DON 毒素的情况。
选择只含有 DON 毒素的几管进行合并后旋转蒸干， 重溶于少量的甲醇中， 4℃条件 获得第一次的结晶 ； 把第一次的结晶重新溶解于甲醇中进行二次结晶。获得 1.1 克纯度较 高的 DON 毒素。
DON 毒素的结晶为白色， 易溶于水和极性溶剂甲醇、 乙腈、 丙酮、 乙酸乙酯， 但不溶 于正己烷和乙醚， 熔点为 151 ～ 153℃。
B) 采用麦粒培养基
把麦粒浸泡 24 小时后分装于三角瓶中， 于 121℃灭菌 30 分钟， 冷却后相同条件再重新灭菌一次， 即得麦粒培养基 ； 将禾谷镰刀菌活化， 25 ～ 28℃培养 4 ～ 5 天， 接种于麦粒 培养基中， 25 ～ 28℃培养 30 天后， 于烘箱中 70℃烘干后粉碎， 加入 3 倍体积的 84 ∶ 16( 体 积比 ) 的甲醇∶水， 摇床混匀提取， 离心取上清， 重复提取 2 次后， 合并上清液， 旋转浓缩至 三分之一体积后， 加入氯化钠至饱和， 静止过夜， 离心取上清， 把上清加入 1 倍体积石油醚 萃取， 弃石油醚层， 把水相加入 3 倍体积乙酸乙酯萃取， 取乙酸乙酯层旋转浓缩， 得 DON 毒素 的粗提取液。
C) 两种方法获得的粗毒素进行比较
将 A 方法制备提取获得的 DON 毒素粗提取液与 B 方法制备提取获得的 DON 毒素粗 提取液进行液相色谱检测， 结果见图 1.
由图 1 可以看出采用液体培养基培养禾谷镰刀菌 GZ3639 产生的 DON 毒素 ( 保留 时间为 9.5 分钟 ) 的吸收峰百分含量比较高， 其它杂质少， 证明 A 方法制备 DON 毒素的粗提 取液中 DON 毒素的含量高， 其它干扰物质少。
实施例 3
禾谷镰刀菌 F10( 该菌株由本试验室分离保存 )
A) 采用实施例 1 的种子培养基和发酵培养基 制备过程与实施例 2 的 A 方法相同， 其区别仅在于， 禾谷镰刀菌来源存在差异。
B) 采用麦粒培养基
制备过程与实施例 2 的 B 方法相同， 其区别仅在于， 禾谷镰刀菌来源存在差异。
C) 两种方法获得的粗毒素进行比较
将 A 方法制备提取获得的 DON 毒素粗提取液与 B 方法制备提取获得的 DON 毒素粗 提取液进行液相色谱检测， 结果见图 2.
. 尽管本实施例采用的禾谷镰刀菌与实施例 2 的来源不同， 仍然可以得出相同的 结论。由图 2 可见， 采用液体培养基培养禾谷镰刀菌 F10 产生的 DON 毒素 ( 保留时间为 9.5 分钟 ) 的吸收峰百分含量比较高， 其它杂质少， 证明 A 方法制备 DON 毒素的粗提取液中 DON 毒素的含量高， 其它干扰物质少。
实施例 4
禾谷镰刀菌 GZ3639( 该菌株由美国农业部真菌毒素研究中心馈赠 )
试验用的液体种子培养基 ( 实施例 1 提供 )
对比试验用的液体种子培养基 1 ∶葡萄糖 1％ ； 氯化铵 0.2％ ； 硫酸镁 0.05％ ； 硫 酸铁 0.02％ ； 磷酸二氢钾 0.2％ ； 麦芽精 0.4％ ； 酵母浸膏 0.2％ ； 余量为水。
对比试验用的液体种子培养基 2(PD 培养基 ) ∶马铃薯 20％， 葡萄糖 2％， 余量为 水。
试验过程
将禾谷镰刀菌从冷藏斜面转接到 PDA 培养基平板上活化， 25 ～ 28 ℃培养 4 ～ 5 天， 挑取同等量的菌丝分别接种到试验用的液体种子培养基 ( 实验组 )、 对比试验用的液体 种子培养基 1( 对比组 1) 和液体种子培养基 2( 对比组 2) 进行平行试验， 25 ～ 28℃摇床培 养 3 天， 分别获得它们的种子液。把不同方法培养得到的种子液用 WhatmanNO.4 滤纸过滤 培养液， 将菌丝放入预先称重的平皿中， 90℃烘烤 24h， 然后将菌丝放入干燥器中至恒重， 称 取菌丝的重量， 其中， 实验组种子液中的含菌量为 1.86mg/ml， 对比组 1 种子液中的含菌量
为 1.23mg/ml， 对比组 2 种子液中的含菌量为 1.34mg/ml， 而且对比组 2 产生红色色素， 影响 DON 毒素的后期提取纯化。 可见， 本发明的液体种子培养基明显优于对比组 1 和对比组 2 使 用的液体种子培养基。