CPTI酶联免疫检测试剂盒、其制备方法及应用.pdf

本发明提供了一种用于检测豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的酶联免疫试剂盒，本发明通过亲和层析法，获得了高纯度的豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白，以此作为免疫原免疫动物制备得到了具有高底物专一性以及灵敏度的豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白抗体，本发明将此抗体用于豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的检测，特别是转基因植物的胰蛋白酶抑制剂蛋白的检测，取得了良好的效果。

1、  一种制备豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的方法，其包括步骤：用亲和层析法纯化豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白粗品。

2、  如权利要求1所述的方法，其还包括在亲和层析后进一步采用电泳分离。

3、  如权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和层析的方法是将豇豆蛋白酶抑制剂蛋白粗品用少量平衡液溶解后，加入预平衡的色谱柱，经清洗后，洗脱得到豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白，其中平衡液和冲洗液的配制为：50mM Tris-HCl+0.01～0.1M CaCl₂，pH8.0；洗脱液的配制为：0.01～0.1M HCl+0.3M NaCl+0.01M CaCl₂。

4、  如权利要求3所述的方法，其特征在于亲和层析所用色谱柱的填料为CNBr-activated sepharose 4B。

5、  如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白粗品的制备方法是：将豇豆种子粉碎后，用蛋白提取溶液提取，得粗提液；将粗提液离心，取上清，用60％的硫酸铵沉淀，离心，保留沉淀，得豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白粗品。

6、  如权利要求5所述的方法，其特征在于粉碎前将种子浸泡3～4小时，并去掉种皮；所述蛋白提取溶液为醋酸钠溶液，提取时加入5～10倍(W/V)的醋酸钠溶液，搅拌下提取12～18小时。

7、  由权利要求1～6任一项所述方法制备得到的纯化豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白。

8、  用权利要求7所述的豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白免疫动物制备得到的抗体。

9、  含有权利要求8所述抗体的试剂盒。

10、  权利要求9所述试剂盒在检测豇豆胰蛋白酶抑制剂中的应用。

CpTI酶联免疫检测试剂盒、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)酶联免疫检测试剂盒，本发明还涉及制备该试剂盒的方法。
背景技术
害虫是危害我国农业生产的主要限制因素，大量化学农药的使用不但污染环境，而且也使得有益昆虫的数量锐减，害虫的抗药性不断加强。此外，化学杀虫剂使用后的农药残留对人畜都会有严重的危害。因而转基因植物抗虫工程成为科学家的研究热点领域之一。
豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea proteinase Trypsin Inhibitor，CpTI)是对靶标昆虫毒杀效果最好的蛋白酶抑制剂之一，通常能专一地与某一类消化酶结合，影响昆虫的消化作用，同时引起昆虫体内蛋白酶产生，造成必需氨基酸亏空，破坏其正常生理功能，而导致昆虫发育受阻或死亡。另外它们还可以引起昆虫体内水分平衡失调，影响酶的调节及昆虫蜕皮。自Hilder等(1987)首次获得转CpTI基因烟草以来，蛋白酶抑制剂在抗虫植物基因工程中的应用已有十余年，很多其他作物如稻、甘蓝、马铃薯、青椒、苜蓿、油菜、蕃茄都得到了转蛋白酶抑制剂基因的植株或品系。与此同时，科学家们还将CpTI基因进行修饰并与Bt杀虫蛋白基因进行共转化转入棉花获得双价复合性状的抗棉铃虫棉花如SGK321，转入水稻获得双价抗螟虫水稻如科丰6号等，这些转CpTI基因作物对靶标害虫具有良好的抗虫效果，同时也拓展了转基因作物的抗虫谱，对延缓靶标害虫抗性上升具有重要的作用。
转CpTI基因作物对靶标昆虫具有控制作用关键在于植物能够持续表达CpTI蛋白，所以外源杀虫蛋白的含量对于评价转基因作物的抗虫效果是至关重要的，另外，转CpTI基因作物的生态安全性也引起国际上极大的关注，转基因作物及其后续加工产品中CpTI含量的精准测定方法对于转基因生物安全管理具有保驾护航的支撑作用。虽然，我国转CpTI基因抗虫作物发展迅速，但仍然缺乏精准和快速的检测与评价技术。
转基因植物及其产品中表达产物的检测方法主要在外源表达产物水平上进行。即在翻译水平上对特异性蛋白质的检测，主要包括酶学反应检测法和免疫学检测法，和生物活性检测法。目前对于胰蛋白酶抑制剂如CpTI含量或在转基因作物及其产品中表达水平的检测方法也主要采用上述检测方法的一种或3种方法的整合。即室内靶标昆虫的生物活性测定、酶抑制剂抑制活力检测和通过蛋白质与特异性抗体结合进行检测如酶联免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)法测定。室内靶标昆虫的生物活性测定持续周期较长，易受环境因素的影响，对于不同时期的样品很难比较，同时不同时期供试靶标昆虫种群也存在差异，给检测结果的判定带来一定的困难，然而生物测定法是最能够反映转基因植物抗虫效果的方法。酶抑制法测定简单，其原理是依据蛋白酶抑制剂对目标蛋白酶具有抑制作用通过底物反应检测剩余蛋白酶的活力来间接测定蛋白酶抑制剂的含量。但蛋白酶酶抑制法进行定量测定时，会受到来自植物本身的干扰。一方面，一些植物自身或多或少天然存在蛋白酶抑制剂对检测结果产生干扰；另一方面特别当转基因植物中抑制剂的含量非常低时，植物本底颜色往往会对底物反应产生的颜色在吸光值因素有一定的干扰。所以，酶抑制法往往很不准确。目前，特异性荧光酶抑制法逐渐发展起来，在一定程度上降低了传统酶抑制法的不足。酶联免疫法测定法测定简单，准确，快速，但需要纯化抑制剂，制备特异的抗体，完成这些工作在前期需要花费大量的时间，人力和物力。当前，有关豇豆胰蛋白酶抑制剂或转基因植物及其产品中CpTI杀虫蛋白表达免疫检测的报道很少，国内有关豇豆胰蛋白酶抑制剂或转基因植物及其产品中CpTI表达情况多数限于DNA或mRNA的检测，核酸水平的检测可能存在假阳性的结果而且基因的导入并不一定代表功能蛋白的表达，表达含量也为未可知，没有蛋白表达的直接证明。有关蛋白检测表达的检测也只有酶抑制剂方法和极少的免疫学检测而且在这个层次上报道的结果与田间实际抗虫效率相差甚远，假阳性很高终不尽人意。因此，为了更好的评价豇豆胰蛋白酶抑制剂及研究转胰蛋白酶抑制剂基因作物的生态安全性、食品安全性，迫切需要制备特异性抗体并建立相应精准和快速的检测的豇豆胰蛋白酶抑制剂酶联免疫检测方法。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于检测CpTI的酶联免疫分析试剂盒，其具有高专一性和灵敏度。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述试剂盒的方法，本发明的目的还在于提供该试剂盒的应用。
本发明通过亲和层析法以及凝胶电泳得到高纯度的豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白，用该蛋白免疫动物得到多克隆抗体，并将得到多克隆抗体用于ELISA检测。
为实现上述目的，本发明首先提供一种制备高纯度豇豆蛋白酶抑制剂蛋白的方法，其包括用亲和层析法纯化豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白粗品，还进一步包括采用凝胶电泳进行分离。
亲和层析的方法是将豇豆蛋白酶抑制剂蛋白粗品用少量平衡液溶解后，加入预平衡的色谱柱，经清洗后，洗脱得到豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白。这里亲和层析所用的配体(即结合在固相载体上的吸附剂)可以是和豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白特异结合的蛋白，例如牛胰蛋白酶，平衡液和冲洗液的配制可为：50mM Tris-HCl+0.01～0.1M CaCl₂，pH8.0；洗脱液的配制可为：0.01～0.1M HCl+0.3M NaCl+0.01M CaCl₂。其中亲和层析所用色谱柱的填料可以是CNBr-activated sepharose 4B。
上述豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白粗品可通过下述方法制备：将豇豆种子粉碎后，用蛋白提取溶液提取，得粗提液；将粗提液离心，取上清，用饱和度为60％(0℃)的硫酸铵沉淀，离心，保留沉淀，得豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白粗品。在粉碎前可将种子浸泡3～4小时，并去掉种皮；所述蛋白提取溶液为醋酸钠溶液(0.1M NaAc+0.3M NaCl+0.01M CaCl₂，pH 4.0～pH 4.5，)，提取时加入5～10倍(W/V)的醋酸钠溶液，搅拌下提取12～18个小时。
将通过上述方法获得的高纯度的豇豆蛋白酶抑制剂蛋白作为免疫原，免疫动物，制备得到CpTI多克隆抗体或单克隆抗体。经检测，所得到的抗体具有高底物专一性和灵敏度。
将上述抗体包被到酶标板，并与适当的试剂组成ELISA试剂盒，这里所述的试剂包括CpTI标准品、酶标记物、显色液、终止液等。
本发明进一步还提供了一种检测转基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的方法，包括样品前处理，使用上述试剂盒进行检测，并分析检测结果。
本发明采用亲和层析色谱结合制备电泳技术分离得到豇豆胰蛋白酶抑制剂作为抗原，通过免疫注射获得专一性高的多克隆抗体，构建了酶联免疫检测试剂盒，降低了检测的假阳性率(1％)，提高了检测的灵敏度(检测极限达到0.5ng/g)。规范了转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因水稻和棉花材料中转豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的提取制备方法，降低了植物本底，保持了抑制剂的抑制活性。本发明制备的豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白特异性检测试剂盒能够快速检测转基因植物及产品中的豇豆胰蛋白酶抑制剂含量。该试剂盒和检测方法具有快捷、方便等特点，为转基因成分的快速检测、鉴定及安全监管提供了强有利的技术支撑，具有实际的应用价值。
附图说明
图1豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的亲和纯化的洗脱峰图，其中1是杂蛋白峰，2是豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白峰；
图2豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白SDS-PAGE鉴定电泳图，M为蛋白质分子量标准，1～2为亲和纯化的豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白。
图3抗体ELISA法效价测定结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白纯化、抗血清获得、以及转基因水稻中目的蛋白的提取方法优化，然而这并不意味本发明的检测试剂盒及检测方法只限于用转基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白含量的检测。
因此，使用本发明所描述的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)酶联免疫检测试剂盒制备方法和检测方法(亲和色谱制备分离、制备电泳纯化)，提取方法，以本领域普通技术人员所具有的任何涉及上述的试剂盒方法和检测方法检测其他转基因作物及其相关产品胰蛋白酶抑制剂和其他方面的应用，均包括在本发明所要求的权利范围之内。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的制备
1、豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的提取
选300g优质豇豆种子在大烧杯中蒸馏水浸泡3～4小时，去皮。4℃条件下用粉碎机粉碎，加5倍(W/V)的醋酸钠提取液(0.1MNaAc+0.3M NaCl+0.01M CaCl₂，pH 4.0)，置于2升烧杯中于4℃冰箱用磁力搅拌器混匀16小时。然后10000转4℃离心30分钟。取上清液加60％的硫酸铵(即198g/L)在冰浴上沉淀30分钟(一边用玻璃棒缓慢搅拌，或用磁力搅拌器慢慢搅拌，避免蛋白质变性)。随后12000转4℃离心15分钟留沉淀。用尽量少的A洗脱液(50mMTris-HCl+0.01MCaCl₂，pH 8.0)溶解，10000转4℃离心2分钟，取上清过0.45μ滤膜。)备色谱分离之用。
2、豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白的亲和层析纯化
称取CNBr-activated sepharose 4B填料3～4g置于烧结滤器中按照每g干填料200mL比例，用1mM稀盐酸冲洗15分钟，形成凝胶。称取适量的配体(牛胰蛋白酶，Trypsin)按照每mL凝胶/10mg配体的比例，用偶连缓冲液(0.1M NaHCO₃+0.5M NaCl，pH8.3)充分溶解，将含配体的偶连缓冲液与凝胶在三角瓶中混匀。置摇床上轻微震荡4℃过夜(不可用磁力搅拌器搅拌)。次日，用5倍凝胶体积的偶连缓冲液在烧结滤器中冲洗凝胶。然后把凝胶转移至200mL烧杯中加40mL的缓冲液(0.1M Tris-HCl pH8.0)4℃中静止浸泡2小时。浸泡好的凝胶用0.1M醋酸钠缓冲液(含0.5M NaCl，pH4.0)和0.1MTris-HCl(含0.5M NaCl，pH8.0)交替冲洗3个循环，每次循环各缓冲液分别需5倍凝胶体积的溶液。冲洗过滤后，按照25％结合缓冲液(50mM Tris-HCl+0.01M CaCl₂，pH8.0)/75％凝胶的比例关系在烧杯中将凝胶混匀，脱气后备装柱。将胶浆连续沿柱壁缓缓流入柱(16mm×10cm)中，待凝胶沉淀后立即用结合缓冲液封顶，再用结合缓冲液清洗3～5个柱体积柱床稳定至基线。
将粗蛋白样品沿柱壁缓缓注入色谱柱，待样品完全浸入胶柱，立即用A洗脱液(50mM Tris-HCl+0.01M CaCl₂pH8.0)洗脱杂蛋白至基线，弃去洗下的洗脱液。后用B洗脱液(0.01M HCl+0.3MNaCl+0.01M CaCl₂)洗脱目的蛋白，采用自动收集器以每管2mL速度将含目的蛋白的溶液收集至盛有0.5mL1M Tris-HCl，pH8.0溶液的试管中，采用多功能酶标仪OD₂₈₀检测记录各个收集试管中溶液的吸光值，绘制洗脱曲线。合并B洗脱液第一个洗脱峰的溶液，在10mM的Tris-HCl，pH8.0溶液中4℃透析过夜(图1)。透析后的蛋白经冷冻干燥浓缩后，取适量干燥蛋白浓缩样品溶解于100μL10mM Tris-Cl缓冲液中，分别加入50μL 3倍样品缓冲液(25μL上样缓冲液+75μLβ-巯基乙醇)，100℃煮沸5min，离心除去沉淀；将样品依次加入5％浓缩胶中，17.5％分离胶SDS-PAGE 4℃下电泳.完成染色、脱色和凝胶扫描和数据记录分析。亲和层析纯化的目标蛋白为13kD，与预测结果一致(图2)。
3、纯化蛋白的蛋白酶抑制剂活性测定及Bradford法测定蛋白浓度
在灭菌的eppendorf离心管中加入100μL豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白浓缩溶液、100μL牛胰蛋白酶(0.5mg/ml)和100μL的50mMTris-HCl溶液(含5mM CaCl₂，pH8.0)置于37℃培养箱中孵育5～10分钟，加300μL灭菌蒸馏水、50μL的50mMTris-HCl溶液(含5mMCaCl₂，pH8.0)和250μL的2.5％AZOCASEIN(50mMTris-HCl，pH8.0溶液配制)置于37℃培养箱中孵育10分钟，加入500μL10％TCA，10000转离心1分钟，取上清750μL，加750μL 0.5M的NaOH溶液。室温反应5min，428nm比色。结果表明，获得的目标蛋白具有很强的胰蛋白酶抑制活性(表1)。
表1纯化蛋白的蛋白酶抑制剂活性测定