发明概述
已经发现某些1，2，4-三嗪-3，5-二酮化合物对多巴胺D3受体表现出令人惊讶和意想不到的程度的高选择性结合和有利的DMPK特性，特别在代谢稳定性方面(例如，通过微粒体稳定性和/或体内半衰期来确定)。此类化合物为具有通式I的那些化合物、它们的生理上可耐受的盐、及它们的互变异构体和N-氧化物：
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其中：A为链长为4至6个碳原子的饱和或不饱和烃链，所述烃链是未取代的、或被1、2或3个甲基取代；
R1选自氢、C1-C3烷基和氟化C1-C3烷基；
R2为氢、卤素、氰基、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、氟化C1-C3烷基或氟化C1-C3烷氧基；
R3选自支链C4-C6烷基和C3-C6环烷基；以及
R4为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、氟化C1-C3烷基和氟化C3-C6环烷基。
因此，本发明涉及通式I的1，2，4-三嗪-3，5-二酮化合物及其生理上耐受的盐，涉及I的互变异构体及其生理上耐受的盐，涉及化合物I的N-氧化物及其生理上耐受的盐。
本发明还涉本发明还涉及药物组合物，其包含选自式I的1，2，4-三嗪-3，5-二酮化合物、其生理上耐受的盐、I的互变异构体、式I化合物的生理上耐受的盐、及其N-氧化物的至少一种活性化合物，适当时，连同生理上可接受的载体和/或辅助物质。
本发明还涉及用于治疗对多巴胺D3受体拮抗剂或多巴胺D3激动剂作用产生反应的病症的方法，所述方法包括对有需要的受治者(subject inneed thereof)施用有效量的至少一种活性化合物，所述化合物选自式I的1，2，4-三嗪-3，5-二酮化合物、其生理上耐受的盐、I的互变异构体、式I化合物的生理上耐受的盐、及其N-氧化物。
发明详述
对多巴胺D3受体拮抗剂或激动剂的作用产生反应的疾病包括中枢神经系统病症和疾病，特别是情感障碍、神经症性障碍、应激障碍和躯体型障碍以及精神病，尤其是精神分裂症、抑郁症、双相型障碍、物质滥用(也称为药物滥用)、痴呆、重症抑郁障碍、焦虑症、孤独症、伴有或没有多动障碍的注意力缺陷和人格障碍。另外，D3介导的疾病可包括肾功能障碍，特别是糖尿病(例如diabetes mellitus)引起的肾功能障碍，也称为糖尿病肾病(参见WO 00/67847)。
根据本发明，一种或多种具有文章开头所述含义的通式I的化合物可用于治疗上述适应症。若式I化合物具有一个或多个不对称中心，则还可能使用对映异构体混合物(特别是外消旋体)、非对映异构体混合物和互变异构体混合物；然而优选各自(respective)基本纯的对映异构体、非对映异构体和互变异构体。
同样可能使用式I化合物的生理上耐受的盐，尤其是与生理上耐受的酸的酸加成盐。合适的生理上耐受的有机酸和无机酸的实例为盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、具有1至12个碳原子的有机磺酸(例如C1-C4-烷基磺酸，例如甲磺酸；环脂族磺酸、例如S-(+)-10-樟脑磺酸；和芳族磺酸，例如苯磺酸和甲苯磺酸)、二羧酸和三羧酸、具有2至10个碳原子的羟基羧酸(例如草酸、丙二酸、马来酸、富马酸、粘酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、乙醇酸和己二酸)、以及顺式和反式肉桂酸、糠酸和苯甲酸。其它可利用的酸描述于“Fortschritte der Arzneimittelforschung[Advances in Drug Research]，第10卷，第224ff.页，Birkhauser Verlag，Basel和Stuttgart，1966”中。式I化合物的生理上耐受的盐可作为单盐、二盐、三盐和四盐存在，即它们可在每1分子式I中含有1、2、3或4个上述酸分子。所述酸分子可以以它们的酸性形式存在或作为阴离子存在。
本文所用的C1-C3烷基为具有1、2或3个碳原子的直链或支链烷基。此类基团的实例为甲基、乙基、正丙基以及异丙基。
本文所用的C1-C6烷基为具有1至6个碳原子的直链或支链烷基。此类基团的实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基(1，1-二甲基乙基)、正戊基、2-戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、n-己基、2-己基、2-甲基戊基等。
本文所用的氟化C1-C3烷基为具有1、2或3个碳原子的直链或支链烷基，其中至少一个(例如1、2、3、4或5个)氢原子或所有氢原子被氟原子置换。此类基团的实例为氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、2，2-二氟乙基、2，2，2-三氟乙基、1，1，2，2-四氟乙基、3，3，3-三氟丙基、1-甲基-2-氟乙基、1-甲基-2，2-二氟乙基、1-甲基-2，2，2-三氟乙基和1，1，1，3，3，3-六氟丙-2-基。
本文所用的C1-C3烷氧基为具有1、2或3个碳原子的直链或支链烷基，该烷基通过氧原子与分子的其余部分结合。此类基团的实例为甲氧基和乙氧基。
本文所用的氟化C1-C3烷氧基为如上所定义的C1-C3烷氧基，其中至少一个(例如1、2、3、4或5个)氢原子被氟原子置换。此类基团的实例为氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、2-氟乙氧基、2，2-二氟乙氧基、2，2，2-三氟乙氧基和1，1，2，2-四氟乙氧基。
本文所用的C3-C6环烷基为具有3至6个环碳原子的环脂族基团，其实例为环丙基、环丁基、环戊基以及环己基。
本文所用的氟化C3-C6环烷基为如上所定义的具有3至6个环碳原子的环脂族基团，其中至少一个(例如1、2、3、4或5个)氢原子被氟原子置换。此类基团的例子为1-氟环丙基、2-氟环丙基、2，2-二氟环丙基、1-氟环丁基、2-氟环丁基、2，2-二氟环丁基、3-氟环丁基、2，3-二氟环丁基、3，3-二氟环丁基等。
链长为4至6个碳原子的饱和或不饱和烃链包括1，4-烷二基(alkanediyl)、1，5-烷二基以及1，6-烷二基，例如丁烷-1，4-二基、戊烷-1，5-二基以及己烷-1，6-二基；和1，4-烯二基(alkenediyl)、1，5-烯二基以及1，6-烯二基，例如丁-2-烯-1，4-二基、戊-2-烯-1，5-二基、己-2-烯-1，6-二基以及己-3-烯-1，6-二基，其中链长为4至6个碳原子的不饱和烃链可以是未取代的或被1、2或3个甲基取代，例如1-甲基丁烷-1，4-二基、1-甲基戊烷-1，5-二基、1-甲基己烷-1，6-二基、1，1-二甲基丁烷-1，4-二基、1，1-二甲基戊烷-1，5-二基、1，1-二甲基己烷-1，6-二基、2-甲基丁烷-1，4-二基、2-甲基戊烷-1，5-二基、3-甲基戊烷-1，5-二基、2-甲基己烷-1，6-二基、3-甲基己烷-1，6-二基、2，2-二甲基丁烷-1，4-二基、2-甲基丁-2-烯-1，4-二基、2-甲基戊-2-烯-1，5-二基、2-甲基戊-3-烯-1，5-二基等。
本发明的一个优选实施方案涉及式I化合物、其药学上可接受的盐和N-氧化物，其中A选自(CH2)4、CH2-CH2-CH(CH3)-CH2、CH2-CH(CH3)-CH2-CH2、顺式CH2-CH＝CH-CH2、反式CH2-CH＝CH-CH2、顺式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、反式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、顺式CH2-C(CH3)＝CH-CH2以及反式CH2-C(CH3)＝CH-CH2，特别是(CH2)4。
本发明的一个优选实施方案涉及式I化合物、其药学上可接受的盐和N-氧化物，其中R1为氢。
本发明的一个优选实施方案涉及式I化合物、其药学上可接受的盐和N-氧化物，其中R2选自氢、甲基、乙基、氟化C1-烷基、氟或氯。在本发明的一个具体实施方案中，R2为氢。在本发明的另一个具体实施方案中，R2为甲基。
本发明的一个优选实施方案涉及式I化合物、其药学上可接受的盐和N-氧化物，其中，R3为支链C4-C6烷基，特别是叔丁基。
本发明的一个优选实施方案涉及式I化合物、其药学上可接受的盐和N-氧化物，其中R4为氟化C1-C2烷基、正丙基、正丁基、叔丁基或环丁基，特别是氟化C1烷基，更优选三氟甲基。
在本发明的化合物中，更优选其中式I中变量A、R1、R2、R3、R4中至少两个(特别是至少三个、尤其是至少4个)具有作为优选含义给出的含义的那些化合物。
本发明的一个特别优选实施方案涉及式I化合物、其药学上可接受的盐和N-氧化物，其中变量A、R1、R2、R3、R4具有下列含义：A为(CH2)4、CH2-CH2-CH(CH3)-CH2、CH2-CH(CH3)-CH2-CH2、顺式CH2-CH＝CH-CH2、反式CH2-CH＝CH-CH2、顺式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、反式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、顺式CH2-C(CH3)＝CH-CH2、反式CH2-C(CH3)＝CH-CH2，特别是(CH2)4；
R1为氢；
R2为氢、甲基、乙基、氟化C1-烷基、氟或氯，特别是氢或甲基；
R3为支链C4-C6烷基，特别是叔丁基；以及
R4为氟化C1-C2烷基、正丙基、正丁基、叔丁基或环丁基，优选氟化C1烷基，特别是三氟甲基。
在本发明的化合物中，更优选的是其中变量A、R1、R2、R3、R4具有下列含义的那些化合物：
A为(CH2)4、CH2-CH2-CH(CH3)-CH2、CH2-CH(CH3)-CH2-CH2、顺式CH2-CH＝CH-CH2、反式CH2-CH＝CH-CH2、顺式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、反式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、顺式CH2-C(CH3)＝CH-CH2、反式CH2-C(CH3)＝CH-CH2，特别是(CH2)4；
R1为氢；
R2为氢；
R3为支链C4-C6烷基，特别是叔丁基；以及
R4为氟化C1-C2烷基、正丙基、正丁基、叔丁基或环丁基，优选氟化C1-C2烷基，特别是三氟甲基。
在本发明的化合物中，同样更优选其中变量A、R1、R2、R3、R4具有下列含义的那些化合物：
A为(CH2)4、CH2-CH2-CH(CH3)-CH2、CH2-CH(CH3)-CH2-CH2、顺式CH2-CH＝CH-CH2、反式CH2-CH＝CH-CH2、顺式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、反式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、顺式CH2-C(CH3)＝CH-CH2、反式CH2-C(CH3)＝CH-CH2，特别是(CH2)4；
R1为氢；
R2为甲基；
R3为支链C4-C6烷基，特别是叔丁基；以及
R4为氟化C1-C2烷基、正丙基、正丁基、叔丁基或环丁基，优选氟化C1-C2烷基，特别是三氟甲基。
在本发明的化合物中，同样更优选其中变量A、R1、R2、R3、R4具有下列含义的那些化合物：
A为(CH2)4；
R1为氢；
R2为氢、甲基、乙基、氟化C1-烷基、氟或氯，特别是氢或甲基；
R3为支链C4-C6烷基，特别是叔丁基；以及
R4为氟化C1-C2烷基、正丙基、正丁基、叔丁基或环丁基，优选氟化C1烷基，特别是三氟甲基。
在本发明的化合物中，同样更优选其中变量A、R1、R2、R3、R4具有下列含义的那些化合物：
A为(CH2)4、CH2-CH2-CH(CH3)-CH2、CH2-CH(CH3)-CH2-CH2、顺式CH2-CH＝CH-CH2、反式CH2-CH＝CH-CH2、顺式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、反式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、顺式CH2-C(CH3)＝CH-CH2、反式CH2-C(CH3)＝CH-CH2，特别是(CH2)4；
R1为氢；
R2为氢、甲基、乙基、氟化C1-烷基、氟或氯，特别是氢或甲基；
R3为叔丁基；以及
R4为氟化C1-C2烷基、正丙基、正丁基或环丁基、叔丁基，优选氟化C1-烷基，特别是三氟甲基。
在本发明的化合物中，同样更优选其中变量A、R1、R2、R3、R4具有下列含义的那些化合物：
A为(CH2)4、CH2-CH2-CH(CH3)-CH2、CH2-CH(CH3)-CH2-CH2、顺式CH2-CH＝CH-CH2、反式CH2-CH＝CH-CH2、顺式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、反式CH2-CH＝C(CH3)-CH2、顺式CH2-C(CH3)＝CH-CH2、反式CH2-C(CH3)＝CH-CH2，特别是(CH2)4；
R1为氢；
R2为氢、甲基、乙基、氟化C1-烷基、氟或氯，特别是氢或甲基；
R3为支链C4-C6烷基，特别是叔丁基；以及
R4为氟化C1-烷基，特别是三氟甲基。
在本发明的化合物中，同样更优选其中变量A、R1、R2、R3、R4具有下列含义的那些化合物：
A为(CH2)4；
R1为氢；
R2为氢或甲基，特别是氢；
R3为支链C4-C6烷基，特别是叔丁基；以及
R4为氟化C1-C2烷基、正丙基、正丁基、叔丁基或环丁基，优选氟化C1-烷基，特别是三氟甲基。
根据本发明的化合物的实例包括下列化合物及其生理上耐受的盐和其互变异构体：
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮；
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-丙基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮；
2-{4-[4-(2，6-二叔丁基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮；
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-环丁基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮；
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐；
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-丙基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐；
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-4-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮。
以类似于文献中已知的方法来制备根据本发明的化合物I。通过方案1中所描述的2-取代的1，2，4-三嗪-3，4-二酮化合物II与4-哌嗪-1基-嘧啶化合物III的反应提供获得根据本发明的化合物的一种重要方法。
方案1：
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在方案1中，R1、R2、R3、R4以及A具有前述含义。L为可被亲核取代的离去基团。合适的可被亲核取代的离去基团的实例为氯、溴或碘，磺酸烷基酯或磺酸芳基酯，例如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯。反应必需的反应条件符合通常用于亲核取代的反应条件。所述反应条件与WO2004/080981和WO 2005/118558中描述的那些相似，可从这些文献中获取，或从本申请的工作实施例获取所述条件。
可通过使式IV的受保护的3，5-二羟基-1，2，4-三嗪化合物与化合物L′-A-L反应来制备其中R1为氢的式II的化合物，其中A如上所定义，L和L′为可被亲核取代的离去基团。
方案2：
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在方案2中，R2和A具有前述含义。合适的可被亲核取代的离去基团的实例为方案1中提到的离去基团。L和L′优选彼此不同并且在反应性上不同。例如，L′为溴或碘，L为氯。PG是OH-保护基团，可通过水解将其裂解，例如三烷基甲硅烷基(如三甲基甲硅烷基)、或C2-C4-烷基二甲基甲硅烷基。
根据方案2的步骤1的反应所必需的反应条件符合通常用于亲核取代的反应条件。所述反应条件与WO 2004/080981和WO 2005/118558中描述的那些相似，可从这些文献中获取，或从本申请的工作实施例获取所述条件。可通过使从化合物IV与化合物L′-A-L的反应所获得的反应混合物与水反应来简单实现水解。由此，获得式II的化合物，其中R1为氢。可使该化合物II与烷化剂反应，以引入与氢不同的基团R1。
或者，可通过US 5,977,106中描述的方法来制备化合物II。
式III化合物例如从WO 99/02503、WO 2004/080981、WO2004/108706、WO 2005/118558、WO 2005/118571以及WO2006/015842而众所周知，或可通过其中描述的方法来制备。
式IV化合物例如从以下文献而已知：(i)Tann等，J.Org.Chem.(1985)，3644-3647；(ii)Singh等，Synthesis(1990)，520-522，或可使用常规的O-保护方法从相应的1，2，4-三嗪-3，5-二酮开始来制备，所述常规方法例如P.J.Kocienski，″Protecting Groups″，第2版，Georg ThiemeVerlag Stuttgart 2000，第28至41页及其引用的相关文献中所描述。
可通过用氧化剂处理式I化合物来获得式I化合物的N-氧化物，所述氧化剂特别是无机或有机过氧化物或氢过氧化物(例如过氧化氢)或过羧酸，例如过乙酸、过苯甲酸或间-氯过苯甲酸。
除非另有说明，否则通常在溶剂中于室温至所用溶剂的沸点的温度下进行上述反应。或者，可使用微波将反应所需要的活化能引入反应混合物中，已证明这样做是有价值的，特别是在通过过渡金属催化的反应的情况下(关于使用微波的反应，参见Tetrahedron 2001，57，第9199ff.页，第9225ff.页和通用方法，″Microwaves in Organic Synthesis″，AndréLoupy(编著)，Wiley-VCH 2002)。
可使用的溶剂的实例为：醚，例如二乙醚、二异丙基醚、甲基叔丁基醚或四氢呋喃；非质子极性溶剂，例如二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二甲氧基乙烷和乙腈；芳族烃，例如甲苯和二甲苯；酮，例如丙酮或甲基乙基酮；卤代烃，例如二氯甲烷、三氯甲烷和二氯乙烷；酯，例如乙酸乙酯和丁酸甲酯；羧酸，例如乙酸或丙酸；以及醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和丁醇。
需要的话，有可能存在碱，以便中和反应中释放的质子。合适的碱包括：无机碱，例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾；醇盐，例如甲醇钠或乙醇钠；碱金属氢化物，例如氢化钠；有机金属化合物，例如丁基锂化合物或烷基镁化合物；以及有机氮碱，例如三乙胺或吡啶。后面的化合物可同时担当溶剂。
以常规方式分离粗产物，例如通过过滤、蒸馏去除溶剂或从反应混合物萃取等。可以常规方式纯化所得化合物，例如通过从溶剂中重结晶、通过色谱法或通过转化为酸加成盐。
以常规方式通过将游离碱与相应的酸混合来制备酸加成盐，适当时，以有机溶剂中的溶液形式来进行，所述溶剂例如：低级醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇；醚，例如甲基叔丁基醚或二异丙基醚；酮，例如丙酮或甲基乙基酮；或者酯，例如乙酸乙酯。例如，将式I的游离碱和适量的相应酸(例如每摩尔式I化合物1-4摩尔酸)溶于合适的溶剂中，优选在低级醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇中。必要时，可应用加热来溶解固体。可加入其中式I的酸加成盐不可溶的溶剂(抗溶剂)，以将盐沉淀。合适的抗溶剂包括：C1-C4-脂族酸的C1-C4-烷基酯，例如乙酸乙酯；脂族烃和环脂族烃，例如己烷、环己烷、庚烷等；二-C1-C4-烷基醚，例如甲基叔丁基醚或二异丙基醚。可将部分抗溶剂或所有抗溶剂加入到盐的热溶液中，并冷却由此获得的溶液；然后加入剩余的抗溶剂直到母液中的盐浓度低至约10mg/L或更低。
本发明的式I化合物为令人惊奇的高选择性多巴胺D3受体配体。由于它们对其它受体(例如D1受体、D4受体、α1-肾上腺素能受体和/或α2-肾上腺素能受体、毒蕈碱能(muscarinergic)受体、组胺受体、阿片受体、特别是多巴胺D2受体)的亲和性低，可预期这些化合物产生的副作用比经典精神安定药(D2受体拮抗剂)少。
以通常低于100nM(nmol/L)、优选低于50nM、特别是低于10nM的极低体外Ki值反映本发明化合物对D3受体的高亲和性。[125I]-碘代舒必利(iodosulpride)的置换可例如用于测定对D3受体的亲和性的受体结合研究中。
本发明化合物对D2受体相对于D3受体的选择性表示为Ki(D2)/Ki(D3)，其通常为至少20，优选至少50。[3H]SCH23390、[125I]碘代舒必利或[125I]螺哌隆(spiperone)的置换可用于例如实施D1、D2和D4受体的受体结合研究中。
由于这些化合物的结合特性，它们可用于治疗对多巴胺D3配体有反应的疾病或病症，即，预期它们可有效治疗其中对多巴胺D3受体发挥影响(调节)，导致临床表现(clinical picture)改善或者该疾病被治愈的那些医学病症或疾病。这些疾病的实例为中枢神经系统病症或疾病。
中枢神经系统病症或疾病理解为影响脊髓(特别是脑)的病症。在本发明含义中，术语“病症”表示障碍(disturbance)和/或异常，它们通常被认为是病理状况或病理机能，并且其本身可表现出特定的征兆、症状和/或机能障碍。
虽然本发明的治疗可直接针对个别病症(即异常或病理状况)，但可根据本发明治疗的也可能是若干异常，其可在原因上彼此关联，结合为模式或综合征。
可根据本发明治疗的病症特别是精神障碍和神经症性障碍。这些障碍特别包括器质性障碍，包括：症状性障碍，例如急性外源性反应型精神病，或者器质性或外源性原因的伴随性精神病(attendant psychoses)，例如与代谢障碍、感染和内分泌学相关；内源性精神病，例如精神分裂症和分裂型及妄想性障碍；情感障碍，例如抑郁症、重症抑郁障碍、躁狂症和/或躁狂抑郁症；上述障碍的混合形式；神经症性障碍和躯体型障碍以及应激相关的障碍；分离型障碍(dissociative disturbance)，例如意识丧失、意识模糊、双重意识和人格障碍；孤独症；注意力和觉醒/睡眠行为方面的障碍，例如行为障碍和情绪障碍，它们发作于儿童期和青少年时期，例如儿童多动症；智力缺陷，例如注意力障碍(伴有多动症或没有多动症的注意力缺陷障碍)；记忆障碍和认知障碍，例如学习和记忆减退(认知功能减退)、痴呆、嗜眠症和睡眠障碍，例如不宁腿综合症；发育障碍；焦虑状态；谵妄；性功能障碍，例如男性阳萎；摄食障碍，例如厌食症或贪食症；成瘾；双相型障碍；以及其它未指明的精神障碍。
可根据本发明治疗的病症还包括帕金森氏病和癫痫，特别是与之相关的情感障碍。
还可治疗的是成瘾性疾病(物质滥用)，即，由滥用抗精神病物质(例如药物或麻醉品)引起的精神病症和行为障碍，以及其它成瘾行为，例如赌博(gaming)成瘾和/或未其它分类的冲动控制障碍。成瘾物质的实例包括阿片类，例如吗啡、海洛因和可待因；可卡因；尼古丁；乙醇；与GABA氯离子(chloride)通道复合物相互作用的物质；镇静剂、催眠药和安定药，例如苯并二氮杂![]()
类；LSD；大麻素类；精神运动性兴奋剂，例如3，4-亚甲二氧基-N-甲基苯丙胺(迷魂药)；苯丙胺和苯丙胺样物质，例如哌甲酯；以及其它兴奋剂包括咖啡因。特别要考虑的成瘾物质为阿片类、可卡因、苯丙胺或苯丙胺样物质(amphetamine-like substances)、尼古丁和乙醇。
关于成瘾疾病的治疗，特别优选本发明式I的那些化合物，其本身没有任何促精神病药(psychotropic)的效果。这种效果还可在使用大鼠的试验中观察到，在对大鼠给予可根据本发明使用的化合物后，减少对它们本身的精神活性药物(例如可卡因)给药。
根据本发明的另一方面，本发明化合物适用于治疗至少部分原因属于异常活性的多巴胺D3受体的病症。
根据本发明的另一方面，在权宜(expedient)医疗意义上，通过优选外原性给予的结合配偶体(binding partners)(配体)与多巴胺D3受体的结合，治疗直接针对(特别是)可受影响的那些疾病。
可用本发明化合物治疗的疾病常常表征为进行性发展，即，上述病症随时间进程而变化；通常，严重程度增加而病症可能彼此合并或者可能出现除已经存在的那些病症之外的其它病症。
本发明化合物可用于治疗与中枢神经系统病症相关的许多征兆、症状和/或功能障碍，特别是上述病症。这些征兆、症状和/或功能障碍包括例如与现实的关系紊乱、缺乏洞察力以及满足常规社交标准或生活需求的能力、体温变化、个体内驱力(drives)变化(例如饥饿、睡眠、渴感等)、以及心境方面变化、观察和结合能力障碍、人格变化，特别是情绪不稳；幻觉；自我失调(ego-disturbances)；心烦意乱；矛盾意向；自闭症；人格解体和错误感觉(depersonalization and false perceptions)；妄想观念(delusional ideas)；吟唱言语(chanting speech)；联带运动不足；短步幅步态；躯干和四肢弯曲姿势；震颤；缺乏面部表情；言语单调；抑郁症；情感淡漠；自发性和决定性受阻(impeded spontaneity anddecisiveness)；联想能力缺乏；焦虑症；神经性激动；口吃；社交恐惧症；惊恐障碍；与依赖性有关的戒断症状；手形综合征；兴奋和混乱状态；心烦、运动障碍综合征和抽搐病症，例如亨廷顿舞蹈病(Huntington’schorea)和图雷特综合征(Gilles-de-la-Tourette’s syndrome)；眩晕综合征，例如外周位置性眩晕、旋转性眩晕和振动眩晕；忧郁症；癔病；疑病症等。
在本发明的含义内，治疗还包括预防性治疗(预防)，特别是复发性预防或阶段性预防，以及急性或慢性征兆、症状和/或功能障碍治疗。治疗可以是症状导向治疗(orientated symptomatically)，例如抑制症状。其可经短时间实现(effected)，可以是中期导向治疗或者可以是长期治疗，例如在维持治疗方面中。
令人惊奇的是，当施用本发明化合物时可达到超过1000ng/g、特别是超过3000ng/g的高的脑水平(大鼠中测定为Cmax值)。因此，本发明的化合物显示了较好的生物利用度。
因此，本发明化合物优选适用于治疗中枢神经系统疾病，特别用于治疗情感障碍；神经症性障碍、应激障碍和躯体型障碍以及精神病，特别用于治疗精神分裂症和双相型障碍。
由于本发明化合物I对D3受体的高选择性，因此它们还适用于治疗肾功能障碍，特别是糖尿病引起的肾功能障碍(参见WO 00/67847)，尤其是糖尿病性肾病。
另外，本发明化合物可以具有其它药理学和/或毒理学性质，这些特性使得它们特别适用于开发成为药物。作为实例，可预期对HERG受体具有低亲和性的式I化合物具有降低诱发QT间期延长(认为是导致心律失常风险的一个预测因子(predictor))的可能性(关于QT间期延长的论述参见例如A.Cavalli等，J.Med.Chem.2002，45：3844-3853及其中引用的文献；HERG分析可从GENION Forschungsgesellschaft mbH，汉堡，德国商购获得)。
在治疗方面中，本发明所述化合物的用途涉及方法。在该方法中，将有效量的一种或多种化合物(通常按照药学和兽医学实践配制)给予所治疗的个体，所述个体优选为哺乳动物，特别是人、生产性动物或驯养动物。是否需要此类治疗，以及该治疗采用何种的形式，这取决于个体情况，并经过医学评估(诊断)，其考虑到所存在的征兆、症状和/或功能障碍；发展特定征兆、症状和/或功能障碍的风险；以及其它因素。
通常，通过每天单次给药或者重复给药来实现治疗，其中适当时，与其它活性化合物或者含有活性化合物的制剂一起给药或者交替给药，以致为所治疗个体提供以下日剂量：在口服情况下，优选为大约0.01-1000mg/kg体重，更优选0.1-1000mg/kg体重，或者在胃肠外给药的情况下，大约0.01-100mg/kg体重，更优选0.1-100mg/kg体重。
本发明还涉及用于治疗个体(优选哺乳动物且特别是人、农场动物或驯养动物)的药物组合物产品。因此，通常以药物组合物形式给予化合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂连同至少一种本发明化合物，适当时，以及其它活性化合物。这些组合物可例如口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内或鼻内给药。
合适的药物制剂的实例为：固体药物形式，例如散剂、颗粒剂、片剂(特别是薄膜片剂)、锭剂、小药囊、扁囊剂、糖衣片剂、胶囊剂(例如硬明胶胶囊剂和软明胶胶囊剂)；栓剂或阴道药物形式；半固体药物形式，例如软膏剂、乳膏剂、水凝胶剂、糊剂或硬膏剂；以及液体药物形式，例如溶液剂、乳剂(特别是水包油乳剂)、混悬剂(例如洗剂、注射制剂和输注制剂)、滴眼剂和滴耳剂。植入释放装置也可用于给予本发明的抑制剂。另外，还可能使用脂质体或微球体。
当制备组合物时，通常将本发明化合物与赋形剂混合或用赋形剂稀释。赋形剂可以是固体、半固体或液体物质，它们充当活性化合物的溶媒、载体或介质。
合适的赋形剂列举在专业医学专著中。另外，制剂可包含药学上可接受的载体或常规辅助物质，例如助流剂；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂；抗氧化剂；抗刺激剂；螯合剂；包衣助剂；乳化稳定剂；成膜剂；凝胶形成剂；气味掩盖剂；矫味剂；树脂；亲水胶体；溶剂；增溶剂；中和剂；扩散加速剂；色素；季铵化合物；加脂剂和过脂剂(refattingand overfatting agents)；软膏、乳膏或油类的粗物质；硅酮衍生物；铺展助剂；稳定剂；消毒剂；栓剂基质；片剂助剂，例如粘合剂、填充剂、助流剂、崩解剂或包衣剂；推进剂；干燥剂；遮光剂；增稠剂；蜡；增塑剂和白矿物油。制剂在这点上基于例如以下文献所述的专业人员知识：Fiedler，H.P.，Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie，Kosmetik和angrenzende Gebiete[Encyclopedia of auxiliary。substances forpharmacy，cosmetics and related fields]，第4版，Aulendorf：ECV-Editio-Kantor-Verlag，1996。
以下实施例用于说明本发明而不限制本发明。
化合物通过在400MHz或500MHz NMR仪器(Bruker AVANCE)上于d6-二甲亚砜或d-氯仿中的质子-NMR表征；或通过质谱法表征，通常通过快速梯度的HPLC-MS(电喷雾电离(ESI)模式)记录在C18-材料上；或通过熔点表征。
核磁共振光谱性质(NMR)是指以百万分率(ppm)表示的化学位移(δ)。位移的相关区域(relative area)在1H NMR谱中对应于分子中具体功能类型的氢原子数。位移的性质(关于多重性)表示为单峰(s)、宽单峰(s.br.)、双重峰(d)、宽双重峰(d br.)、三重峰(t)、宽三重峰(t br.)、四重峰(q)、五重峰(quint.)和多重峰(m)。
制备实施例：
I.中间体化合物II的制备：
制备实施例1：3，5-双-三甲基硅烷基氧基-[1，2，4]-三嗪
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搅拌下，将1.7ml三甲基氯硅烷(13.27mmol)加入到15g(133mmol)2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮和74.7mL六甲基二硅氮烷(hexamethyldisilazane)(358mmol)的混合物中。在回流下搅拌该混合物2小时，在高真空下去除多余的反应物。将所形成的白色固体直接用于下一步骤。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ[ppm]7.35(s，1H)，-0.05(s，18H)。
制备实施例2：2-(4-氯-丁基)-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮
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将22.1g 3，5-双-三甲基硅烷基氧基-[1，2，4]-三嗪(86mmol)溶解于150mL二氯乙烷中，然后加入14.7g 1-溴-4-氯-丁烷(86mmol)和0.218g碘(0.858mmol)。在室温下搅拌该反应混合物25小时。然后，加入300mL甲醇，并搅拌混合物另外10分钟。减压蒸发溶剂，将残余物在二氯甲烷和水之间分配。用二氯甲烷萃取水相几次。用10％碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机层，经硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发有机相。使用二氯甲烷-甲醇(0-10％)经硅胶色谱纯化由此获得的粗产，得到13.4g所需产物。
ESI-MS：204.1[M+H]+
1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ[ppm]9.7(s，宽峰，1H)，7.4(s，1H)，4.0(m，2H)，3.6(m，2H)，1.95(m，2H)，1.85(m，2H)。
制备实施例3：2-(4-氯-丁基)-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮
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如对于合成2-(4-氯-丁基)-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮所述，从6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮开始来合成2-(4-氯-丁基)-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮，通过工作实施例1中所述的方法将6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮转化为6-甲基-3，5-双-三甲基硅烷基氧基-[1，2，4]三嗪，之后按照工作实施例2，使之与1-溴-4-氯-丁烷反应。
ESI-MS：218.1[M+H]+
1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ[ppm]9.7(s，宽峰，1H)，3.95(m，2H)，3.6(m，2H)，2.25(s，3H)，1.9(m，2H)，1.8(m，2H)。
II.化合物I的制备：
实施例1
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐
将13.4g 2-(4-氯-丁基)-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮(65.8mmol)和18.97g2-叔丁基-4-哌嗪-1-基-6-三氟甲基-嘧啶(65.8mmol)溶解于400mL二甲基甲酰胺中。在加入33.9g溴化钠(329mmol)和115mL N，N-二异丙基乙胺(658mmol)之后，在室温下搅拌反应物48小时。然后在减压下去除溶剂，用400mL乙酸乙酯研制获得的残余物，并将所获得的溶液过滤。蒸发滤液至干，用100mL二乙醚处理剩余的油性残余物，过滤并再次将滤液蒸发至干。粗产物经由硅胶色谱(乙酸乙酯-甲醇0-100％；二氯甲烷-甲醇0-5％；二氯甲烷-甲醇0-2％)纯化三次，得到标题化合物的游离碱。经由使用HCl/二乙醚处理将该产物转化为其盐酸盐(得到2.56g)。
ESI-MS：456.3[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400Hz)：δ[ppm]12.15(s，宽峰，1H)，11.7(s，宽峰，1H)，7.45(s，1H)，7.2(s，1H)，4.65(m，宽峰，2H)，3.85(m，2H)，3.45-3.65(m，4H)，3.0-3.15(m，4H)，1.8(m，2H)，1.7(m，2H)，1.3(s，9H)。
实施例2
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-二氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐
通过类似于实施例1中描述的方法，使用N-甲基-吡咯烷作为溶剂，
从2-(4-氯-丁基)-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮和2-叔丁基-4-哌嗪-1-基-6-二氟甲基-嘧啶制备2-{4-[4-(2-叔丁基-6-二氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐。
ESI-MS：438.2[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400Hz)：δ[ppm]12.15(s，宽峰，1H)，9.6(s，宽峰，1H)，7.5(s，1H)，7.0(s，1H)，6.75(t，1H，CHF2)，3.0-4.7(几个m，12H)，1.7(m，4H)，1.3(s，9H)。
实施例3
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-丙基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮
通过类似于实施例1中所描述的方法，从2-(4-氯-丁基)-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮和2-叔丁基-4-哌嗪-1-基-6-丙基嘧啶制备2-{4-[4-(2-叔丁基-6-丙基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮。
ESI-MS：430.3[M+H]+
1H-NMR(CDCl3，400Hz)：δ[ppm]7.45(s，1H)，6.1(s，1H)，4.0(m，2H)，3.65(m，4H)，2.55(m，6H)，2.45(m，2H)，1.8(m，2H)，1.7(m，2H)，1.6(m，2H)，1.3(s，9H)，0.95(t，3H)
实施例4
2-{4-[4-(2，6-二-叔丁基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮三氟乙酸盐
通过类似于实施例1中所描述的方法，从2-(4-氯-丁基)-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮和2，6-二-叔丁基-4-哌嗪-1基嘧啶制备2-{4-[4-(2，6-二-叔丁基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮。对从使用0.1％三氟乙酸运行的HPLC纯化而获得的物质进行冷冻干燥之后，获得三氟乙酸盐。
ESI-MS：444.4[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400Hz)：δ[ppm]12.15(s，宽峰，1H)，9.9(s，宽峰，1H)，7.5(s，1H)，6.6(s，1H)，4.6(m，2H)，3.9(m，2H)，3.3-3.7(m，2H)，3.1-3.3(几个m，4H)，3.05(m，2H)，1.7(m，4H)，1.3(s，9H)，1.25(s，9H)。
实施例5
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-环丁基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮
通过类似于实施例1中所描述的方法，从2-(4-氯-丁基)-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮和2-叔丁基-4-哌嗪-1-基-6-环丁基嘧啶制备2-{4-[4-(2-叔丁基-6-环丁基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮。
ESI-MS：442.3[M+H]+
1H-NMR(CDCl3，400Hz)：δ[ppm]7.35(s，1H)，6.1(s，1H)，4.0(m，2H)，3.65(m，4H)，3.4(m，1H)，2.55(m，4H)，2.45(m，2H)，2.3(m，4H)，2.0(m，1H)，1.9(m，1H)，1.8(m，2H)，1.6(m，2H)，1.35(s，9H)。
实施例6
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐
通过类似于实施例1中所描述的方法，从2-(4-氯-丁基)-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮和2-叔丁基-4-哌嗪-1-基-6-三氟甲基-嘧啶制备2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮。
ESI-MS：470.2[M+H]+
实施例7
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-丙基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐
通过类似于实施例1中所描述的方法，从2-(4-氯-丁基)-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮和2-叔丁基-4-哌嗪-1-基-6-丙基-嘧啶制备2-{4-[4-(2-叔丁基-6-丙基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-6-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐。
ESI-MS：444.3[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400Hz)：δ[ppm]7.1(s，1H)，5.0(s，宽峰，1H)，4.45(s，宽峰，1H)，3.7-3.9(m，6H)，3.6(m，2H)，3.1(m，4H)，2.8(m，2H)，2.1(s，3H)，1.8(m，2H)，1.7(m，4H)，1.4(s，9H)，0.95(t，3H)。
实施例8
2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-4-甲基-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮
用正戊烷处理36mg氢化钠，进行滗析并逐滴加入5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。将溶液冷却至0-5℃，缓慢加入2-{4-[4-(2-叔丁基-6-三氟甲基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-基]-丁基}-2H-[1，2，4]三嗪-3，5-二酮盐酸盐(0.407mmol)的DMF(5mL)溶液中。2小时之后，加入0.058g碘甲烷(0.407mmol)，在室温下搅拌该反应物16小时，并缓慢加入25mL冰水。将反应物蒸发至干，将残余物溶解于乙酸乙酯中，并用饱和的氯化钠水溶液洗涤有机层几次。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并蒸发溶剂。经硅胶色谱(Chromabond NP，二氯甲烷-甲烷0-10％作为洗脱剂)和制备反相HPLC色谱纯化，产生0.02g标题化合物。
ESI-MS：470.3[M+H]+
III.盖伦(galenic)给药形式的实施例：
A)片剂
在压片机上以常规方式压制下列组合物的片剂：
40mg 来自实施例1的物质
120mg 玉米淀粉
13.5mg 明胶
45mg 乳糖
2.25mg Aerosil![]()
(化学纯硅酸，亚微观(submicroscopically)细分散体)
6.75mg 马铃薯淀粉(6％糊)
B)糖衣片剂
20mg 来自实施例1的物质
60mg 片芯(core)组合物
70mg 糖化(saccharification)组合物
片芯组合物由9份玉米淀粉、3份乳糖以及1份60∶40的乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物组成。糖化组合物由5份蔗糖、2份玉米淀粉、2份碳酸钙以及1份滑石粉组成。随后为用该方式制备的糖衣片剂提供抗胃酸包衣。
IV.生物学研究：
1.受体结合研究：
将待测试的物质溶解于甲醇/Chremophor![]()
(BASF SE)中或溶解于二甲基亚砜中，然后用水稀释至所需浓度。
将待测试的物质溶解于甲醇/Chremophor![]()
(BASF SE)中或溶解于二甲基亚砜中，然后用水稀释至所需浓度。
a)多巴胺D3受体：
分析混合物(0.250ml)由源自具有稳定表达的人多巴胺D3受体的约106HEK-293细胞的膜、0.1nM[125l]-碘代舒必利以及孵育缓冲液(总结合)或另外，测试物质(抑制曲线)或1μM螺哌隆(非特异性结合)组成。各分析混合物以一式三份进行试验(run)。
孵育缓冲液含有50mM tris、120mM NaCl、5mM KCl、2mMCaCl2、2mM MgCl2和0.1％牛血清白蛋白、10μM喹诺酮以及0.1％抗坏血酸(每天新鲜制备)。用HCl将该缓冲液调节至pH 7.4。
b)多巴胺D2L受体：
分析混合物(1ml)由源自具有稳定表达的人多巴胺D2L受体(长同工型)的约106HEK-293细胞的膜、0.01nM[125l]-碘代舒必利以及孵育缓冲液(总结合)或另外，测试物质(抑制曲线)或1μM螺哌隆(非特异性结合)组成。各分析混合物以一式三份进行试验。
孵育缓冲液含有50mM tris、120mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2和0.1％牛血清白蛋白。用HCl将该缓冲液调节至pH 7.4。
c)测量和分析：
在25℃下孵育60分钟之后，在真空下使用细胞收集装置使分析混合物通过Whatman GF/B玻璃纤维过滤器过滤。使用过滤转移系统将过滤物转移至闪烁管中。加入4ml Ultima Gold![]()
(Packard)之后，振摇样品1小时，然后在Beta-Counter(Packard，Tricarb 2000或2200CA)中对放射性进行计数。使用属于该仪器的标准猝灭系列和程序将cpm值转化为dpm。
使用类似于Munson和Rodbard所描述的“LIGAND”程序的统计分析系统(SAS)，通过迭代非线性回归分析来分析抑制曲线。
在这些试验中，本发明化合物表现出对D3受体的非常良好的亲和性(＜100nM，经常＜50nM，特别＜10nM)，和对D3受体的选择性结合。
表1中给出结合试验的结果。
Ki(D3)：+++＜10nM，++＜50nM，+＜100nM
Ki(D2L)/Ki(D3)：+++＞50，++＞20，+＞10
表1：
实施例
Ki(D3)[nM]
相对于D2L的选择性*
1
+++
++
2
+++
++
3
+++
+++
4
+++
++
5
+++
++
6
+++
++
7
+++
++
*Ki(D2L)/Ki(D3)
2.动物中化合物给药后血浆和脑中的化合物浓度测定：
本研究中使用雄性Sprague-Dawley大鼠(每个试验2至4只)。在给药前和整个研究过程中将动物禁食过夜，但允许自由采水。
各大鼠通过管饲法每天口服接受10mg/kg(5mL/kg)剂量。在给药后0.5小时、3小时以及8小时，使用异氟烷将三只动物置于深度麻醉下，并在深度异氟烷麻醉下通过放血(心脏穿刺)进行安乐死。从各大鼠收集EDTA血液样品和脑组织。一经收集，将样品迅速置于冰浴中，在样品收集之后的2小时内，将血液在约4℃下离心。将所得脑和血浆样品置于干净玻璃试管中，并储存在冰箱中直至分析。
使用适当的液相色谱-质谱程序对血浆样品分析母体化合物。化合物I的结果在表2中给出，举例说明了用本发明化合物可达到的高的脑浓度。
3.代谢稳定性的测定：
在下列分析中通过分析微粒体半衰期来测定本发明化合物的代谢稳定性。以0.5μM的浓度孵育测试物质如下：
在微量滴定板中，在0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.4)中于37℃下将0.5μM测试物质与不同物种的肝脏微粒体(0.25mg蛋白/mL)一起预孵育5分钟。通过加入NADPH(1mg/mL)开始反应。在0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟以及30分钟之后取等分试样，并用相同体积的乙腈使反应终止，并冷却。通过液相色谱-质谱分析测定剩余的测试化合物的浓度。使用测试化合物消耗(depletion)的消除速率(eliminationrate)常数计算固有清除率(intrinsic clearance)值。