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降倍半萜过氧化合物及其制备方法与应用
    技术领域 本发明涉及药物化合物领域， 具体涉及一类源于真菌的具有抗肿瘤活性新的降倍 半萜过氧化合物及其制备方法， 以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
     背景技术 海洋微生物种类繁多 , 来源广泛 , 筛选获得率高 , 海洋微生物与其它海洋生物相 比， 最大的优势就是对环境友好， 具有可持续性发展特征。海洋微生物生活在特殊环境之 中， 已发展出独特的代谢方式， 能够产生结构新颖的活性代谢产物。根据 John 教授在 2010 年 《Natural Product Reports》 的报道， 2008 年发现海洋天然产物新化合物首次突破 1 千 种 （1065 种） ， 来源于海洋微生物的代谢产物占 21.69%（231 种） ， 是海洋来源代谢产物是主 要来源之一， 成为当今国际上研究的热点。
     红树林生态系是世界上最富多样性、 生产力最高的海洋生态系之一。红树林沼泽 区有充足的植物材料， 有丰富的浮游藻类和浮游生物， 这些条件正适合于为微生物的繁殖。 在过去的十几年里， 红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源。
     本发明所用的真菌 Talaromyces sp. HN21-3C, 已保藏于中国典型培养物保藏中 心 （CCTCC， 中国武汉大学校内） ， 保藏号为 CCTCC No ： M 2010266， 保藏日为 2010 年 10 月 15 日。其保藏证明和存活证明已经在申请号 201010594029.9 的中国发明专利中提交了。
     发明内容
     本发明的目的在于提供一类来源于海洋红树林内生真菌的一类新的降倍半萜过 氧化合物。
     本发明的另一个目的是提供上述新的降倍半萜过氧化合物的制备方法。
     本发明的进一步目的是提供上述降倍半萜过氧化合物在制备抗肿瘤药物中的应 用。
     2010 年， 发 明 人 从 南 海 海 洋 真 菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266 的液体培养的发酵液中， 分离得到两种新的降倍半萜过氧化合物， 具有抗肿瘤活 性， 已经申请专利， 申请号 ： 201010594029.9， 申请日期 ： 2010.12.17。发明人改用固体发 酵， 从固体培养菌体中， 又提取分离得本发明的两种新的降倍半萜过氧化合物 1 和 2， 与发 明专利 201010594029.9 的两种化合物互为 C-7 差向异构体。结构分别如 （Ⅰ） 所示。
     化合物 2 （Ⅰ） 本发明所用的真菌 Talaromyces sp. HN21-3C, 已保藏于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC， 中国武汉大学校内） ， 保藏号为 CCTCC No ： M 2010266， 保藏日为 2010 年 10 月 15 日。其保藏证明和存活证明已经在申请号 201010594029.9 的中国发明专利中提交了。
     本发明新的降倍半萜过氧化合物 1 和 2 可从真菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No ： M 2010266 的固体发酵培养菌体提取分离得到， 制备方法的具体步骤如下 ： （1） 真菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266 的种子培养 ： 培养基组成按重量比为 ： 葡萄糖 0.3 ～ 2.5， 酵母提取物 0.03 ～ 0.2， 蛋白胨 0.1 ～ 0.5， 琼脂 1.5 ～ 2.5， 氯化钠 1.5 ～ 4， 水 100 ； 制成试管斜面， 挑取菌株接入斜面， 28 ～ 35℃ 培养 7 ～ 10 天 ； （2） 真菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266 的发酵培养 ： 利用固体大米培养基发酵， 发酵培养基 ： 大米 ： 海水 =1 ： 1~1.5 ； 将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基， 于室温 25 ～ 35℃静置 1 ～ 2 个月 ； （3） 将上述培养好的发酵菌体用甲醇或乙酸乙酯或丙酮萃取多次， 浓缩萃取液， 将获得 的浸膏利用硅胶柱中进行色谱分离， 以石油醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇为洗脱剂梯度洗脱 ； （4） 收集 10％－ 50％乙酸乙酯 / 石油醚洗脱液， 30％的乙酸乙酯 / 石油醚为洗脱液， 再 以凝胶柱层析分离， 重结晶纯化， 即得到无色固体化合物 1 和无色颗粒晶体化合物 2。 本发明经试验证明， 新的降倍半萜过氧化合物 1 和 2 能有效抑制 5 种肿瘤细胞株 的生长， 可用于制备抗肿瘤药物， 可以是药物上可接受的任意一种剂型。
     与现有抗肿瘤药物相比， 本发明具有如下有益效果 ： 本发明新的降倍半萜过氧化 合物 1 和 2 来源于海洋真菌， 海洋真菌种类繁多、 数量庞大， 从真菌提取的方法简单， 新的降 倍半萜过氧化合物 1 和 2 来源丰富、 制备成本低廉 ； 降倍半萜过氧化合物 1 和 2 抗肿瘤活性 高， 应用前景广阔。
     化合物 1具体实施方式
     实施例 1 降倍半萜过氧化合物的制备方法 a. 真菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No ： M 2010266 的种子培养 ： 培养基组成按重量比为 ： 葡萄糖 0.3， 酵母提取物 0.2， 蛋白胨 0.5， 琼脂 2， 氯化钠 3， 水 100 ； 制成试管斜面， 挑取菌株接入斜面， 30℃ 培养 10 天 ； b. 真菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No ： M 2010266 的发酵培养 ： 利用固体大米培养基发酵， 发酵培养基 ： 大米 ： 海水 =1 ： 1； 将斜面中培养好的菌株挑入 发酵培养基， 于室温 35℃静置 2 个月 ； c. 将上述培养好的菌体体用甲醇或乙酸乙酯或丙酮萃取多次， 浓缩萃取液， 将获得的 浸膏利用硅胶柱中进行色谱分离， 以石油醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇为洗脱剂梯度洗脱 ； d. 收集 10％－ 50％乙酸乙酯 / 石油醚洗脱液， 30％的乙酸乙酯 / 石油醚为洗脱液， 再 以凝胶柱层析分离， 重结晶纯化， 即得到无色固体化合物 1 和无色颗粒晶体化合物 2。
     化合物 1 和 2 的试验数据 ： 化合物 1: C14H20O4， HRESI-MS ： 275.1261(M+Na)+( 计算值 275.1259), mp 120–122℃ .IR ν/cm-1(KBr): 2961, 2922, 1736, 1716, 1469, 1378, 1066, 1044. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) ： δ4.21 (dd, J = 4.1, 1.8 Hz, 1H), 2.93 – 2.81 (m, 2H), 2.70 (ddd, J = 14.3, 4.0, 2.1 Hz, 1H), 2.53 – 2.42 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.20 – 2.01 (m, 2H), 1.94 (s, 3H), 1.88 – 1.79 (m, 2H), 1.67 (m, 1H), 1.30 (s, 3H), 1.05 (s, 3H). 13 C NMR (101 MHz, CDCl3): δ207.7, 207.4, 90.6, 80.7, 43.7, 38.6, 36.5, 36.4, 35.5, 27.4, 26.6, 25.7, 24.7, 23.0. 化合物 2: C16H24O5， HRESI-MS ： 319.1525 (M+Na)+( 计算值 319.1521) , mp 91–93℃ . IR ν/cm-1(KBr): 2969, 2878, 1720, 1382, 1247, 1102, 931. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): 4.88 (m, 1H), 4.30 (m, 1H), 2.81 (m, 1H), 2.69 – 2.46 (m, 2H), 2.35 – 2.26 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.06 – 1.96 (m, 2H), 1.90 (s, 3H), 1.86 (m, 1H), 1.77 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 1.67 (m, 1H), 1.40 (m, 1H), 1.25 (s, 3H), 0.99 (s, 3H). 13 C NMR (101 MHz, CDCl3): δ208.1, 171.3, 89.8, 77.3, 72.8, 43.3, 37.0, 36.1, 35.5, 28.3, 28.1, 27.5, 26.3, 25.2, 24.2, 21.4. 实施例 2 MTT 还原法检测降倍半萜过氧化合物 1 和 2 抗肿瘤活性试验 1. 材料 ： 1.1 四脞盐 （MTT） ： 用 0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液 （PBS） 溶解 MTT（3-(4,5-dimethythi azol-z-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, SIGMA） 终浓度 5mg/mL， 过滤除菌， 分装 后 4℃避光保存。
     1.2 靶细胞的制备 ： 人乳腺癌细胞株 MDA-MB435 和 MCF7， 人前列腺癌细胞株 PC-3, 子宫颈癌 Hela， 人肝癌细胞株 HepG2 和人正常乳腺细胞 MCF-10A 的复苏与培养。
     a. 从液氮罐中取出人乳腺癌细胞株 MDA-MB435 和 MCF7， 人前列腺癌细胞株 PC-3, 子宫颈癌 Hela， 人肝癌细胞株 HepG2 和人正常乳腺细胞 MCF-10A 的冻存管， 迅速置入 37℃ 水浴中， 不停摇动使之迅速溶化， 无菌操作移入离心管中 ； b. 加全培养液至 10mL， 1000rmp 离心 5s， 弃上清 ； c. 重复以上操作一次 ； d. 以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中， 5％ CO2， 37℃培养 ； e. 观察细胞生长情况， 及时更换培养液， 分瓶。
     1.3 细胞计数 a. 选取对数生长期细胞， 胰酶消化， 全培养终止， 移入离心管中， 加全培至 10mL ； b. 取一滴滴入计数板一侧凹槽中， 显微镜下计数四大格的细胞总数、 除以 4， 乘 104， 即 为每毫升培养液所含细胞数 ； c. 调整细胞数至 1×105/mL ； 1.4 降倍半萜过氧化合物 1 和 2 的配制 ： 取一定量的化降倍半萜过氧化合物 1 和 2 加 入到全培中， 调整浓度为 500µg/mL， 超声乳化， 过滤除菌， 4℃保存。
     2. 试验方法 a.96 孔板各孔加入人乳腺癌细胞株 MDA-MB435 和 MCF7， 人前列腺癌细胞株 PC-3, 子宫 5 颈癌 Hela 和人肝癌细胞株 HepG2 100 µL（1×10 /mL） ， 5％ CO2， 37℃培养 4hr。b. 加入不同浓度受试对象 100 µL， 对照加全培 100 µL， 继续培养 48hr。
     c. 加入 MTT（5mg/mL） 各 10 µL， 继续培养 4hr。
     d. 去除培养液。每孔加入 DMSO100 µL， 轻轻振荡 5 － 10min， 使颗粒溶解。
     e. 酶联免疫仪 570nm 下测定每孔 OD 值。
     f. 计算抑制率 ： 肿瘤细胞杀伤率％＝ [（对照组测定的平均 OD 值 － 加药组测定的平均 OD 值） / 对照组测定的平均 OD 值 ]×100％ g. 以抑制率对药物浓度的对数作图， 求得 IC50 值 以 lg c 为横坐标， 抑制率为纵坐标， 求得 IC50 值 3. 试验结果 验 结 果 显 示 降 倍 半 萜 过 氧 化 合 物 1 和 2 均 能 有 效 抑 制 人 乳 腺 癌 细 胞 株 MCF7 和 MDA-MB435， 人前列腺癌细胞株 PC-3, 子宫颈癌 Hela， 人肝癌细胞株 HepG2， 化合物 1 和 2 的 抑制肿瘤 IC50 值 （µM） 见表 1。
     表 1 化合物 1 和 2 的体外细胞毒试验结果 (IC50 µg/mL)6