L-抗坏血酸是一种重要的营养补充物，广泛用于维生素胶束，用在人类和其他需维生素C的动物的食物中作为营养补充物。L-抗坏血酸是一种用量日益增加的化学物质，因而产品价格至关重要，为满足市场，需要经济有效的生产方法。因此，注意力基本上集中在发展应用微生物提供有效的转化营养物的方法，旨在大量生产L-抗坏血酸。 野生型微生物只产生少量L-抗坏血酸。无法预期能否用微生物获得高产率的L-抗坏血酸。即便涉及L-抗坏血酸途径的酶之表达加强而使与营养物消耗相关的L-抗坏血酸生产增高成为可行，仍也无法预期升高的L-抗坏血酸浓度对微生物生活力和代谢的作用。所以，当已知微生物产生L-抗坏血酸时，并不能确定已经建立了经济有效的生产方法。
Loewus，F.A.在“L-抗坏血酸：代谢、生物合成、功能”（The Biochemistry Of Plants，Vol.3，Academic Press，Inc.，pp.77-99，1980）中综述了L-抗坏血酸的来源和生物合成。藻类生产抗坏血酸的描述可参见Vaidya等〔Science and Culture（1971）31：383-384〕;Subbulakshmi等〔Nutrition Reports International（1976）14：581-591〕;Aaronson等〔Arch.Microbiol（1977）112：57-59〕;Shigeoka等〔J.Nutr.Sci.Vitaminol.（1979）25：299-307〕;Shigeoka等〔Agric.Biol.Chem.（1979）43：2053-2058〕;Bayanova和Trubachev〔Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologyia（1981）17∶400-407（UDC 582.26：577.16〕及Ciferri〔Microbiological Reviews（1983）47：551-578〕的文章。
提供一种应用小球藻类生产L-抗坏血酸的改进方法。用此方法在起始阶段，把小球藻生长到中等细胞密度，并通过顺序或连续加入在限制水平的碳源，维持继续生长。观察到与L-抗坏血酸生产相关的碳源利用的改进，同时获得产量增加。
提供在微生物细胞里有效生产L-抗坏血酸的新方法。方法涉及藻类在发酵罐里起始生长，罐中的碳源足够使细胞生长至中等密度。在碳源耗竭阶段，顺序或连续加入外加碳源以维持碳源浓度低于预定水平，直到加入终止为止。正常情况下，生产L-抗坏血酸的终止过程是由微生物的基本耗尽来控制的。
所需微生物是从高产菌株随机筛选获得的。可选择有希望的微生物，并用物理或化学诱变剂诱发突变，如紫外线、X-线、亚硝基脲、硫酸二甲酯等。可用氧化还原染料简便地检测确定高产株和排泄株。通过使用抗坏血酸代谢中间产物的类似物或抗坏血酸合成的抑制剂，可选择到存在化学干扰时仍能维持或增加L-抗坏血酸生成的微生物。
按每克细胞形成毫克水平L-抗坏血酸的量来测量产量的明显增加，以选择上述过程所得的微生物子代。然后进一步把这些子代分成单个克隆并再做上述同样处理。选出的藻类是小球藻属，尤其是该粉核小球藻（Chlorella Pyrenoidosa）种。特别指出的是淀粉核小球藻UTEX1663株或其他相当的藻株。
在实行此方法时，在营养培养基中接入有活跃生长的小球藻培养物，其量足使起始细胞密度大约有0.15-0.4克细胞干重/升。培养基包括碳源、各种盐类和微量金属元素。碳源通常为葡萄糖源，包括葡萄糖。葡萄糖源可以是任何能转变为葡萄糖的糖类或多糖，例如：蔗糖、淀粉等。如果不被代谢，所用葡萄糖源的总量应达到约为65～90克/升的浓度，通常约为75～85克/升，最好约为80克/升。一般起始时加入约总葡萄糖量的15%～30%，更常用总葡萄糖量的20%～25%。通常在起始时和发酵期间都要加入葡萄糖和其他添加剂。在非限制性生长期中，葡萄糖源常维持在15～30克/升范围。此量足以避免在生长期出现受葡萄糖限制。
某些添加剂一开始就存在于发酵罐中，并随着以后加入葡萄糖源的同时补充这些添加剂，使它们的含量继续合乎需要地增添。
和加入发酵罐的总量比较，在加入量上渐进增加的添加剂中与葡萄糖有不同的比例的是碱金属磷酸盐、钠和钾的磷酸盐，特别是磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。磷酸氢二钠的总量约为1～2克/升，一般约为1～1.5克/升，最好约为1.3克/升。发酵罐里磷酸氢二钠的起始量约为总加入量的35%～50%，通常为40%～45%。磷酸二氢钾总量约为1.5～3克/升，通常约为2～2.5克/升。起始量一般是总量的40%～50%，通常约为45%～50%。
除上述添加剂外，尚加一种生物可接受的络合剂。常规用柠檬酸三钠，总量约为0.8-1.2克/升，常用1.0克/升。磷酸二氢钠量约为0.8～1克/升，最好约为0.95～1克/升。加入生物可接受的无机酸以维持溶液中的微量金属元素于溶解状态，并中和作为氮源使用的氨。浓硫酸的用量约为1～2毫升/升，常用1.2～1.5毫升/升。金属元素中镁作为生理上可接受的盐，特别是其硫酸盐，用量约为0.1～0.2克/升，最好约为0.1～0.15克/升。要限制应用铁和铜的量，因为这些金属元素抑制抗坏血酸形成。铁元素（二价铁）起始量为5～7毫克/升，最好5.5～6毫克/升，并绝不再继续加入。铜元素用量相当少，一般约为1～50微克/克葡萄糖。
微量金属元素溶液（在实验部分介绍）加入总量约为10～15毫升/升，常用12～14毫升/升。按葡萄糖量计算，微量金属元素溶液的用量为0.1～0.2毫升/克。
通常在发酵期间加入的溶液大部分含有下列成分。
表1 培养基配方
成分 浓度（相对于葡萄糖）
葡萄糖 1.0
柠檬酸三钠（含两分子结晶水） 0.0125
硫酸镁（无结晶水） 0.0082
磷酸二氢钠 0.0116
磷酸二氢钾 0.0238
磷酸氢二钠 0.0121
微量金属元素混合物 0.1675毫升/克
硫酸98%（W/W） 0.0329
由无水氨提供氮，同时用于控制pH。培养基中实际氮水平由培养基的酸度和缓冲容量决定。
微量金属成分将包含下列金属元素。
表2 微量金属离子溶液
成分 浓度（贮存液浓度）毫克/升
氯化钙（含两分子结晶水） 3102
硫酸锰（含一分子结晶水） 400
硫酸铜（含一分子结晶水） 0.4
氯化钴（含五分子结晶水） 40
硼酸 160
硫酸锌（含七分子结晶水） 400
钼酸钠（含两分子结晶水） 19
硫酸钒（含两分子结晶水） 20
硝酸镍（含六分子结晶水） 8
亚硒酸钠 18
按上表所示将适量的各种化合物溶于含少量盐酸的蒸馏水中，制备微量金属元素贮存液，溶液的终体积为1升，内含20毫升浓盐酸。用蒸馏水保证微量金属元素组成的比例适当。
把一些盐类分成一代或二代金属盐仅为方便起见，并非必需。这些物质起缓冲作用，其质子化的比率将随培养基的pH变化。
发酵进行时，将磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶解在占待加入总培养基量的75～90%的培养基中（通常为80～90%）。
按适当比例将单一组分物质组合即可制备出欲在发酵过程逐步加入的溶液。葡萄糖溶于占待用水量的约75～85%的水中（通常约为80%）;柠檬酸盐、镁和硫酸组合溶于占待用水量的5～15%的水中（通常约为10%）。而磷酸盐组合溶于占待用水量的5%到15%的水中（通常为10%）。接着加入微量金属元素溶液，它溶解在占待用水总量的5%到10%的水中（通常为8～10%）。向含一份磷酸盐的发酵罐中加入亚铁盐和20%上述制备的葡萄糖-盐浓溶液。加入液是无菌的，以避免任何外源微生物的侵入。将营养培养基调节到所需要的温度，一般在30～40℃范围，最好35℃。用接种器向发酵罐内种入细胞使起始细胞密度约为0.15～0.4克/升，发酵过程中可加入少量消泡剂。
在发酵第一阶段，细胞生长达到中等密度。此阶段大约需35～50小时，通常为40～45小时，生长速率约为0.1～0.15/小时。用无水氨控制pH，以保持pH范围在6.5～8.0。通常在活跃生长期后pH调节即可放宽。搅拌速度通常为200～1000转/分，通气量为0.2～0.6升/分。起始阶段细胞最终密度为35～45克/升，最好为40克/升左右。
用常规方法从上清液检测葡萄糖的利用情况，如用葡萄糖氧化酶试验、高压液相层析等。葡萄糖浓度降低时，加入20%葡萄糖-盐浓溶液补充葡萄糖，并保持葡萄糖的总浓度低于30克/升。在起始阶段，如果达到了高细胞密度，而葡萄糖又完全耗竭则维持此状态2～4小时，通常3小时。以后以大致相同时间的间隔里，按每克细胞每小时0.005～0.015克葡萄糖的添加速度加入葡萄糖源，维持葡萄糖源浓度低于0.1克/升。当L-抗坏血酸浓度保持恒定或开始降低时，停止发酵，按常规方法将细胞和上清液分离，从细胞中分离提取并收集抗坏血酸。
按照这个方法可得到高产量的L-抗坏血酸，其产量远高于其他天然来源，如蔷薇果。能获得超过3.5%生物量物质水平，以至4.0%或更高。L-抗坏血酸的浓度超过1.45克/升，能达到3.3克/升或更高。根据基质的消耗量，克分子产率至少约为0.010，通常约为0.013。
提供下列实施范例是为举例说明，而不是为了限制实施的范围。
在1升容积发酵罐里加0.6升水、0.23克磷酸氢二钠、0.27克磷酸二氢钠，进行消毒。向此磷酸盐溶液中无菌加入11.2毫克溶解在5毫升蒸馏水里的硫酸亚铁（含7分子结晶水）和20毫升消毒葡萄糖-盐浓溶液（制备见下）。各组营养物分别消毒，冷却后组合。
第一组
56克 葡萄糖，食品级，含1分子结晶水。（按无水形式计）
（80克/升），溶于80毫升水里。
第二组
0.7克 柠檬酸钠（含2分子结晶水）（1.0克/升）
硫酸镁（无水） （0.66克/升）
1毫升 硫酸（1.4毫升/升）
溶于10毫升水中。
第三组
0.65克 磷酸二氢钠 （0.97克/升）
1.3克 磷酸二氢钾 （1.9克/升）
0.68克 磷酸氢二钠 （0.97克/升）
溶于10毫升水里。
第四组
9.4毫升微量金属元素溶液。
将温度升至35℃，从200转/分开始搅拌，并按细胞浓度约为0.3克细胞/升加入淀粉核小球藻UV101-158。这些细胞于1985年6月27日保存在A.T.C.C，登记号53170。以下项目说明发酵条件和分析结果。
表3
时间 pH 细胞密度 抗坏血酸 说明
小时 克/升 毫克/升
0 6.9 -
5 6.6 0.7 400转/分;空气0.4升/分
16 6.9 3.8 550转/分;空气0.6升/分
21 7.0 9.5 700转/分;加20毫升＊
24 6.9 14.2 800转/分;加20毫升＊
36 葡萄糖耗竭
40 7.1 38.6 538 加4毫升+
45 7.2 38.6 654
48 加4毫升+
51 7.6 38.1 775 加2毫升+
65 7.7 37.8 966
68 7.8 1050 加4毫升+
92 7.6 37.2 1292
101 7.3 36.1 1459
＊葡萄糖/盐浓溶液
+20%葡萄糖。此溶液在发酵过程中周期性重复加入。
用Grun和Loewus阐述的方法确定L-抗坏血酸〔Analytical Biochemistry（1983）130∶191-198〕。此法属于离子交换技术，使用7.8×300毫米有机酸分析柱，HPX-87（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）。条件是：移动相为0.013摩尔硝酸，流速0.8毫升/分;压力1500磅/吋2;紫外检测：245～254毫微米。按照上述条件，能够分辨L-抗坏血酸和异抗坏血酸。
按照以下方法测定每升发酵液的细胞克数。在一个称重皿里加入5毫升生物量样品，在第二个称重皿里加入5毫升上清液。上清液已经过离心。把两个称重皿放入烘箱，105℃干燥3小时，在干燥品中冷却后，将称重皿内容物称重，按下式计算每升发酵液的细胞克数：
（样品重-上清液重）×200。
根据以上结果，每克细胞抗坏血酸的克重产率可达0.04或更多，而按每消耗1克分子葡萄糖生成的L-抗坏血酸克分子数计算，克分子产率至少可达0.01或更高。此外，抗坏血酸的浓度可高达约1.5克/升或更高。
从以上结果明显看出，经过有效地利用葡萄糖和发酵罐时间，能够得到增高的抗坏血酸产量。微生物，尤其是小球藻藻株，能够在发酵罐中生长，有效地利用廉价的碳源形成L-抗坏血酸，从而得到高产水平的L-抗坏血酸。
尽管为了清楚理解起见，通过描述和实施范例已对本发明做了详细说明，但显然在附录的权利要求书范围内在实践中还可作某些变动和改进。