一类具有毒杀线虫活性的化合物及其应用 技术领域：
本发明涉及一类具有毒杀线虫活性的化合物及其应用，属微生物生物农药技术领域。
背景技术：
线虫危害严重，它不仅给人类和动物带来严重的疾病，而且每年给农作物造成相当于1044亿美元的损失。目前对线虫的防治仍然以化学防治为主，但由于化学杀线虫剂多数是高毒、高残留农药，对人蓄和环境造成严重的威胁。有的化学杀线虫剂，如用作土壤熏蒸剂的溴甲烷类等，已经在全球多数国家禁止使用或已经规定使用的最后期限。随着人们环境意识的增强，化学杀线剂的应用受到限制，因此对线虫的生防研究自然成为重点和焦点问题。在线虫的生防研究中，目前已有直接利用菌体的第一代商品生防剂问世，并已有相当范围的大田应用。由于这一代产品是活菌体，土壤存在着不同程度的抑菌作用，导致在不同国家不同土壤中试用的不稳定性和不一致。这是活体生防制剂的共同通病，为克服这一难题，人们更加关注线虫生防第二代产品地开发，即菌株次生代谢产物的研究与开发。
近30年的研究中，已从50多株菌中分离到90多种对线虫有活性的化合物，其结构类型多样，主要有醌类、生物碱类、萜类、肽类、吡喃类、脂肪酸类和萘类等。但由于各种原因，在这些化合物中目前具有潜力开发成线虫生防制剂的很少，因此加紧筛选获得对线虫有活性的物质或组分，将其开发成生防制剂是一项具有重要意义。
5-甲基-3-呋喃羧酸是一种呋喃的羧酸衍生物，CAS No.：21984-93-0，CA名称3-Furancarboxylic acid，5-Methyl，分子式C6H6O3，分子量126.10，结构式如下：
5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮是一种呋喃类的衍生物，CASNo.：14300-72-2，CA名称2(5H)-Furanone，-5-hydroxy-3，5-dimethyl，分子式C6H8O3，分子量128.21，结构式如下：
国内外文献检索表明，5-甲基-3-呋喃羧酸常被用作有机合成的前体，但未见有关活性和天然来源的报道，也未见5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮用于制备杀线虫制剂应用的公开文献报道。
发明内容：
本发明的目的是提供5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮及其在制备杀线虫制剂中的应用。
本发明是这样实现的：
本发明使用的真菌是毛头鬼伞(Coprinus comatus LHA-7)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.0932。
毛头鬼伞属担子菌，主要形态特征是子实体较大。菌盖呈圆柱形，当开伞后限快边缘菌褶溶化成墨汁状液体。菌盖直径3-5cm，高达9-11cm，表面褐色至浅褐色，并随着菌盖长大而断裂成较大型鳞片。菌肉白色。菌柄白色较细长，圆柱形且向下渐粗，长7-25cm，粗1-2cm，光滑，椭圆形12.5-16×7.5-9μm。具囊体，无色，棒状顶部钝圆24-60×10-12.3μm。菌丝无色，具明显锁状联合。
本发明将毛头鬼伞(Coprinus comatus LHA-7)通过常规发酵培养，将发酵液低压浓缩后，用甲醇提取。将甲醇提取物经反复硅胶柱，氯仿/甲醇洗脱，得到本发明的化合物，化合物经核磁共振波谱，质谱，红外光谱和紫外光谱确定为5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮，结构式依次为：
5-甲基-3-呋喃羧酸 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮
实验表明：5-甲基-3-呋喃羧酸具有显著的毒杀腐生线虫和花生根结线虫的活性，对腐生线虫的ED50(半致死率)为125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为500ppm。对花生根结线虫的ED50(半致死率)为125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为250ppm。5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对腐生线虫的ED50(半致死率)为250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为500ppm。对花生根结线虫的ED50(半致死率)为250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)为500ppm。
本发明将从Coprinus comatus LHA-7中用现有方法分离得到的5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮作为制备杀线虫制剂的应用。
本发明亦可将0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亚砜，再用Tween-20水溶液稀释，得具杀线虫活性物质的乳浊液；乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％；该乳浊液作为制备杀线虫制剂的应用。
本发明与现有的杀植物寄生线虫药相比，具有高效、低毒及低残留等优点。
具体实施方式：
本发明化合物的发酵生产方法：
1、将LHA-7的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，20-30℃下培养4-8天，获得试管种；
2、将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)液体培养基中，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，自然pH。培养温度20-30℃；摇床培养，转速为100-300rpm；培养时间4-12天。
3、将含菌丝的发酵液将发酵液低压浓缩后，用甲醇反复溶解，把溶解物合并低压浓缩后得甲醇提取物。用甲醇溶解提取物上样，经正相硅胶柱层析，氯仿反复洗脱。活性跟踪检测所分离到的组分，将具有活性的部分合并低压浓缩，经反复硅胶柱层析，氯仿/甲醇洗脱，洗脱液经活性检测，活性部分经TLC检测(展开剂：氯仿∶甲醇5∶1；硫酸显色)，将只具有同一个单点的部位合并得到化合物5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮。
本发明化合物对植物寄生线虫的药效试验：
1、试验用药剂：
将化合物溶于少量二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释为适用浓度，二甲亚砜的终浓度不超过3％。
将未接种的发酵培养基低压浓缩后，用甲醇提取。将甲醇提取物浓缩后用二甲亚砜溶解，再用无菌蒸馏水稀释为适用浓度作为对照。
2、制备试验用线虫
(1)制备Panagrellus redivivus线虫
将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。
(2)花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)的培养
将温室培养的带有花生根结线虫的蕃茄根用无菌水洗净，用解剖针挑取根结线虫的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml离心管中依次用4ml无菌水(三次)、1ml无菌青-链霉素双抗溶液、3ml 0.1％的NaClO溶液洗涤和消毒，每一步骤均通过短暂离心(8000转30秒)除去上清液。洗涤好的虫卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小时，二龄幼虫用移液器收集于1.5ml离心管，通过短暂离心(5000转30秒)富集备用。
3、试验方法
将本发明化合物稀释为不同浓度供试药液，将药液200μl于20孔板中，加入活线虫100-150条，置于25℃下，分别于4小时、12小时、24小时在光学显微镜下检查计算线虫的死亡率。
鉴定死亡的方法为：在处理板孔中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
死亡率％＝(死亡线虫数/(死亡线虫数+存活线虫数))×100％
校正死亡率％＝样品死亡率-对照死亡率
实施例1：化合物对线虫的毒杀作用
将0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释为500ppm溶液，二甲亚砜的终浓度不超过3％。
按上述试验方法进行药效试验。列表所示为校正死亡率。
表15-甲基-3-呋喃羧酸对P.redivivus线虫的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
1 35.3％ 81.1％ 100％
2 43.7％ 82.8％ 100％
3 52.1％ 98.3％ 100％
结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液对P.redivivus线虫的致死率在12小时达到80％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
表2 5-甲基-3-呋喃羧酸对M.arenaria线虫的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
l 40.7％ 90.7％ 100％
2 48.8％ 93.5％ 100％
3 53.6％ 88.9％ 100％
结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液对M.arenaria线虫的致死率在12小时达到90％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
表3 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对P.redivivus线虫的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
1 45.2％ 87.1％ 100％
2 33.1％ 72.4％ 100％
3 42.1％ 78.3％ 100％
结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液对P.redivivus线虫的致死率在12小时达到70％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
表4 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对M.arenaria线虫的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
1 52.1％ 91.1％ 100％
2 55.4％ 92.5％ 100％
3 52.2％ 91.0％ 100％
结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液对M.arenaria线虫的致死率在12小时达到90％以上，24小时达到100％。具有明显的杀线虫活性。
实施例2：化合物对线虫的半致死率ED50
实施例2方法同实施例1，不同之处为：将2.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亚砜，配制为1000ppm的水溶液，随后倍半稀释，测定ED50(半致死率)和ED90(90％致死率)，待测溶液中二甲亚砜的终浓度不超过3％。
表5 5-甲基-3-呋喃羧酸对P.redivivus线虫的ED50和ED90
浓度ppm 4小时 12小时 24小时
1000 86.5％ 97.3％ 100％
500 78.8％ 92.1％ 100％
250 67.9％ 75.4％ 89.6％
125 45.8％ 60.7％ 83.4％
60 9.34％ 11.3％ 18.2％
30 7.90％ 15.6％ 17.6％
15 6.86％ 10.8％ 17.3％
表6 5-甲基-3-呋喃羧酸对M.arenaria线虫的ED50和ED90
浓度ppm 4小时 12小时 24小时
1000 81.7％ 97.7％ 100％
500 68.6％ 87.8％ 100％
250 51.5％ 86.5％ 98.8％
125 23.5％ 45.7％ 64.2％
60 21.6％ 31.3％ 45.5％
30 11.7％ 12.8％ 20.9％
15 10.7％ 13.5％ 15.6％
结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸对M.arenaria线虫的ED50(半致死率，24hr)为125ppm，ED90(90％致死率，24hr)为250ppm。
表7 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对P.redivivus线虫的ED50和ED90
浓度ppm 4小时 12小时 24小时
1000 71.2％ 89.4％ 100％
500 60.8％ 76.6％ 100％
250 47.2％ 55.4％ 72.1％
125 33.3％ 40.7％ 46.9％
60 11.2％ 12.1％ 27.6％
30 9.08％ 15.6％ 19.5％
15 10.1％ 12.55 18.7％
结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对P.redivivus线虫的ED50(半致死率，24hr)为250ppm，ED90(90％致死率，24hr)为500pm。
表8 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对M.arenaria线虫的ED50和ED90
浓度ppm 4小时 12小时 24小时
1000 76.5％ 97.3％ 100％
500 72.1％ 82.1％ 100％
250 65.8％ 65.4％ 70.8％
125 34.8％ 47.7％ 49.4％
60 19.2％ 28.3％ 33.9％
30 11.9％ 16.6％ 28.9％
15 11.2％ 10.8％ 17.3％
结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮对M.arenaria线虫的ED50(半致死率，24hr)为250ppm，ED90(90％致死率，24hr)为500ppm。
实施例3：化合物与乳化剂混合对线虫的毒杀作用
实施例3方法同实施例1，不同之处为：将0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亚砜，再用0.3％浓度的Tween-20水溶液稀释，稀释浓度为500ppm，得具杀线虫活性物质的乳浊液。在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
表9 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制剂对P.redivivus线虫的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
1 52.5％ 99.8％ 100％
2 62.4％ 98.4％ 100％
3 58.6％ 97.8％ 100％
结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸与乳化剂混合后可以提高毒杀P.redivivus线虫活性，提高率为12-20％。
表10 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制剂对M.arenaria线虫的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
1 61.3％ 99.0％ 100％
2 62.4％ 98.7％ 100％
3 65.8％ 96.7％ 100％
结果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸与乳化剂混合后可以提高毒杀M.arenaria线虫活性，提高率为7-10％。
表11 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制剂对P.redivivus的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
1 51.3 82.4 100
2 52.2 91.2 100
3 57.6 80.7 100
结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮与乳化剂混合后可以提高毒杀P.redivivus线虫活性，提高率为7-10％。
表12 5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制剂对M.arenaria的毒杀作用
重复次数 4小时 12小时 24小时
1 72.3 98.5 100
2 65.2 91.2 100
3 68.4 95.8 100
结果表明，5-羟基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮与乳化剂混合后可以提高毒杀M.arenaria线虫活性，提高率为4-6％。