余甘子提取物作为烟草制品自由基清除剂的用途及相应烟草制品 所属技术领域
本发明属植物天然提取物在烟草制品制造业中的应用。
背景技术
人们抽吸烟草制品燃烧所产生的烟气，但烟气中存在细胞毒素分子的自由基。这些细胞毒素分子在吸烟者体内诱发癌症，特别是肺癌。开发生产低自由基的安全型烟草制品，是近年来烟草制品工业的重要研发方向。
余甘子为大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实。新鲜果实呈棕褐色至墨绿色，球形或扁球形，性味甘、酸、涩、凉，可入药。目前的人工栽培及野生余甘子果实都用作为食品加工原料。余甘子提取物成分较复杂，含多糖、多酚类、咖啡碱、SOD、维生素C等多种生物活性物质，可提取没食子酸及超氧化物歧化酶(SOD)。有人对其抗氧化、抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤、降血脂、降胆固醇、降血液粘稠性及改善胃肠消化功能等进行了一些探索性实验研究，可见以下文献的报道：《云南热作科技》，1999，2：23～25；《药学进展》，2001，4：12～13；《武汉工业学院学报》，2000，2：13～15；《贵阳中医学院学报》，2002，24(2)：50～51。但将余甘子提取物作为烟草制品抽吸中的自由基清除剂，至今未见文献报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供余甘子的新用途和按该用途所获得的产品，即提供余甘子提取物作为烟草制品自由基清除剂地用途及相应烟草制品，以发挥天然植物资源的区域优势，满足卷烟工业开发低自由基安全型卷烟的迫切需要。
本专利申请人首先就提取分离得到的余甘子提取物进行抗自由基性能分析，并对其在降低香烟烟气自由基中的应用进行了研究。
余甘子提取物进行抗自由基性能的试验分析情况如下。
仪器及试剂：
Bruker-EMX6/1顺磁共振仪ESR(德国Bruker公司)。
752型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂).
自由基发生剂：DPPH(1.1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)，日本东京化成株式会社生产，A.R.
余甘子：购自昆明市场。
一、余甘子提取物抗自由基性能ESR分析
余甘子提取物的获得：市场购入的新鲜余甘子，去核粉碎后称取100g，加入工业乙醇回流提取4h，趁热过滤，提取3次合并滤液。提取液减压回收溶剂得到余甘子提取物。以50％乙醇为溶剂，配制成0.1g/L的余甘子提取物样品液C0。
自由基ESR分析实验条件：顺磁共振仪测试参数：中心磁场＝3.385T，扫宽＝0.500T，微波频率＝1.5GHz；扫描时间＝2min，扫描次数＝1，放大倍数＝2.5×104，样品用量＝20μL。
对照空白及测试样制备：0.000 001mo/L DPPH溶液，以无水乙醇为溶剂配成，为空白对照样；往0.000 001mol/L DPPH溶液，再加入余甘子提取物样品液C0，使余甘子提取物样品液质量浓度为0.0001g/L，充分混匀，为测试样。
用顺磁共振仪分析测试抗自由基性能，得到顺磁共振图谱(EPR)。
二、余甘子提取物抗自由基性能DPPH分光光度法分析
实验条件：经实验确定DPPH的最大吸收波长为520nm，余甘子提取物样品液在此实验条件下几乎无色，对DPPH的测量峰520nm形不成干扰，实验选用520nm作为测定波长。实验发现，在pH6.88缓冲介质中，DPPH自由基显紫红色，改变缓冲溶液用量，DPPH溶液吸光度基本不发生变化，实验选用pH6.88的近中性缓冲溶液。由于提取物样品与DPPH的反应极快，1min内便能完成85％的反应度。反应5min后吸光度基本不变。实验选取10min为反应时间。DPPH对温度不敏感，实验选用在室温下反应。
实验方法：100g/L的余甘子提取物样品溶液：以50％乙醇配制。往10mL比色管中依次加入4mL pH6.88标准磷酸盐缓冲溶液，4mL 0.000 1777mol/L DPPH溶液，混匀，再加入一定量余甘子提取物样品液，蒸馏水补充体积至10.00mL刻度，充分混匀，10min后在520nm处测吸光度。
定义余甘子对DPPH自由基的清除率K＝[1-(Ai-Aj)/Ac×100％，
式中：Ai-加余甘子反应后DPPH溶液吸光度；
Aj-未加DPPH，只加余甘子及水的溶液的吸光度；
Ac-未加余甘子，只加DPPH及水的溶液的吸光度。
根据K可比较余甘子提取物的抗自由基性能。
三、实验结果及分析
1、ESR法
由于DPPH可产生长寿命自由基，在此作为自由基发生剂并作为空白对照物进行ESR检测。经添加余甘于提取物后，由于其抗自由基作用而使DPPH产生的自由基数量减少。自由基相对含量变化可以反映出余甘子提取物的抗自由基性能。对比进行ESR检测得到的图谱见图1。
根据测量图谱峰高(mm)，可以比较余甘子提取物样品液的自由基的清除率。
Ar＝(H对照-H测试)/H对照
(48.6-21.9)/48.6＝0.549＝54.9％
电子顺磁共振(EPR或ESR)是唯一可直接检测自由基信号的方法。主要用来研究具有未成对电子结构的自由基、原子、分子(包括三线态分子)，其灵敏度比NMR高230倍(理论值)，且不会对自由基产生破坏作用，是目前自由基检测的首选方法。本实验以DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，C18H12N5O6)为自由基发生物，在试样条件下加入余甘子物样品，检测DPPH产生的DPPH自由基信号及加入余甘子提取物样品后DPPH自由基减少后的信号。根据谱峰高度的相对变化，可以估算自由基数量的变化，反映余甘子抗氧化物的自由基清除能力。
根据EPR实验数据可以看出，在以上实验条件下，54.9％的DPPH自由基由于余甘子提取物的作用而减少，说明余甘子提取物具有较好的自由基清除作用。
2、分光光度法
在现有的抗氧化剂及自由基分析中，一般的做法是人工建立活性氧或自由基的发生体系，然后检测其中产生的自由基，以及抗氧剂或自由基清除剂对所产生自由基的抑制清除行为。实验及研究显示，作为长寿命自由基的DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，C18H12N5O6)，其本身也可作为自由基发生源，并可以与余甘子提取物作用而降低或被清除。而且由于DPPH具有特殊的紫色，在与余甘子提取物作用时可产生褪色效应，因而可利用分光光度法对其进行研究。根据DPPH在520nm处特征吸收的变化，可推知余甘子提取物的抗自由基能力。
按实验方法加入不同体积的余甘子提取物样品液，测出Al、Aj、Ac，据此再计算出其相应的自由基清除率K，结果见图2。
从图2可知，余甘子提取物具备清除DPPH自由基的能力，其清除DPPH自由基的能力与提取物用量均呈量效关系：随着余甘子提取物用量的增加，其降低的DPPH自由基也越多。
余甘子提取物具有明显的自由基清除作用。在相同条件下，余甘子提取物对自由基的清除率与其使用的浓度呈正相关。但当其浓度达到一定时，其效果增加即不再明显。在以上实验方法下，余甘子提取物的自由基清除率在30％-80％之间不同。
根据试验研究结果，得到本发明如下：
本发明中用途发明的技术方案是：将余甘子的提取物用作为烟草制品抽吸中的自由基清除剂。所说的烟草制品可以是卷烟，也可以是雪茄烟或烟斗烟丝。若为卷烟，则余甘子的提取物可以加入卷烟的烟丝中，也可以加入卷烟的过滤嘴中。
所加入的余甘子提取物，可以是多种成分混合状态下的提取物，也可以是从多种成分混合状态下的提取物中分离出的一种提取物或一种以上提取物的混合物。
获得余甘子提取物的途径有多种，例如可通过极性溶剂如醇或含水醇类溶剂提取来获得。用做溶剂的醇尤其是可为乙醇。这种提取物也可通过超临界二氧化碳萃取来获得。当然也可先经极性溶剂提取后再进行超临界二氧化碳萃取来获得。
提取并分离余甘子提取物的成分之方法为现有技术，其报道可见许多公开出版物。
若将余甘子提取物加入卷烟的烟丝中，可以在卷烟生产的烟丝卷制过程中施行。被加入烟丝中的余甘子提取物，可以占烟丝重量的0.02％～0.06％，优选为占烟丝重量的0.03％～0.05％。可以将余甘子提取物溶于溶剂中，把溶有余甘子提取物的溶剂喷洒在烟丝上，随后蒸发所说溶剂。
本发明的产品，就是按上述余甘子提取物用途发明所获得的烟草制品。
抗氧化剂的抗氧化行为具有一定的选择性。吸烟气相中的自由基的主要成分是烷类和烷氧类自由基。要有效清除烟气中的自由基，所选择的抗氧化剂应具有多面性，即具有清除多种自由基的能力。专利申请人的一系列试验研究结果表明，加入的余甘子提取物在烟草制品抽吸时能有效地清除烟气中的自由基，即余甘子提取物符合清除烟草中自由基的要求。加入余甘子提取物的烟草制品与未加入的相比，前者烟气中细胞毒素自由基的分子，无论是气相还是粒相，都能被显著降低。
本发明的有益效果是，为余甘子发掘了新的保健用途，开辟了一个新的应用领域。余甘子提取物作为烟草制品自由基清除剂，效果明显，对开发低毒害、低自由基的安全型烟草制品有很好的应用前景。
【附图说明】
图1为余甘子提取物对对照物DPPH自由基的影响ESR图谱。
图2为余甘子提取物抗自由基的分光光度法分析结果。
下面由实施例对本发明做进一步的说明，但发明的范围不受所举实施例的局限。
【具体实施方式】
见如下的实施例。
(一)提取物的制备
市场购入的新鲜余甘子，去核粉碎后加入工业乙醇回流提取4h，趁热过滤，提取3次合并滤液.提取液减压回收溶剂得到余甘子提取物。
(二)向卷烟的烟丝中加入余甘子提取物
将提取物于卷烟生产的烟丝卷制过程中加入烟丝。被加入烟丝中的余甘子提取物，占烟丝重量的0.04％。具体方法是先把余甘子的上述提取物溶于乙醇中，把溶有余甘子提取物的乙醇均匀喷洒在烟丝上，随后乙醇被蒸发掉。烟丝经卷烟机卷制成检测样品香烟。
(三)卷烟烟气中自由基的清除效果
自由基的检测有多种已知的方法可以采用，例如电子自旋共振法(ESR)，色谱法，化学发光法，荧光分析法，分光光度法等。用于截留卷烟烟气中气相及粒相自由基的装置之一可见Pryor等人在刊物《Environmengtal Health Perspectives》(1976，vol.16，pp161-175)的报道。
本发明过程中主要采用电子顺磁共振法进行测试，同时也用其他方法，特别是分光光度法，对测试结果做了对照映证，结果相符。所用顺磁共振仪为德国BRUKER公司的BKER-EMX6/1。
1、空白试验
把有机溶剂苯中的气相自由基捕获剂DMPO的浓度调节为20毫摩尔，并使用5支未加有余甘子提取物的卷烟(品牌为“云烟”)进行其烟气中气相和粒相自由基的捕获，然后用ESR进行自由基测定。ESR仪器参数：CF：3385G，SW：200G，MA：1G，SP：20MV。测定参数：扫描5次，放大倍数：5×105。放大倍数可视样品自由基含量多少进行调整。平行测定5次，计算5次的平均值。
2、清除试验
使用5支加有余甘子提取物的卷烟(品牌为“云烟”)进行其烟气中气相和粒相自由基的捕获，重复上述操作。
空白试验和清除试验都用自动记录仪对样品自由基信号峰高进行记录，其峰高与自由基含量成正比，以此进行自由基含量相对大小的比较。
对烟气中粒相自由基含量的降低效果见下表：编号 1 2 3 4 5空白样品ESR峰高/cm 6.6 7.0 9.0 7.8 7.6检验样品ESR峰高/cm 5.5 6.3 6.4 7.0 6.3峰高降低率/％ 16.7 10.0 28.9 10.3 16.5
从上表可以看出，由于样品香烟卷制上的不均匀性，余甘子提取物降低香烟烟气中粒相自由基的比例在10.0～28.9％之间，平均值为16.5％。
试验结果还表明，余甘子提取物降低香烟烟气中气相自由基的比例平均值为20.8％。