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用作治疗剂的大环前药化合物
    相关申请的交叉引用
     本申请要求 2008 年 2 月 21 日提交的标题为 “Macrocyclic Prodrug Compounds Useful as Therapeutics” 的美国临时专利申请 61/030,446 的优先权，其内容为了所有目的 整体援引加入本文。 本申请还与 2007 年 8 月 10 日提交的标题为 “Macrocyclic Compounds Useful as Inhibitors of Kinase and HSP90” 的国际申请 PCT/US2007/017754 和美国序列 号 11/891,652，和 2007 年 8 月 10 日提交的标题为 “Treatment of Neurofibromatosis with Radicicol and its Derivatives”的国际申请 PCT/US2007/075739，以及 2009 年 1 月 15 日提 交的标题为 “Synthesis of Resorcylic Acid Lactones Useful as Therapeutic Agents” 的国际申 请 PCT/US2009/031149 相关，其内容为了所有目的整体援引加入本文。
     发明领域
     本发明涉及天然产物根赤壳菌素和 pochonin 的新的衍生物、类似物和中间体的 前药，以及它们的合成。 本发明进一步涉及这些化合物在包括自身免疫疾病、炎性疾 病、神经疾病或神经变性疾病、癌症、心血管疾病、变态反应、哮喘、与激素相关的疾 病，以及由神经纤维瘤病导致的肿瘤或症状在内的多种疾病的治疗中的用途。
     发明背景
     在 20 世纪 50 年代中期，已发现磷酸化可以通过催化磷酸化的蛋白激酶或通过涉 及脱磷酸化步骤的蛋白磷酸酶可逆地改变酶的功能。 这些反应在调节许多细胞过程 ( 特 别是信号转导途径 ) 中起重要作用。 在 20 世纪 70 年代后期，发现劳氏肉瘤病毒 (v-Src) 转化因子是蛋白激酶，而且也发现肿瘤促进佛波醇酯是蛋白激酶 C 的有效激活剂，这揭 示了首次了解的疾病和异常蛋白质磷酸化之间的联系。 从那以后，已经发现转导机理 的缺陷引起许多致癌过程并且在糖尿病、炎性病症和心血管疾病中起作用 (T.Hunter， Cell，100 ：113-127(2000) ；P.Cohen，Nat.Rev.Drug Discov.，1 ：309(2002))。 因此，选 择性的激酶和磷酸酶抑制剂已呈现为重要的药物靶，并且抑制激酶磷酸化活性是化学疗 法的最有希望的策略之一。 已经批准了三种激酶抑制剂药物 ：Gleevec( 其抑制 Ab1) 以 及 Iressa 和 Tarceva( 后两者均抑制 EGFR)。
     通过丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的激酶介导的磷酸化或磷酸酶介导的去 磷 酸 化 来 调 节 蛋 白 质 活 性 是 大 多 数 信 号 转 导 机 理 的 核 心。 (T.Hunter， Cell，100 ： 113(2000))。 小分子抑制剂 ( 例如 6- 二甲基氨基嘌呤和星状孢子素 ) 有助于阐明这样的 磷酸化机理的重要性，并且阐明激酶的生物功能。 激酶以 0.1-10μM 的 Km 结合于 ATP，
     并将 γ- 磷酸酯基团选择性地转移至给定蛋白质的特定残基。 激酶的核心结构域由所述 ATP 结合位点和涉及磷酸转移反应的残基组成，在整个激酶组中高度保守。 (G.Manning 等人， Science，298 ：1912(2002))。 这导致了以下推测 ：针对该高度保守的 ATP 结 合袋的抑制剂不仅必须与以高浓度 (mM) 存在的 ATP 竞争，而且必将缺乏选择性。 修 饰的嘌呤 ( 例如 (R)- 细胞周期蛋白依赖激酶 ) 是强效并具有相当选择性的抑制剂的发 现 (L.Meijer 和 E.Raymond， Acc.Chem.Res.，36 ：417(2003)) 驳斥了那种观点并且激发 了合成围绕嘌呤骨架的组合库 (Y.T.Chang 等人， Chem.Biol.，6 ：361(1999) ；S.Ding 等 人， J.Am.Chem.Soc.，124 ：1594(2002))，获得了重要的先导物 (lead)(N.S.Gray 等人， Sciences，281 ：533(1998) ；M.Knockaert 等人， Chem.Biol.，7 ：411(2000))。
     在这方面也已研究了大环二羟基苯甲酸内酯。 这类化合物的原型是根赤壳菌素 和相关的 pochonin，它们是从麦角菌目丝孢菌普可尼亚属 (clavicipitaceous hyphomycetePochonia genus)，例如厚垣孢普可尼亚菌 (Pochonia chlamydosporia) 变异链状菌株 P0297 的培养物中分离的次级代谢物的结构相关的组。 参见例如 V.Hellwig 等人， J.Natural Prod.，66(6) ：829-837(2003)。 制备根赤壳菌素的卤代醇和肟衍生物并评估它们的 v-src 酪氨酸激酶抑制、抗增殖和抗肿瘤的体外活性 (T.Agatsuma 等人， Bioorg.& Med.Chem.， 10(11) ：3445-3454(2002)。
     像激酶一样，热激蛋白质 (HSP) 与 ATP 相互作用，并且是控制疾病的重要靶， 然而它们具有不同的机理效应。 接触应激 ( 例如热、缺氧或酸中毒 ) 后，大多数组织中 的细胞立即迅速增加 HSP 的产生速率。 目前认为热 HSP 是分子伴侣，即它们防止不合适 的缔合并且帮助正确地折叠统称为客户 (client) 和底物的其它分子蛋白质。 还发现 HSP 与肿瘤和其它病理生理学状态有关。 事实上，伴侣蛋白通过促进对细胞内部变化的耐受 性进而促进肿瘤细胞在应激环境中的存活。 HSP 是普遍存在的，在物种中高度保守，并 且通常按照分子量分为以下主要的家族 ：HSP100、 HSP90、 HSP70、 HSP60 和小 HSP。 这些家族具有结构和功能差异，但是它们在蛋白质折叠的不同阶段协同工作。 HSP90 受 到了特别的关注，因为它与许多类型的信号分子 ( 例如 v-Src 和 Raf) 有关，所述信号分子 在恶性转化和转移发展中起重要作用。 因此，期望 HSP90 抑制剂用于设计化学治疗，并 且还用于阐述复杂信号网络中的相互作用。
     热激蛋白质 90(Hsp90) 是普遍存在的伴侣蛋白，其维持许多 “客户” 蛋白的 合 适 的 构 象 ( 参 见 Kamal 等 人， Trends Mol.Med.2004，10，283-290 ；Dymock 等 人， Expert Opin.Ther.Patents 2004，14，837-847 ；Isaacs 等人， Cancer Cell，2003，3，213 ； Maloney 等人，Expert Opin.Biol.Ther.2002，2，3-24 和 Richter 等人，J.Cell.Physiol.2001， 188，281-290) 并且参与折叠、活化和装配大范围的蛋白质，包括涉及信号转导、细胞 周期控制和转录调节的关键蛋白质。 研究人员已经报道了 HSP90 伴侣蛋白与重要的信 号蛋白有关，所述重要的信号蛋白诸如类固醇激素受体和蛋白激酶，包括例如 Raf-1、 EGFR、 v-Src 家 族 激 酶、 Cdk4 和 ErbB-2(Buchner， TIBS，1999，24，136-141 ； Stepanova 等 人， Genes Dev.1996，10，1491-502 ；Dai 等 人， J.Biol.Chem.1996，271， 22030-4)。 研究进一步指示某些辅陪伴蛋白 (co-chaperone)( 例如 Hsp70、 p60/Hop/ Stil、 Hip、 Bag1、 HSP40/Hdj2/Hsj1、 抑 免 蛋 白、 p23 和 p50) 可 促 进 HSP90 的 功 能 ( 参见例如 Caplan， Trends in Cell Biol.，1999，9，262-268)。 抑制 Hsp90 引起这些客 户蛋白质采用异常构象，并且这些异常折叠的蛋白质由细胞经泛素化 (ubiquitinylation) 和蛋白酶体降解迅速消除。 有趣的是， Hsp90 客户蛋白的列表包括一系列众人皆知的 致癌基因。 它们中的四种是临床验证的癌症靶 ：HER-2/neu( ( 曲妥著单 抗 ))、 Bcr-Abl( ( 甲磺酸伊马替尼 ))、雌激素受体 ( 他莫昔芬 ) 和雄激素 受体 ( ( 比卡鲁胺 ))，而其它基因在癌症的产生中起重要的作用。 一些最 敏感的 Hsp90 客户涉及生长信号 (Raf-1、 Akt、 cdk4、 Src、 Bcr-Abl 等 )。 相比之下， 似乎很少有肿瘤抑制基因 ( 如果有 ) 是 Hsp90 的客户 ( 客户蛋白的列表参见 Pratt 等人， Exp.Biol.Med.2003，228，111-133 ；Workman 等 人 Cancer Lett.2004，206，149-157 和 Zhang 等人， J.Mol.Med.2004，82，488-499)，因此抑制 Hsp90 具有全面的抗增殖效应。 此外，一些客户蛋白涉及肿瘤发生的其它基本过程，即凋亡逃逸 (apoptosis evasion)( 例 如 Apaf-1、 RIP、 Akt)、永生性 (immortality)( 例如 hTert)、血管发生 ( 例如 VEGFR、Flt-3、 FAK、 HIF-1) 和转移 (c-Met)。
     然而，药用的 HSP 抑制剂必须是选择性的，因为 HSP 还起到构造 (constructive) 作用。 在非应激条件下， HSP90 是存在于真核细胞中的最大量的蛋白质之一，代表总细 胞蛋白质含量的 1-2％，并且当细胞受到应激时仅增加约两倍。 当与天然客户结合时， HSP90 主管例如折叠新生多肽、跨膜转运蛋白质以及正常的蛋白质周转。 此外， HSP90 在翻译后调节信号分子中起关键作用，导致它们的活化。 HSP90 很少单独起作用，而是 与伴侣蛋白 HSP70、辅陪伴蛋白 (HSP40、 CDC37/p50、 AHA1、 p23) 和辅助蛋白一起工 作。
     HSP90 的许多客户蛋白在生长控制、细胞存活和发育过程中起关键作用，且已 知那些客户包括受体酪氨酸激酶、丝氨酸 / 苏氨酸激酶、类固醇激素受体、转录因子和 端粒末端转移酶。 客户的致癌突变体也是客户自身，只是对 HSP90 的功能具有更高的 需求，例如突变体 v-SRC 酪氨酸激酶需要从蛋白质的 HSP90 协同装配中得到更强的蛋 白质折叠能力 (Y.Xu 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96 ：109(1999) ；H.Oppermann 等 人，同上，78 ：1067(1981) ；L.Whitesell 等人，同上，91 ：8324(1994)。 同样，肿瘤抑 制蛋白 p53 的突变导致发现于人类癌症中的最普遍的分子遗传缺陷，并且大多数 p53 突 变表现出与 HSP90 的扩大的相互作用 ( 可能由于异常构象 )，这防止了它们通常的泛素 化和随后被蛋白酶体降解 (M.V.Blagosklonny 等人，同上，93 ：8379(1996))。 然而， 尽管有 HSP90 客户的普遍参与，但是它们大多数是前生长信号蛋白 (pro-growth signaling protein)，并且其伴侣蛋白功能在肿瘤发生期间被破坏，这导致恶性转化的产生以及所转 化表型的维持。
     除了抗癌和抗肿瘤形成 (antitumorgenic) 活性外， HSP90 抑制剂还涉及许多其它 应用，包括用作抗炎剂、抗传染病剂、治疗自身免疫的药剂、治疗缺血的药剂和用于促 进神经再生的药剂 ( 参见例如 Rosen 等人， WO02/09696 ；PCT/US01/23640 ；Degranco 等人， WO 99/51223 ；PCT/US99/07242 ；Gold，美国专利第 6,210,974B1 号 )。 文献 报道了纤维形成病症 ( 包括但不限于硬皮病、多肌炎、全身性狼疮 (systemic lupus)、类 风湿关节炎、肝硬化、瘢痕形成、间质性肾炎和肺纤维化 ) 是可治疗的 (Strehlow， WO 02/02123 ；PCT/US01/20578)。
     因此，安沙霉素类和其它 HSP90 抑制剂对治疗和 / 或预防许多类型的病症是很 有前途的。 然而，许多天然产物衍生的 Hsp90 抑制剂表现出药学上的缺陷 ；它们的相 对不溶性使它们难以配制和给药，并且它们不容易合成，而且目前必须 ( 至少部分地 ) 通过发酵生产。 此外，安沙霉素的剂量限制毒性为肝毒性。 例如半合成抑制剂 17- 烯 丙基氨基，17- 去甲氧基 - 格尔德霉素 (17-AAG)，目前在 II 期临床试验中，其造价昂 贵，配制困难 (NCI 临床方案由注射 17-AAG 的 DMSO 溶液组成 )，且目前只能肠胃外 给药。 尽管 17- 二甲基氨基乙基氨基类似物 (17-DMAG) 更加易溶，但它表现出所有 17-AAG 的副作用，并且在临床前毒性研究中出现胃肠出血 (Glaze 等人，Proc.Am.Assoc. Cancer.Res.2003，44，162-162 和 Eiseman 等人，Cancer Chemother.Pharmacol.2005，55， 21-32)。 另一种天然产物 Hsp90 抑制剂——根赤壳菌素 (RC) 的水溶性差，并且在肿瘤 异种移植中没有活性。 根赤壳菌素的半合成肟衍生物提供较好的溶解性并且大大改善了 鼠科模型中的药理学特征，但是仍然仅限于静脉内给药 (Ikuina 等人，J.Med.Chem.2003，46，2534-2541)。 此外，根赤壳菌素和其肟含有被视为对稳定性和毒性负责的环氧乙 烷环，这促进了环丙根赤壳菌素 (cycloproparadicicol) 的合成 ：Yang 等人， J.Am.Chem. Soc.2004，126，7881 和 2003，125，9602-9603)。 尽管安沙霉素类具有潜力，但因此需 要替代的 HSP90 抑制剂。
     已经寻找 Hsp90 的全合成口服活性抑制剂，以便提供更加灵活的给药方案选 择，并且可能避免天然产物抑制剂的副反应。 Chiosis 等人描述了嘌呤类似物的设计和合 成，所述嘌呤类似物模拟格尔德霉素和其它安沙霉素类结合 HSP90 的 ATP 结合袋并因此 抑制 HSP90 的能力。 参见国际专利申请 PCT/US01/46303(WO 02/36075 ；Chemistry & Biology 8 ：289-299(2001))。 Chiosis 等人描述的具体化合物包括在 3、4 和 5 位取代的 三甲氧苄基实体。 使用凝胶结合测定，证明这些化合物结合 HSP90 比 17-AAG 低近 20 倍。
     最近，已经报道了其它新的非天然产物 Hsp90 抑制剂 ( 例如 PU3 和 CCT018159 ； 参 见 Chiosis 等 人， Bioorg.Med.Chem.Lett.2002，10，3555-3564 ；Vilenchik 等 人， Chem.Biol.2004，11，787-797 ；Chiosis 等 人， WO 0236075，2002 ；Drysdale 等 人， WO 03/055860A1，2003 ；Wright 等 人， Chem.Biol.2004，11，775-785 ；Dymock 等 人， Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，325-328 ；Dymock 等人， J.Med.Chem.2005，48， 4212-4215。 Structure of Hsp90 in complex with PU3 pdb code 1UY6， and with PU24FCl ： pdb code 1UYF 和 Clevenger 等人， Org.Lett.2004，6，4459-4462)。 使用与 ATP、格尔 德霉素或根赤壳菌素复合的 Hsp90 的晶体结构设计这些抑制剂的结构。 将 8- 苄基腺嘌 呤 ( 例如 PU3) 设计成采取与格尔德霉素相同的 C 型构象 (Chiosis 等人， Current Cancer Drug Targets，2003，3，371-376)，其具有指向腺嘌呤结合位点 ( 铰链区 ) 的腺嘌呤环， 以及模拟格尔德霉素醌环的 H 键接受性质的三甲氧基苯环。 (PU3 的苯环没有设计成 具有与格尔德霉素的醌环完全相同的方向。 而是将所述三甲氧基苯基团设计成指向相 同的一般方向，并且与 Lys 112( 与格尔德霉素的醌环形成氢键的氨基酸 ) 形成氢键。 ) 最近获得的与 PU3 复合的 Hsp90 的晶体结构确认了嘌呤环占据一般由 ADP/ATP 占据 的位置，但是苯环指向与预期方向相反的方向，以形成与 Phe138 的 r- 堆积相互作用 (r-stacking interaction)。 然而，PU3 抑制 Hsp90(HER-2 降解测定，HER-2IC50 ＝ 40μM) 并提供用于进一步优化的有价值的起始点。 基于 PU3 的结构活性研究导致更具活性的 PU24FCl(HER-2IC50 ＝ 1.7μM)， 其 随 后 还 与 Hsp90 共 结 晶。 当 PU24FCl 在 DMSO/ EtOH/ 磷酸盐缓冲盐水 1 ∶ 1 ∶ 1 中配制并向荷有 (bearing)MCF-7 异种移植肿瘤的小鼠 腹膜内给药时，它在 100-300mg/kg 时诱导 HER-2 和 Raf-1 的下调 ( 一种与 Hsp90 抑制一 致的药效学应答 )，并且在 200mg/kg 时它显著抑制了肿瘤生长。 当口服给药时，需要非 常高剂量 (500-1000mg/kg) 的 PU24FCl 才能观察到类似的药效学应答，并且未报道 8- 苄 基腺嘌呤通过口服途径抑制肿瘤生长。 在我们手中，证实了 PU24FCl 过于难溶以至于不 能有效地配制和口服递送。 目前为止，尽管大量的 SAR 研究改善了效力和药学性质，但 是还未证明当口服给药时，Hsp90 抑制剂在人类癌症的动物模型 ( 异种移植物 ) 中具有活 性。
     8- 苄 基 腺 嘌 呤 的 发 现 导 致 8- 硫 烷 基 腺 嘌 呤 的 设 计 (Kasibhatla 等 人， WO 3037860 ， 2003 和 Llauger 等 人， J.Med.Chem. 2005 ， 48 ， 2892-2905) ， 以8-(2- 碘 -5- 甲氧基 - 苯基硫烷基 )-9- 戊 -4- 炔基 -9H- 嘌呤 -6- 基胺为例，其在几种基 于细胞的测定中显示出优异的效能，但是在水中溶解性差，并且在临床可接受的制剂中 没有足够的口服生物利用度。
     当抑制 HSP90 时，其客户被降解，即未折叠的蛋白质被泛素化，随后是蛋白酶 体介导的水解。 到目前为止，大多数报道的抑制剂结合于 N 端的结构域 ( 见下文 )，但 是报道了一些抑制剂与 C 端结构域相互作用 ；HSP90 在两个部位都具有 ATP 结合位点。 不完全清楚 HSP90 的 C 端功能，但是化合物在该结构域相互作用明显地损害了 HSP90 功 能并且具有抗癌效应。 已发现一些二羟基苯甲酸内酯抑制 HSP90，因此天然产物根赤壳 菌素和格尔德霉素 ( 分别见 P.Delmotte 和 J.Delmotte-Plaquee， Nature(London)，171 ： 344(1953) ；和 C.DeBoer 等人，J Antibiot(Tokyo)，23 ：442(1970)) 被证明抑制表达活化 的 Src 的细胞的转化表型 (H.J.Kwon 等人， Cancer Research，52 ：6926(1992) ；Y.Uehara 等人， Virology，164 ：294(1988))。 已报道相关的化合物 ( 例如除莠霉素 ) 具有类似的 效应 (S.Omura 等人， J Antibiot(Tokyo)，32 ：255(1979)。
     在这方面研究的其它二羟基苯甲酸内酯 (RAL) 包括 17- 烯丙基氨基 -17- 去甲氧 基格尔德霉素 (17AAG)(D.B.Solit 等人， Clin.Cancer Res.，8 ：986(2002) ；L.R.Kelland 等 人， J.Natl.Cancer Inst.，91 ：1940(1999)) ；17DMAG(J.L.Eiseman 等 人， Cancer Chemother.Pharmacol.，55 ：21-32(2005)) ；IPI-504(J.Ge 等 人， J.Med.Chem.，49 ： 4606(2006) ；肟 衍 生 物 例 如 KF25706(S.Soga 等 人， Cancer Res.，59 ：2931(1999)) 和 KF55823(S.Soga 等人， Cancer Chemotherapy and Pharmacology，48 ：435(2001)) ；以及 Danishefsky 等人的环丙根赤壳菌素 (A.Rivkin 等人，同上，44 ：2838(2005))。 结构相关 的变体包括具有根赤壳菌素的羧基间苯二酚和格尔德霉素的苯醌的嵌合抑制剂 (chimeric inhibitor)(R.C.Clevenger 和 B.S.Blagg，Org.Lett.，6 ：4459(2004) ；G.Shen 和 B.S.Blagg， 同上，7 ：2157(2004) ；G.Shen 等人， J.Org.Chem.，71 ：7618(2006))。
     基于根赤壳菌素的 HSP90 抑制剂HSP90 的嵌合抑制剂
     已经研究嘌呤 ( 例如 PU3)，以便设计适合 HSP90 的 ATP 结合位点的小分子 (G.Chiosis 等 人， Chem Biol 8，289-299(2001) ；G.Chiosis 等 人， Bioorg.Med.Chem.， 10 ：3555(2002) ；L.LLauger 等人，J.Med.Chem.，48 ：2892(2005) ；H.He 等人，同上， 49 ：381(2006) ；M.A.Biamonte 等人，同上，49 ：817(2006))。
     基于嘌呤设计的 HSP90 抑制剂
     最 近 还 报 道 了 吡 唑 (1-35)(M.G.Rowlands 等 人， Anal.Biochem.，327 ： 176(2004) ；B.W.Dymock 等 人， J.Med.Chem.，48 ：4212(2005)) 和 苯 并 噻 唑 硫 - 嘌 呤 (1-36)(L.Zhang 等人， J.Med.Chem.，49 ：5352(2006) 作为这些酶的小分子抑制剂。
     其它类 HSP90 抑制剂
     根赤壳菌素已具有特别意义。 根赤壳菌素 ( 一种 14 元大环内酯，并且也称作 单孢菌素 ) 是 HSP90 的 ATP 结合袋的有效的、高竞争性和高选择性的配体。 HSP90 是 ATP 酶而不是激酶，并且它的 ATP 结合袋具有 Bergerat 折叠 (A.Bergerat 等人， Nature， 386 ：414(1997) ；R.Dutta 和 M.Inouye，Trends Biochem.Sci.，25 ：24(2000))，其与激酶
     的 ATP 结合袋不同 (S.M.Roe 等人， J.Med.Chem.，42 ：260(1999))。 在最初发现后， 出现对根赤壳菌素的药物应用的极大关注。 ( 参见美国专利 6,946,456 和美国专利申请 公 布 2003-0211469、2004-0102458、2005-0074457、2005-0261263、2005-0267087、 2006-0073151、2006-0251574、2006-0269618、2007-0004674 和 2007-0010432)。
     引人注目地，已知一些二羟基苯甲酸 (resorcylic) 大环内酯类 ( 其为根赤壳菌素 的相近类似物 ) 抑制激酶，但不抑制 HSP90。 确实，发现 LL-Z1640-2 是 TAK1 激酶的 有效和选择性的抑制剂，而根赤壳菌素和其它二羟基苯甲酸酯 (resorcylides) 对所述 TAK1 激酶没有活性 (J.Ninomiya-Tsuji 等人， J.Biol.Chem.，278 ：18485(2003) ；P.Rawlins 等 人， Int.J.Immunopharma.，21 ：799(1999) ；K.Takehana 等 人， Biochem.Biophys.Res. Comm.，257 ：19(1999) ；A.Zhao 等 人， J.Antibiotics，52 ：1086(1999))。 密 切 相 关 的 LL-783,227( 其 中 一 个 烯 烃 被 还 原 ) 是 MEK 激 酶 的 有 效 抑 制 剂 (A.Zhao 等 人， J.Antibiotics，52 ：1086(1999))。 发现化合物 F87-2509.04 诱导含有 AU 富集元素 (ARE) 的 mRNA 的降解 (T.Kastelic 等人， Cytokine，8 ：751(1996))，并且发现寄端霉素抑制 Ras 介导的细胞信号 (H.Tanaka 等人， Jap.J.Cancer Res.，90 ：1139(1999))。 我们已经 证明 aigialomycin D 是 CDK 抑制剂 (S.Barluenga 等人， Angew.Chem.， Int.Ed.，46(24) ： 3951(2006))。
     根赤壳菌素的其它相近类似物确实抑制 HSP90。 Pochonin D 是 HSP90 的有 效 抑 制 剂。 (E.Moulin 等 人， J.Am.Chem.Soc.，127(19) ：6999(2005))。 并 且， 已 报 道 pochonin A 是 HSP90 的 90nM 抑 制 剂。 据 发 现 Pochonin C 是 疱 疹 的 解 旋 酶 - 引 发 酶的抑制剂，所述解旋酶 - 引发酶是 ATP 酶而不是激酶 (V.Hellwig 等人， J.Nat.Prod.， 66 ：829(2003))。 虽然根赤壳菌素和 pochonin C 在结构上非常相似，但它们在溶液中 具有非常不同的构象，并且具有不同的生物活性 (S.Barluenga 等人， Chem.Eur.J.，11 ：
     4935(2005)。 因此，看来所述大环的 “松弛 (floppiness)”可能在二羟基苯甲酸大环内酯 间的抑制差异中起到重要的作用，并且在任何情况下使得那些效应难以通过理论方法进 行预测。
     已知一些二羟基苯甲酸大环内酯是激酶或磷酸酶的抑制剂 ( 美国专利 5,674,892、5,728,726、5,731,343 和 5,795,910)，或抑制其它的酶 ( 美国专利 5,710,174，抑 制纤维蛋白交联的 FXIIIa 催化 )。 二羟基苯甲酸大环内酯还用于其它医学适应症 ( 美国 专利 3,453,367、3,965,275、4,035,504、4,670,249、4,778,821、4,902,711 和 6,635,671)。
     根赤壳菌素和 pochonin 是天然产物 ；用于合成它们的一些类似物的中间体可 通过发酵获得，然而仅仅依靠那些天然产物或它们的发酵衍生物严重限制了化合物的范 围。 因此，已经合成了许多新的二羟基苯甲酸大环内酯。 这些中的许多是玉米赤霉烷和 相关化合物，其中所述大环除了苯环的几个碳之间外，不含有碳 - 碳双键。 ( 美国专利 序 列 号 3,373,038、3,586,701、3,621,036、3,631,179、3,687,982、3,704,249、3,751,431、 3 , 764 , 614 、 3 , 810 , 918 、 3 , 836 , 544 、 3 , 852 , 307 、 3 , 860 , 616 、 3 , 901 , 921 、 3 , 901 , 922 、 3,903,115、3,957,825、4,042,602、4,751,239、4,849,447 ； 和 2005-0256183)。 还 报 道 了具有以下特征的二羟基苯甲酸大环内酯的合成 ：苯环外的环上的碳之间存在一个双键 ( 美国专利序列号 3,196,019 ；3,551,454 ；3,758,511 ；3,887,583 ；3,925,423 ；3,954,805 ； 和 4,088,658)。 那些二羟基苯甲酸大环内酯中的大部分是 14 元大环，但是还报道了 12 元 大环类似物的合成 ( 美国专利序列号 5,710,174 ；6,617,348 ；和 2004-0063778，以及 PCT 公布 WO 02/48135)。
     还报道了根赤壳菌素相关化合物的合成，所述化合物在大环上具有两个非芳族 双键和卤化物或 1，2- 桥氧基 ( 即环氧化物 )。 ( 美国专利序列号 4,228,079 ；5,597,846 ； 5,650,430 ；5,977,165 ；7,115,651 以及日本专利文件号 JP 6-279279A、 JP 6-298764A、 JP 9-202781A、 JP 10-265381A2 和 JP2000-236984)。 根赤壳菌素相关化合物的肟的合 成公开于美国专利序列号 5,977,165 ；6,239,168 ；6,316,491 ；6,635,662 ；2001-0027208 ； 2004-0053990 ；日本专利文件号 JP 2003-113183A2 ；和 PCT 公布 WO 99/55689 中。 根 赤壳菌素的环丙类似物的合成公开于美国专利 7,115,651 和 PCT 公布 WO05/061481 中。 一些其它二羟基苯甲酸大环内酯类似物的合成公开于美国专利公布 2006-0247448 和 PCT 公布 WO 02/48135 中。 还合成了根赤壳菌素以及 Pochonin A 和 C(S.Barluenga 等人， Angew.Chemie，43(26) ：3467-3470(2004) ；S.Barluenga 等 人， Chemistry-A European Journal，11(17) ：4935-4952(2005 年 8 月 19 日 ) ；E.Moulin 等 人， Organic Letters， 7(25) ：5637-5639(2005 年 12 月 8 日 )。
     尽管有上述进展，但化学生物学家仍然受到敲除特定激酶活性的有限能力的困 扰，其中敲除特定激酶活性是为了揭示 (deconvolute) 特定激酶在复杂信号网络中的作 用。 可渗入细胞的小分子有望解决该问题。 而且越来越明显的是 ：激酶的生物功能通常 受它们的构象调节，所述构象转而由它们的磷酸化水平并且由分子内和分子间的缔合指 示。 小分子抑制剂还具有辨别给定激酶的不同构象的潜力，因此小分子提供了详细分析 那些构象的各自功能的方法。 不幸的是，已知激酶抑制剂的资料 (portfolio) 还不能支持 在分析激酶组 (kinome) 的不同成员的作用中所要做的全部工作。 这不仅是学术研究，因 为直到了解激酶的机理和它们的选择性为止，药物设计的合理性会继续受到困扰。因此对不仅具有改善的效能和选择性，而且具有改善的溶解性和生物利用度的 激酶抑制剂和 HSP90 抑制剂有持续需求。
     发明概述
     本发明提供具有结构式 I、 II、 III、 IV 和 V 的化合物，或其药学可接受的盐、 溶剂合物和 / 或酯 ；包含所述化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物和 / 或酯的药物组合 物 ；以及所述化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物和 / 或酯在治疗激酶介导或 HSP90 介导的病症中的用途。
     在一实施方案中，本发明提供式 I 的化合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物和 / 或酯 ：
     其中 ：
     R1、 R2、 R3 和 R4 各自独立地为氢、卤素、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、 芳基烷基、芳基、杂烷基、烷基杂芳基、杂环基、杂芳基、 OR、 NR2、 SR、 S(O)R、 S(O)2R、 -SO2N(R)2、 -N(R)SO2R、 -N(CO)R、 -N(CO)NR2、 -N(CO)OR、 -O(CO) R、 -(CO)R、 -(CO)OR、 -(CO)NR2、 -O(CO)OR、 -O(CO)NR2，或选自以下的结构 式：
     条件是 R1、 R2、 R3 和 R4 中的至少一个具有选自 (Ia)、 (Ib)、 (Ic)、 (Id)、 (Ie) 和 (If) 的结构式 ；
     L1 和 L2 各自独立地为共价键、 -O- 或 -NR3a- ；
     p 是 0、1 或 2 ；
     R1a 和 R2a 各自独立地为氢、烷基、杂烷基、杂芳基、杂环基、烯基、炔基、芳 基烷基、杂芳基烷基、杂环基烷基、- 亚烷基 -C(O)-O-R4a 或 - 亚烷基 -O-C(O)-O-R4a ； 并且
     R3a 和 R4a 各自独立地为氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、 烯基、炔基、芳基烷基、杂环基烷基或杂芳基烷基 ；
     L3 和 L4 各自独立地为氢、卤素、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、 芳基、杂烷基、杂环基、杂芳基、杂环基烷基、杂芳基烷基、 OR、 NR2 或 SR ；
     R5a、 R6a 和 R7a 各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基烷基、芳 基、杂烷基、烷基杂芳基、杂环基或杂芳基 ；
     R5 是氢、卤素、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、芳基、杂烷基、 烷基杂芳基、杂环基、杂芳基、 OR、 NR2、 SR、 S(O)R、 S(O)2R、 -SO2N(R)2、 -N(R) SO 2 R 、 - N ( CO ) R 、 - N ( CO ) NR 2 、 - N ( CO ) OR 、 - O ( CO ) R 、 -( CO ) R 、 -( CO ) OR、 -(CO)NR2、 -O(CO)OR 或 -O(CO)NR2 ；
     Z 具有选自 (Ia)、 (Ib)、 (Ic)、 (Id) 和 (Ie) 的结构式 ；
     A 1 与 A 2 一 起 为 - C H 2 - C H 2 - 、 - C H ＝ CH-、-CH(OH)-CH(OH)-、-CH(OH)-CH( 卤素 )-、-CH( 卤素 )-CH(OH)-、1，2- 环 丙二基 (1，2-cyclopropadiyl) 或 1，2- 环氧乙烷 ；
     B1 与 B2 一起为 -CH2-CH2-，或 B1 和 B2 一起表示共价键 ；
     X1 是氢、卤素、 OR、 NR2、 NH-OR、 SR、 S(O)R、 S(O)2R、 -N-O-(CH2) 1 2 3 n-CO2-R ；或者 X 与 X 或 X 一起表示共价键 ；
     X2 和 X3 均为氢，或 X2 和 X3 中的一个是氢且另一个与 X1 一起表示共价键 ；
     X4 与 X5 一起为＝ O、＝ S、＝ N-OR、＝ N-O-(CH2)nCOOR、＝ N-O-(CH2) 4 5 nCONR2、＝ N-NR2、＝ N-N-SOR 或＝ N-N-SO2R ；或者 X 和 X 中的一个是氢，且另 外一个是 OH、 OR、 O(CO)R、 O(CO)OR、 O(CO)NR2、 -(CH2)n-O(CO)OR、 -(CH2) 4 5 6 4 5 n-O(CO)NR2 ；或者 X 和 X 中的一个与 X 一起表示共价键，且 X 和 X 中的另外一个是 OH、 OR、 O(CO)R、 O(CO)OR 或 O(CO)NR2 ；
     X6 是氢，或者 X6 与 X4 和 X5 中的一个一起表示共价键 ；并且
     每一个 R 独立地为氢、烷基、酰基、芳基、烷芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳 基、杂环基、保护基 ；或者当两个 R 基团与同一个氮键合时，所述两个 R 基团与所述氮 一起形成 5-8 元杂环或杂芳基环 ；并且
     n 是 1、2 或 3。
     在一实施方案中，本发明提供式 II 的化合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物 和 / 或酯 ：
     其 中， R7 是 ＝ O、 ＝ S、 ＝ N-OR、 ＝ N-O-(CH2)nCOOR、 ＝ N-O-(CH2) nCONR2、＝ N-NR2、＝ N-N-SOR 或＝ N-N-SO2R。
     在一实施方案中，本发明提供式 III 的化合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物 和 / 或酯 ：
     其中 R 是氢、烷基、芳基烷基、酰基或保护基。
     在一实施方案中，本发明提供式 IV 的化合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物 和 / 或酯 ：
     其中 R6 是氢、 OR 或 NR2.
     在一实施方案中，本发明提供式 V 的化合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物 和 / 或酯 ：
     其中 R6 是 (CH2)nC(O)OR 或 -(CH2)nC(O)NR2 ；并且 n 是 1、2 或 3。
     在另一实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含式 I、II、III、IV 或 V 的化 合物或其药学可接受的盐、溶剂合物和 / 或酯，以及药学可接受的载体。
     在一实施方案中，本发明提供治疗、预防或改善患有 II 型神经纤维瘤病 (NF2) 或与 NF2 功能丧失相关的病状、或者患有 I 型神经纤维瘤病 (NF1) 或与 NF1 功能丧失相 关的病状的个体中的由神经纤维瘤病导致的肿瘤或症状的方法，其包括向所述个体给药 治疗有效剂量的至少一种式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物，或其药学可接受的互变异构 体、盐、溶剂合物、酯和 / 或前药。
     在一实施方案中，本发明提供式 I 的化合物，或其药学可接受的互变异构体、 盐、溶剂合物、酯和 / 或前药在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防或改善患 有 II 型神经纤维瘤病 (NF2) 或与 NF2 功能丧失相关的病状、或者患有 I 型神经纤维瘤病 (NF1) 或与 NF1 功能丧失相关的病状的个体中的由神经纤维瘤病导致的肿瘤或症状。
     在一实施方案中，本发明提供治疗、预防或改善患者的神经变性疾病的方法， 其包括向所述患者给药治疗有效剂量的至少一种式 I、II、III、IV 或 V 的化合物，或其药 学可接受的互变异构体、盐、溶剂合物、酯和 / 或前药。
     在一实施方案中，本发明提供式 I、II、III、IV 或 V 的化合物或其药学可接受的 互变异构体、盐、溶剂合物、酯和 / 或前药在制备用于治疗、预防或改善神经变性疾病 的药物中的用途。
     在另一实施方案中，本发明提供抑制或减少缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的 肿瘤细胞的生长或数量的方法，其包括使所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细 胞与至少一种式 I、II、III、IV 或 V 的化合物，或其药学可接受的互变异构体、盐、溶剂 合物、酯和 / 或前药相接触。
     在另一实施方案中，本发明提供包含与药学可接受的载体组合的有效 HSP 90 抑 制量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物的药物组合物。 在一些实施方案中，所述载体适 于口服、肠胃外、吸入、局部或真皮内给药。
     在其它实施方案中，所述包含式 I、II、III、IV 或 V 的化合物的药物组合物包含 平均粒度小于约 2 微米的颗粒。 在其它实施方案中，将所述组合物掺入到可生物降解或 不能生物降解的聚合物中。
     在一实施方案中，所述组合物包含选自抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、液体载 体、溶质、助悬剂、增稠剂、矫味剂、明胶、甘油、粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防 腐剂、表面活性剂、分散剂、可生物降解的聚合物，或它们的任意组合的添加剂。
     在另一实施方案中，本发明提供治疗患有疾病的患者的方法，其包括向所述患
     有疾病的患者给药有效量的式 I、II、III、IV 或 V 的化合物，其中所述疾病是自身免疫疾 病、炎性疾病、神经疾病或神经变性疾病、癌症、心血管疾病、变态反应、哮喘或与激 素相关的疾病。
     在一实施方案中，本发明提供治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患有 癌症的患者给药有效癌症治疗量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物，其中所述癌症可以 是实体瘤、血源性肿瘤 (blood borne tumor)、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾 丸癌、尿道癌、食道癌、喉癌、胶质母细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、肺癌、表 皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、肺腺癌、骨癌、结肠癌、腺瘤、胰腺癌、腺癌、甲状腺 癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌和胆道 癌、肾癌、髓性病症 (myeloid disorder)、淋巴病症、霍奇金病、毛细胞 (hairycells)、口 腔 (buccal cavity) 癌、咽癌 (pharynx cancer)、唇癌、舌癌、口 (mouth) 癌、咽癌 (cancer of the pharynx)、小肠癌、结肠 - 直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑癌和中枢神经系统癌症， 或白血病。
     在另一实施方案中，本发明提供治疗患有与不期望的新生血管形成相关的疾病 的患者的方法，其包括向所述患有不期望的新生血管形成的患者给药有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物。
     与不期望的新生血管形成相关的疾病包括眼新生血管性疾病 (ocular neovascular disease)、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼 和晶体后纤维增生症、流行性角膜结膜炎、维生素 A 缺乏病、接触镜超戴症 (contact lens overwear)、异位性角膜炎、上角膜缘角膜炎 (superior limbic keratitis)、翼状胬肉干燥性 角膜炎、干燥综合征 ( syndrome)、红斑痤疮、小水疱病 (phylectenulosis)、梅 毒、分枝杆菌 (Mycobacteria) 感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单 纯疱疹 (Herpes simplex) 感染、带状疱疹 (Herpes zoster) 感染、原虫感染、卡波西肉瘤、 莫伦溃疡、角膜 Terrien 边缘性变性、边缘性角质层分离 (marginal keratolysis)、创伤、类 风湿性关节炎、全身性狼疮、多动脉炎、韦格内结节病 (Wegener′ s sarcoidosis)、巩膜 炎、斯 - 琼二氏病 (Steven-Johnson disease)、类天疱疮、放射状角膜切开术或角膜移植排 斥、镰状细胞性贫血、结节病、弹性假黄色瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动 脉阻塞性疾病 (carotid obstructive disease)、慢性葡萄膜炎 / 玻璃体炎、 Lyme’ s 病、全 身性红斑狼疮、伊尔斯病、白塞病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、眼假组织胞浆菌 病、贝斯特病、近视、视窝、 Stargart 病、睫状体扁平部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综 合征、弓形体病或激光治疗后并发症 (post-laser complications)。
     在另一实施方案中，本发明提供治疗患有炎性疾病的患者的方法，其包括向所 述患有炎性疾病的患者给药有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物。
     所述炎性疾病可以是内皮细胞的过度或异常刺激、动脉粥样硬化、血管功能障 碍、伤口愈合异常、炎性和免疫病症、白塞病、痛风或痛风性关节炎、伴随异常血管发 生的类风湿性关节炎、皮肤疾病、银屑病、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病、晶 体后纤维增生症、黄斑变性、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼或 Osler Weber 综合 征。
     附图简述图 1A 和 1B 显示磷酸酯前药 1a 和 1b 在肝匀浆和肠匀浆中体外水解为它们的母 体化合物。
     图 2A 和 2B 显示磷酸酯前药 1a 和 1b 在血浆和人工胃液中体外水解为它们的母 体化合物。
     发明详述
     本发明提供用作激酶抑制剂和 HSP90 抑制剂的基于二羟基苯甲酸内酯的新化合 物。 还提供包含所述化合物的组合物和制备所述化合物的方法。 本发明提供所述化合物 在抑制激酶和 HSP-90 中的用途，以及治疗激酶介导或 HSP90 介导的疾病的方法，所述方 法包括向患有激酶介导或 HSP90 介导的疾病的患者给药有效激酶抑制量或有效 HSP90 抑 制量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物。
     化合物
     在一实施方案中，本发明提供式 I 的化合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物和 / 或酯 ：
     其中 ：
     R1、 R2、 R3 和 R4 各自独立地为氢、卤素、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、 芳基烷基、芳基、杂烷基、烷基杂芳基、杂环基、杂芳基、 OR、 NR2、 SR、 S(O)R、 S(O)2R、 -SO2N(R)2、 -N(R)SO2R、 -N(CO)R、 -N(CO)NR2、 -N(CO)OR、 -O(CO) R、 -(CO)R、 -(CO)OR、 -(CO)NR2、 -O(CO)OR、 -O(CO)NR2，或选自以下的结构 式：
     条件是 R1、 R2、 R3 和 R4 中的至少一个具有选自 (Ia)、 (Ib)、 (Ic)、 (Id)、 (Ie) 和 (If) 的结构式 ；
     L1 和 L2 各自独立地为共价键、 -O- 或 -NR3a- ；
     p 是 0、1 或 2 ；
     R1a 和 R2a 各自独立地为氢、烷基、杂烷基、杂芳基、杂环基、烯基、炔基、芳 基烷基、杂芳基烷基、杂环基烷基、- 亚烷基 -C(O)-O-R4a 或 - 亚烷基 -O-C(O)-O-R4a ； 并且
     R3a 和 R4a 各自独立地为氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、 烯基、炔基、芳基烷基、杂环基烷基或杂芳基烷基 ；
     L3 和 L4 各自独立地为氢、卤素、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、 芳基、杂烷基、杂环基、杂芳基、杂环基烷基、杂芳基烷基、 OR、 NR2 或 SR ；
     R5a、 R6a 和 R7a 各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基烷基、芳 基、杂烷基、烷基杂芳基、杂环基或杂芳基 ；
     R5 是氢、卤素、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、芳基、杂烷基、 烷基杂芳基、杂环基、杂芳基、 OR、 NR2、 SR、 S(O)R、 S(O)2R、 -SO2N(R)2、 -N(R) SO 2 R 、 - N ( CO ) R 、 - N ( CO ) NR 2 、 - N ( CO ) OR 、 - O ( CO ) R 、 -( CO ) R 、 -( CO ) OR、 -(CO)NR2、 -O(CO)OR 或 -O(CO)NR2 ；
     Z 具有选自 (Ia)、 (Ib)、 (Ic)、 (Id) 和 (Ie) 的结构式 ；
     A 1 与 A 2 一 起 为 - C H 2 - C H 2 - 、 - C H ＝ CH-、-CH(OH)-CH(OH)-、-CH(OH)-CH( 卤素 )-、-CH( 卤素 )-CH(OH)-、1，2- 环 丙二基或 1，2- 环氧乙烷 ；
     B1 与 B2 一起为 -CH2-CH2-，或 B1 和 B2 一起表示共价键 ；
     X1 是氢、卤素、 OR、 NR2、 NH-OR、 SR、 S(O)R、 S(O)2R、 -N-O-(CH2) 1 2 3 n-CO2-R ；或者 X 与 X 或 X 一起表示共价键 ；
     X2 和 X3 均为氢，或 X2 和 X3 中的一个是氢且另一个与 X1 一起表示共价键 ；
     X4 与 X5 一起为＝ O、＝ S、＝ N-OR、＝ N-O-(CH2)nCOOR、＝ N-O-(CH2) 4 5 nCONR2、＝ N-NR2、＝ N-N-SOR 或＝ N-N-SO2R ；或者 X 和 X 中的一个是氢，且另 外一个是 OH、 OR、 O(CO)R、 O(CO)OR、 O(CO)NR2、 -(CH2)n-O(CO)OR、 -(CH2) 4 5 6 4 5 n-O(CO)NR2 ；或者 X 和 X 中的一个与 X 一起表示共价键，且 X 和 X 中的另外一个是 OH、 OR、 O(CO)R、 O(CO)OR 或 O(CO)NR2 ；
     X6 是氢，或者 X6 与 X4 和 X5 中的一个一起表示共价键 ；并且
     每一个 R 独立地为氢、烷基、酰基、芳基、烷芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳 基、杂环基、保护基 ；或者当两个 R 基团与同一个氮键合时，所述两个 R 基团与所述氮 一起形成 5-8 元杂环或杂芳基环 ；并且
     n 是 1、2 或 3。
     在另一实施方案中，本发明提供式 II 的化合物 ：
     其 中， R7 是 ＝ O、 ＝ S、 ＝ N-OR、 ＝ N-O-(CH2)nCOOR、 ＝ N-O-(CH2) nCONR2、＝ N-NR2、＝ N-N-SOR 或＝ N-N-SO2R。
     在式 II 化合物的一实施方案中， R1 是 H、卤素或杂环基。
     在式 II 化合物的一实施方案中， R5 是氢、烷基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
     在式 II 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 -CH ＝ CH-。
     在 式 II 化 合 物 的 一 实 施 方 案 中， A1 与 A2 一 起 为 -CH(OH)-CH(OH)-、 -CH(OH)-CH( 卤素 )- 或 -CH( 卤素 )-CH(OH)-。
     在式 II 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 1，2- 环氧乙烷。
     在式 II 化合物的一实施方案中，R1 是 H、Cl 或杂环基 ；R5 是氢、烷基、芳基或 芳基烷基 ；A1 与 A2 一起为 -CH ＝ CH- 或 -C(OH)-C(OH)- ；X1 是氢、卤素或 NH-OR ； 并 且 R7 是 ＝ O、 ＝ S、 ＝ N-OR、 ＝ N-O-(CH2)nCOOR、 ＝ N-O-(CH2)nCONR2、 ＝ N-NR2、＝ N-N-SOR、＝ N-N-SO2R。 优选地，R7 是＝ O。 还优选 R7 为＝ N-OR、＝ N-O-(CH2)nCOOR 或＝ N-O-(CH2)nCONR2。
     在式 II 化合物的一实施方案中， R1 是 H、 Cl 或杂环基 ；R5 是氢、烷基、芳基 或芳基烷基 ；A1 与 A2 一起为 1，2- 环氧乙烷 ；X1 是氢、卤素或 NH-OR ；并且 R7 是 ＝ O、 ＝ S、 ＝ N-OR、 ＝ N-O-(CH2)nCOOR、 ＝ N-O-(CH2)nCONR2、 ＝ N-NR2、 ＝ N-N-SOR、＝ N-N-SO2R。
     在式 II 化合物的一实施方案中，R1 是 H、Cl 或杂环基 ；R5 是氢、烷基、低级烷 基、芳基或芳基烷基 ；A1 与 A2 一起为 -CH ＝ CH- 或 -C(OH)-C(OH)- ；X1 与 X2 一起表 示键 ；并且 R7 是＝ O、＝ S、＝ N-OR、＝ N-O-(CH2)nCOOR、＝ N-O-(CH2)nCONR2、 ＝ N-NR2、＝ N-N-SOR、＝ N-N-SO2R。优选地，R1 是 H 或 Cl ；R5 是氢、甲基、丙基、 异丙基或苯基 ；并且 R7 是＝ N-OR、＝ N-O-(CH2)nCOOR 或＝ N-O-(CH2)nCONR2。 还 优选 R1 是 Cl 且 R5 是氢。 还优选 n 为 1。 还优选 R5 是氢且 R7 是＝ N-O-(CH2)nCOOR 或＝ N-O-(CH2)nCONR2。 还优选 R5 是氢且 R7 是＝ N-OR。
     在式 II 化合物的一实施方案中，R1 是 H、Cl 或杂环基 ；R5 是氢、烷基、低级烷 基、芳基或芳基烷基 ；A1 与 A2 一起为 1，2- 环氧乙烷 ；X1 与 X2 一起表示键 ；并且 R7 是＝ O、＝ S、＝ N-OR、＝ N-O-(CH2)nCOOR、＝ N-O-(CH2)nCONR2、＝ N-NR2、＝ N-N-SOR、＝ N-N-SO2R。 优选地，R7 是＝ O。 还优选 R7 是＝ N-OR、＝ N-O-(CH2) nCOOR 或＝ N-O-(CH2)nCONR2。
     在另一实施方案中，本发明提供式 III 的化合物 ：
     其中 R 是氢、烷基、芳基烷基、酰基或保护基。
     在式 III 化合物的一实施方案中，R 是氢或酰基 ；并且 R1 是 H、卤素或杂环基。
     在式 III 化合物的一实施方案中， R5 是氢、烷基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
     在式 III 化合物的一实施方案中， X1 与 X2 一起表示共价键。
     在式 III 化合物的一实施方案中，X1 是氢、卤素、NH-OR、NH-O-(CH2)nCOOR 或 NH-O-(CH2)nCONR2。
     在式 III 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 -CH ＝ CH-。
     在 式 III 化 合 物 的 一 实 施 方 案 中， A 1 与 A 2 一 为 -CH(OH)-CH(OH)-、 -CH(OH)-CH( 卤素 )- 或 -CH( 卤素 )-CH(OH)-。
     在式 III 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 1，2- 环氧乙烷。
     在另一实施方案中，本发明提供式 IV 的化合物 ：
     起
     其中 R6 是氢、 OR 或 NR2。 在式 IV 化合物的一实施方案中， R 是氢或酰基。在式 IV 化合物的一实施方案中， R1 是 H、卤素或杂环基。
     在式 IV 化合物的一实施方案中， R5 是氢、烷基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
     在式 IV 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 -CH ＝ CH-。
     在 式 IV 化 合 物 的 一 实 施 方 案 中， A 1 与 A 2 一 起 为 -CH(OH)-CH(OH)-、 -CH(OH)-CH( 卤素 )- 或 -CH( 卤素 )-CH(OH)-。
     在式 IV 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 1，2- 环氧乙烷。
     在另一实施方案中，本发明提供式 V 的化合物 ：
     其中 R6 是 (CH2)nC(O)OR 或 -(CH2)nC(O)NR2 ；并且 n 是 1、2 或 3。
     在式 V 化合物的一实施方案中， R6 是 -CH2C(O)N(Me)OMe。
     在式 V 化合物的一实施方案中， R1 是 H、卤素或杂环基。
     在式 V 化合物的一实施方案中， R5 是氢、烷基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
     在式 V 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 -CH ＝ CH-。
     在 式 V 化 合 物 的 一 实 施 方 案 中， A1 与 A2 一 起 为 -CH(OH)-CH(OH)-、 -CH(OH)-CH( 卤素 )- 或 -CH( 卤素 )-CH(OH)-。
     在式 V 化合物的一实施方案中， A1 与 A2 一起为 1，2- 环氧乙烷。
     在本发明的某些实施方案中，任意一个以上式结构中的 R2 和 R4 独立地为 OR 或 选自 (Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie) 和 (If) 的结构式 ；R 独立地为烷基、酰基、芳基、烷 芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳基、杂环基、保护基 ；条件是 R2 和 R4 中的至少一个为选 自 (Ia)、 (Ib)、 (Ic)、 (Id)、 (Ie) 和 (If) 的结构式。
     在某些实施方案中，本发明提供具有选自以下结构式的化合物 ：
     或其药学可接受的盐、溶剂合物或酯。 在一实施方案中，本发明提供化合物，其中 R2 和 R4 中的一个具有结构式 (Ia)，L1 和 L2 中的至少一个是 -O-，并且 p 是 0 或 1。 优选地， L1 和 L2 均为 -O-。
     在一实施方案中，本发明提供化合物，其中 R2 和 R4 中的一个具有结构式 (Ib)， 并且 R5a 和 R6a 独立地为氢或低级烷基。
     在一实施方案中，本发明提供化合物，其中 R2 和 R4 中的一个具有结构式 (Ic)， 并且 R5a、 R6a 和 R7a 独立地为氢或低级烷基。
     在一实施方案中，本发明提供化合物，其中 R2 和 R4 中的一个具有结构式 (Id)， 并且 L1 为 -O-。
     在一实施方案中，本发明提供化合物，其中 R2 和 R4 中的一个具有结构式 (Ie)， 并且 L1 为 -O-。
     在一实施方案中，本发明提供化合物，其中 R2 和 R4 中的一个具有结构式 (If)， 并且 R5a 和 R6a 独立地为氢或低级烷基。
     在一些具体实施方案中，本发明提供具有选自以下结构式的化合物 ：
     或其药学可接受的盐、溶剂合物或酯。 其它具体化合物 一方面，本发明还提供具有选自以下结构式的具体化合物 ：或其药学可接受的盐、溶剂合物或酯。
     这些具体化合物可以配制于本文所述的药物组合物中，并且可用于治疗本文所 述的各种疾病。
     立体异构和同质多晶
     具有手性中心的本发明的化合物可以以旋光和外消旋形式存在并分离。 本发明 涵盖了本发明化合物的任何外消旋、旋光、非对映异构、多晶型或立体异构形式，或其 混合物，其具有本文所述的有用性质。
     在一实施方案中，通过不对称合成，使用本文所述的方法或本领域技术人员已 知的合成转化来制备旋光形式的化合物。
     获得旋光物质的方法的实例为本领域所已知，并且至少包括下述方法 ：
     i) 晶体的物理分离——手工分离单个对映异构体的宏观晶体的技术。 如果存在 不同对映异构体的晶体，即所述物质是混合体 (conglomerate) 并且所述晶体在视觉上不 同，可使用这一技术 ；
     ii) 同时结晶——将单个对映异构体从外消旋物的溶液中分别结晶的技术，该技 术只有在外消旋物是固态的混合体时才可使用 ；
     iii) 酶法拆分——根据多种对映异构体与酶的不同反应速率来部分或完全分离外 消旋物的技术 ；
     iv) 酶促不对称合成——合成的至少一个步骤使用酶促反应以获得期望的对映异 构体的对映异构纯的或富集的合成前体的合成技术 ；
     v) 化学不对称合成——在产生产品的不对称性 ( 即手性 ) 的条件下从非手性前体 合成期望的对映异构体的合成技术，其可通过使用手性催化剂或手性助剂来实现 ；
     vi) 非对映异构体分离——使外消旋化合物与对映异构纯的试剂 ( 手性助剂 ) 反 应的技术，所述对映异构纯的试剂将单个对映异构体转化为非对映异构体。 然后根据它 们目前更加不同的结构差异，通过色谱或结晶来分离得到的非对映异构体，并随后除去 所述手性助剂以获得期望的对映异构体 ；
     vii) 一级和二级不对称转化 —— 使其中非对映异构体从外消旋物平衡中产生非 对映异构体相对于期望的对映异构体在溶液中的优势，或使其中非对映异构体相对于期 望的对映异构体的优先结晶破坏所述平衡，以致最终基本上将所有物质从期望的对映异 构体转化为结晶非对映异构体的技术。 然后从所述非对映异构体中释放期望的对映异构 体；
     viii) 动力学拆分——该技术是指在动力学条件下根据所述对映异构体与手性非 外消旋的试剂或催化剂的不同反应速率来实现对外消旋物的部分或完全拆分 ( 或对被部 分拆分的化合物的进一步拆分 ) ；
     ix) 从非外消旋前体的对映特异性 (enantiospecific) 合成——从非手性原料获得期 望的对映异构体并在所述合成过程中没有或仅很少地危及立体化学完整性的合成技术 ；
     x) 手性液相色谱法——由于不同对映异构体与固定相的不同相互作用，在液体 流动相中分离外消旋物中的对映异构体的技术。 所述固定相可由手性材料制成，或者所 述流动相可含有其它手性材料以引起不同的相互作用 ；
     xi) 手性气相色谱法——挥发外消旋物，并由于不同对映异构体在气体流动相中 与含有不挥发的非外消旋手性吸附相的柱的不同相互作用来分离对映异构体的技术 ；
     xii) 用手性溶剂萃取——根据一种对映异构体在特定手性溶剂中的优先溶解来分 离所述对映异构体的技术 ；或者
     xiii) 跨手性膜转运——将外消旋物与薄膜屏障接触的技术。 所述屏障通常分离 两种混溶液体，一种含有外消旋物，并且驱动力 ( 例如浓度或压力差 ) 引起跨膜屏障的优 先转运。 发生分离是由于所述膜只允许外消旋物中的一种对映异构体通过的非外消旋手 性性质。
     定义
     无论何时本说明书中的术语被确定为一个范围 ( 即 C1-4 烷基 )，所述范围独立地 指所述范围的每个要素。 作为非限定性实例，C1-4 烷基独立地指 C1、C2、C3 或 C4 烷基。 类似地，当一个或多个取代基被称为 “独立地选自” 某组时，这是指每个取代基可以是 该组的任何要素，并且这些组的任何组合可以从所述组分离。 例如，如果 R1 和 R2 可独 自地选自 X、Y 和 Z，这分别包括以下组 ：R1 是 X 且 R2 是 X ；R1 是 X 且 R2 是 Y ；R1 是 X 且 R2 是 Z ；R1 是 Y 且 R2 是 X ；R1 是 Y 且 R2 是 Y ；R1 是 Y 且 R2 是 Z ；R1 是 Z 且 R2 是 X ；R1 是 Z 且 R2 是 Y ；以及 R1 是 Z 且 R2 是 Z。
     除非另有说明，本文所用的术语 “烷基” 指饱和直链、支链或环状的伯、仲或 叔烃，包括但不限于具有 C1 至 C10 的基团。 该术语 “烷基” 也包括 “低级烷基”。
     术语 “低级烷基” 指饱和直链、支链或环状的伯、仲或叔烃，包括具有 C1 至 C4 的基团，并且如果适宜则包括环状烷基 ( 例如环丙基 )。
     烷基的说明性实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、仲丁基、异 丁基、叔丁基、环丁基、1- 甲基丁基、1，1- 二甲基丙基、戊基、环戊基、异戊基、新 戊基、环戊基、己基、异己基和环己基。 除非另有说明，所述烷基可以是未取代的， 或被一个或多个选自以下的基团所取代，如本领域技术人员所知，所述基团包括视需要 未被保护或被保护的烷基、卤代、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、酰氨 基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、硫醇、亚胺、磺酸、硫酸酯、磺酰基、硫烷基、亚硫酰基、氨磺酰基 (sulfamonyl)、酯、 羧酸、酰胺、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫代酸酯、硫醚、卤化酰基、酐、肟、肼 (hydrozine)、氨基甲酸酯、膦酸、磷酸酯、膦酸酯，或任何不抑制所述化合物的药理学 活性的其它可行的官能团，例如 Greene 等人在 Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991 中所教导的。
     如本文所用，术语 “卤代” 或 “卤素” 包括氯代、溴代、碘代和氟代。
     如本文所用，术语 “手性” 包括具有与其镜像不可重叠的性质的化合物。
     术语 “烷硫基” 是指具有特定碳原子数量的直链或支链烷基硫化物，例如 C1-4 烷硫基、乙硫基、 -S- 烷基、 -S- 烯基、 -S- 炔基等等。
     术语 “烷基氨基” 或 “芳基氨基” 是指分别具有一个或两个烷基或芳基取代基 的氨基。 除非在本申请中另有具体陈述，当烷基为合适基团时，则它是低级烷基 ( 无论 是取代的还是未取代的 )。
     术 语 “烷 基 磺 酰 基” 是 指 具 有 特 定 碳 原 子 数 量 的 直 链 或 支 链 烷 基 砜 (alkylsulfone)，例如 C1-6 烷基磺酰基或甲基磺酰基。
     术语 “烷氧羰基” 是指具有特定碳原子数量的羧酸衍生物的直链或支链酯，例 如甲氧羰基 (MeOCO-)。
     如本文所用，术语 “硝基” 意指 -NO2 ；术语 “巯基” 意指 -SH ；且术语 “磺 酰基” 意指 -SO2。
     术语 “烯基” 和 “炔基” 是指其中至少一个饱和 C-C 键被双键或三键替代的烷 基基团，包括取代和未取代的形式。 因此 C2-6 烯基可以是乙烯基、烯丙基、1- 丙烯基、 2- 丙烯基、1- 丁烯基、2- 丁烯基、3- 丁烯基、1- 戊烯基、2- 戊烯基、3- 戊烯基、4- 戊 烯基、1- 己烯基、2- 己烯基、3- 己烯基、4- 己烯基或 5- 己烯基。 类似地， C2-6 炔基 可以是乙炔基、1- 丙炔基、2- 丙炔基、1- 丁炔基、2- 丁炔基、3- 丁炔基、1- 戊炔基、 2- 戊炔基、3- 戊炔基、4- 戊炔基、1- 己炔基、2- 己炔基、3- 己炔基、4- 己炔基或 5- 己 炔基。
     术语 “亚烷基” 包括具有式 -(CH2)n- 的饱和直链的二价烷基，其中 “n” 可以 是 1 至 10 的任意整数。
     “烷基”、 “烷氧基”、 “烯基”、 “炔基” 等包括直链和支链的基团。 然 而，提及个别基团例如 “丙基” 时，仅包括直链基团，而对支链异构体进行特别定义， 如 “异丙基”。
     如本文所用且除非另外指定，术语 “芳基” 是指每个环中至多为 8 元的任何稳 定的单环、二环或三环碳环，其中至少一个环是如休克尔 4n+2 法则所定义的芳环，并特 别是苯基、联苯基或萘基。 该术语包括取代和未取代的基团。 所述芳基可被任意所述 基团取代，如本领域技术人员所知，所述基团包括但不限于视需要被保护或未被保护的 选自以下基团的一个或多个基团 ：卤素 ( 氟、氯、溴或碘 )、羟基、氨基、叠氮基、烷基 氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯、膦酸、磷酸酯或膦酸 酯，例如 Greene 等人在 Protective Groups in Organic Synthesis， John Wiley &Sons，第三 版，1999 中所教导的。
     术语 “烷芳基” 或 “烷基芳基” 是指具有芳基取代基的烷基或通过如本文所定义的芳基连接到分子上的烷基。 术语 “芳烷基” 或 “芳基烷基” 是指被烷基取代基取 代的芳基或通过以上定义的烷基连接到分子上的芳基。
     术语 “环烷基” 包括 C3-8 的环，包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己 基、环庚基和环辛基。
     术语 “烷氧基” 是指具有连接的氧基团的直链或支链烷基，所述烷基具有特定 数量或在该范围内的任意数量的碳原子。 例如 “-O- 烷基”、 C1-4 烷氧基、甲氧基等。
     术语 “酰基” 或 “O- 链接的酯” 包括式 C(O)R’ 的基团，其中 R’ 是直链、 支链或环状烷基 ( 包括低级烷基 )，氨基酸的羧酸残基 (carboxylate residue)、芳基 ( 包括 苯基 )、杂芳基、烷芳基、芳烷基 ( 包括苄基 )、烷氧基烷基 ( 包括甲氧基甲基 )、芳氧基 烷基 ( 例如苯氧基甲基 ) ；或取代的烷基 ( 包括低级烷基 )、芳基 ( 包括被氯、溴、氟、 碘、 C1 至 C4 烷基或 C1 至 C4 烷氧基任选取代的苯基 )、磺酸酯 ( 例如烷基或芳烷基磺酰 基，包括甲磺酰基 )、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基 - 三苯甲 基、取代苄基、烷芳基、芳烷基 ( 包括苄基 )、烷氧基烷基 ( 包括甲氧基甲基 )、芳氧基 烷基 ( 例如苯氧基甲基 )。 所述酯中的芳基最佳包括苯基。 在非限定性实施方案中，酰基 包括乙酰基、三氟乙酰基、甲基乙酰基、环丙基乙酰基、环丙基 - 羧基、丙酰基、丁酰 基、异丁酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、新庚酰基、苯乙酰基、2- 乙酰氧基 -2- 苯基 乙酰基、二苯基乙酰基、α- 甲氧基 -α- 三氟甲基 - 苯基乙酰基、溴乙酰基、2- 硝基 - 苯 乙酰基、4- 溴 - 苯乙酰基、2- 氯 -2，2- 二苯基乙酰基、2- 氯 -2- 苯乙酰基、三甲基乙酰 基、氯二氟乙酰基、全氟乙酰基、氟乙酰基、溴二氟乙酰基、甲氧基乙酰基、2- 噻吩乙 酰基、氯磺酰基乙酰基、3- 甲氧基苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、叔丁基乙酰基、三氯乙 酰基、单氯 - 乙酰基、二氯乙酰基、7H- 十二氟 - 庚酰基 (7H-dodecafluoro-heptanoyl)、 全 氟 - 庚 酰 基、7H- 十 二 - 氟 庚 酰 基 (7H-dodeca-fluoroheptanoyl)、7- 氯 十 二 氟 - 庚 酰 基 (7-chlorododecafluoro-heptanoyl)、7- 氯 - 十 二 氟 - 庚 酰 基 (7-chloro-dodecaflu oro-heptanoyl)、7H- 十 二 氟 庚 酰 基 (7H-dodecafluoroheptanoyl)、7H- 十 二 - 氟 庚 酰 基 (7H-dodeca-fluoro-heptanoyl)、 九 - 氟 -3，6- 二 氧 杂 - 庚 酰 基 (nona-fluoro-3， 6-dioxa-heptanoyl)、 九 氟 -3，6- 二 氧 杂 庚 酰 基 (nonafluoro-3，6-dioxaheptanoyl)、 全 氟庚酰基、甲氧基苯甲酰基、甲基 3- 氨基 -5- 苯基噻吩 -2- 羧基、3，6- 二氯 -2- 甲氧 基 - 苯甲酰基、4-(1，1，2，2- 四氟 - 乙氧基 )- 苯甲酰基、2- 溴 - 丙酰基、ω- 氨基辛 酰基、癸酰基、正十五酰基、硬脂酰基、3- 环戊基 - 丙酰基、1- 苯 - 羧基、 O- 乙酰基 扁桃酰基 (O-acetylmandelyl)、特戊酰基乙酰基、1- 金刚烷 - 羧基、环己烷 - 羧基、2， 6- 吡啶二羧基、环丙烷 - 羧基、环丁烷 - 羧基、全氟环己基羧基、4- 甲基苯甲酰基、氯 甲基异噁唑基羰基、全氟环己基羧基、丁烯酰基、1- 甲基 -1H- 吲唑 -3- 羰基、2- 丙烯 基、异戊酰基、1- 吡咯烷羰基、4- 苯基苯甲酰基。
     术语 “酰氨基” 包括具有 “-N(R’ )-C( ＝ O)-R’” 结构的基团，其中每个 R’ 独立地如上文定义。
     术语 “羰基” 包括结构为 “-C( ＝ O)-X-R’” 或 “X-C( ＝ O)-R’” 的基 团，其中 X 是 O、 S 或键，并且每个 R 独立地如上文所定义。
     术语 “杂原子” 包括在杂环化合物的结构中除碳或氢以外的原子，其非限制性 实例是氮、氧、硫、磷或硼。如本文所用，术语 “杂环”、“杂环基”或 “杂环的”包括具有四至十四元 ( 优 选五至十元 ) 的非芳环体系，其中一个或多个环碳原子 ( 优选一至四个 ) 各自被杂原子替 代。 杂环的实例包括 3-1H- 苯并咪唑 -2- 酮、(1- 取代的 )-2- 氧代 - 苯并咪唑 -3- 基、 2- 四氢 - 呋喃基、3- 四氢呋喃基、2- 四氢吡喃基、3- 四氢吡喃基、4- 四氢吡喃基、[1， 3]- 二氧杂环戊烷基 ([1，3]-dioxalanyl)、 [1，3]- 二硫环戊烷基 ([1，3]-dithiolanyl)、 [1，3]- 二噁烷基、2- 四氢 - 噻吩基、3- 四氢噻吩基、2- 吗啉基、3- 吗啉基、4- 吗啉 基、2- 硫吗啉基、3- 硫吗啉基、4- 硫吗啉基、1- 吡咯烷基、2- 吡咯烷基、3- 吡咯烷 基、1- 哌嗪基、2- 哌嗪基、1- 哌啶基、2- 哌啶基、3- 哌啶基、4- 哌啶基、4- 噻唑烷 基、 diazolonyl、 N- 取 代 diazolonyl、1- 酞 酰 亚 胺 基 (1-phthalimidinyl)、 苯 并 噁 烷 基 (benzoxanyl)、苯并吡咯烷基、苯并哌啶基、苯并氧戊环烷基 (benzoxolanyl)、苯并硫戊 环烷基和苯并噻烷基 (benzothianyl)。 如本文所用，术语 “杂环基” 或 “杂环的” 的范 围还包括其中含有杂原子的非芳族环稠合到一个或多个芳族或非芳族环上的基团，例如 二氢吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基，其中连接基团或连接点在含有杂 原子的非芳族环上。 术语 “杂环”、 “杂环基” 或 “杂环的” ( 不论是饱和的还是部分 不饱和的 ) 还指被任选取代的环。
     单独使用或作为如 “杂芳烷基” 或 “杂芳基烷氧基” 中的较大基团的部分使用 的术语 “杂芳基” 是指具有五至十四元的杂芳族环基团。 杂芳基环的实例包括 2- 呋喃 基、3- 呋喃基、3- 呋吖基 (3-furazanyl)、 N- 咪唑基、2- 咪唑基、4- 咪唑基、5- 咪唑 基、3- 异噁唑基、4- 异噁唑基、5- 异噁唑基、2- 噁二唑基、5- 噁二唑基、2- 噁唑基、 4- 噁唑基、5- 噁唑基、1- 吡咯基、2- 吡咯基、3- 吡咯基、1- 吡唑基、2- 吡唑基、3- 吡 唑基、2- 吡啶基、3- 吡啶基、4- 吡啶基、2- 嘧啶基、4- 嘧啶基、5- 嘧啶基、3- 哒嗪 基、2- 噻唑基、4- 噻唑基、5- 噻唑基、5- 四唑基、2- 三唑基、5- 三唑基、2- 噻吩基、 3- 噻吩基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三 唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、吲唑基、异吲哚基、吖啶基 和苯并异噁唑基。 如本文所用，术语 “杂芳基” 的范围内还包括其中杂环稠合到一个 或多个芳族或非芳族环的基团，其中连接基团或连接点在杂芳环上。 实例包括四氢喹啉 基、四氢异喹啉基和吡啶并 [3，4-d] 嘧啶基。 术语 “杂芳基” 还指被任选取代的环。 术语 “杂芳基” 与术语 “杂芳基环” 或术语 “杂芳族的 (heteroaromatic)” 可以互换使 用。
     除非另有说明，如本文所用的术语 “氨基” 包括由结构 “-N(R)2” 所表示的基 团，并包括被烷基、芳基、杂环基和 / 或磺酰基任选取代的伯、仲和叔胺。 因此 (R)2 可 代表两个氢原子、两个烷基基团，或一个氢原子和一个烷基基团。
     如本文所用，术语 “酰氨基” 包括氨基取代的羰基，而术语 “脒基” 意指具有 结构 “-C( ＝ NH)-NH2” 的基团。
     如本文所用，术语 “季胺” 包括具有正电荷的氮的季铵盐。 它们是通过所关 注的化合物中的碱性氮原子与合适的季铵化剂 ( 例如碘甲烷或苄基碘 ) 之间的反应而形 成的。 伴随着季胺的合适的抗衡离子包括乙酸根、三氟乙酸根、氯离子、溴离子和碘离 子。
     应当理解，上述的官能团 ( 例如烷基，烯基、炔基、杂烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、烷基芳基等 ) 包括那些官能团的取代形式 ( 即取代烷基、取代烯基、取代炔 基、取代杂烷基、取代芳基、取代杂芳基、取代芳基烷基、取代烷基芳基等 )。 术语 “取代的” 包括被一种或多种指定的取代基的多种程度的取代，所述取代基例如卤代、 羟基、硫代、烷基、烯基、炔基、硝基、氰基、叠氮基、氨基、甲酰胺基 (carboxamido) 等。 在存在多种取代可能性的情况下，所述化合物可以被一个或多个公开的或要求保护 的取代基所取代，所述取代基相互独立，并且采用一次或多次。
     如本文所用且除非另外定义，术语 “保护的” 是指加到氧、氮或磷原子上以防 止其进一步反应或为了其它目的的基团。 许多氧和氮的保护基为有机合成领域的技术人 员所知。
     如本文所用，术语 “保护基” 是指可以连接到反应基团 ( 包括杂原子，例如氧 或氮 ) 上从而防止所述反应基团参与反应的基团。 可使用 Greene 等人，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991 中教导的任何保护基。合适的保 护基的实例包括但不限于烷氧基烷基，如乙氧基甲基和甲氧基甲基 ；甲硅烷基保护基， 如叔丁基二甲基甲硅烷基 (TBS)、苯基二甲基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基 (TMS)、2- 三 甲基甲硅烷基乙氧基甲基 (SEM) 和 2- 三甲基甲硅烷基乙基 ；以及苄基和取代苄基。
     应当理解，除非另外指定，上述的和本文中提及的基团的各种可能的立体异构 体在单个术语和实例的含义的范围内。 作为说明性实例， “1- 甲基 - 丁基” 以 (R) 和 (S) 二者的形式存在，因此除非另外指定，(R)-1- 甲基 - 丁基和 (S)-1- 甲基 - 丁基被术 语 “1- 甲基 - 丁基” 所涵盖。
     术语 “其盐” 是指本发明的化合物的任何酸加成盐和 / 或碱加成盐。 术语 “其 盐” 包括但不限于其药学可接受的盐。
     术语 “其溶剂合物” 是指通过溶剂化作用 ( 溶剂分子与溶质分子或离子的结 合 ) 形成的本发明的化合物，或由溶质离子或分子与一种或多种溶剂分子组成的集合体 (aggregate)。 溶剂合物的一个实例是水合物。 术语 “其溶剂合物”包括但不限于其药学 可接受的溶剂合物。
     术语 “其酯”是指本发明的化合物的任意酯，其中该分子中的任意 -COOH 官能 团被 -COOR 官能团取代，在所述 -COOR 官能团中，所述酯的 R 基团是形成稳定酯基团 的任何含有碳的基团，所述 R 基团包括但不限于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷 基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基，及其取代衍生物。 术语 “其酯” 包括但不 限于其药学可接受的酯。
     术语 “药学可接受的” 是指这样的本发明的化合物的盐、溶剂合物和 / 或酯 ： 其在合理的医学判断的范围内，适合用于与人或低级动物的组织接触，而没有过度的毒 性、刺激、过敏反应等，符合合理的收益 / 风险率，通常为水溶性的或油溶性的或者可 分散的，并且对预期用途有效。
     适用的且与本发明的化合物的化学性质相容的 “药学可接受的盐” 包括药学可 接受的酸加成盐和药学可接受的碱加成盐。 合适的盐的列表见于例如 S.M.Birge 等人， J.Pharm.Sci，1977，66， pp.1-19。
     在其中化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒性的酸或碱的盐的情况 下，给药作为盐的化合物可能是合适的。 术语药学可接受的盐或复合物是指保持本发明的化合物的期望生物活性并表现出最小的非期望的毒理学效应的盐或复合物。
     此类盐的非限定性实例是 (a) 与无机酸 ( 例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、 硝酸等 ) 形成的酸加成盐，例如硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐，和与有机酸形成 的盐，包括甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀 酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、 α- 酮戊二酸盐和 α- 甘油磷酸盐，所述有机酸例如乙 酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、扑酸、海藻酸、聚谷 氨酸、萘磺酸、萘二磺酸 (naphthalenedisulfonic acid) 和聚半乳糖醛酸 (polygalcturonic acid) ；(b) 与金属阳离子 ( 例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾、锂 等 ) 形成的碱加成盐，或与由氨、 N， N- 二苄基乙二胺、 D- 葡糖胺、四乙胺或乙二胺 形成的阳离子所形成的碱加成盐 ；或者 (c)(a) 和 (b) 的组合 ；例如鞣酸锌盐等等。 该 定义还包括本领域技术人员已知的药学可接受的季盐，其具体包括式 -NR+A- 的季铵盐， 其中 R 如上定义，并且 A 是抗衡离子，包括氯离子 (chloride)、溴离子 (bromide)、碘 离子 (iodide)、 -O- 烷基、甲苯磺酸根、甲基磺酸根、磺酸根、磷酸根、或羧酸根 ( 例 如苯甲酸根、琥珀酸根、乙酸根、乙醇酸根、马来酸根、苹果酸根、柠檬酸根、酒石酸 根、抗坏血酸根、苯甲酸根、肉桂酸根 (cinnamoate)、扁桃酸根 (mandeloate)、苄酸根 (benzyloate) 和二苯基乙酸根。
     可以使用本领域公知的标准操作来获得药学可接受的盐，例如通过使具有足够 碱性的化合物 ( 例如胺 ) 与提供生理学可接受的阴离子的合适的酸反应。
     如本文所用，“前药”是指在宿主中代谢 ( 例如水解或氧化 ) 以形成活性化合物 的化合物。 前药的代表性实例包括在所述活性化合物的官能团 (functional moiety) 上具有 生物学不稳定的保护基的化合物。 前药包括可以被氧化、还原、氨化、脱氨基化、羟基 化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰基化、脱酰基化、磷酸化、脱磷酸 化以产生所述活性化合物的化合物。
     术语 “患者” 包括人类和兽医学的个体。
     如本文所用，术语 “生物样品” 包括但不限于细胞培养物或其提取物 ；适于 体外测定的酶制品 ；获自哺乳动物的活组织检查材料或其提取物 ；以及血液、唾液、尿 液、粪便、精液、泪液或其它体液，或它们的提取物。
     术语 “癌症” 包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤，并且包括但不限于下列癌 症 ：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、食道癌、喉癌、 胶质母细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、 肺腺癌、骨癌、结肠癌、腺瘤、胰腺癌、腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状 癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌和胆道癌、肾癌、髓性病症、淋巴病 症、霍奇金病、毛细胞癌、口腔癌和咽 ( 口 ) 癌、唇癌、舌癌、口癌、咽癌、小肠癌、结 肠 - 直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑癌和中枢神经系统癌症，以及白血病。 术语 “癌症” 包括原发性癌症、治疗继发性癌症和转移癌症。
     术语 “药学可接受的载体” 是指可与本发明的化合物共同向患者给药并且不破 坏其药理学活性的无毒载体、辅剂或媒介物。
     如本文所用，术语 “GSK-3 介导的疾病” 或 “GSK-3 介导的病状” 意指其中 已知 GSK-3 起作用的任何疾病或其它有害的病状或状态。 此类疾病或病状包括但不限于糖尿病、阿尔茨海默病、亨延顿病、帕金森病、 AIDS- 相关的痴呆、肌萎缩侧索硬化 (AML)、多发性硬化 (MS)、精神分裂症、心肌细胞肥大 (cardiomycete hypertrophy)、再 灌注 / 缺血和脱发。
     如本文所用，术语 “CDK-2 介导的疾病” 或 “CDK-2 介导的病状” 是指其 中已知 CDK-2 起作用的任何疾病或其它有害的病状。 术语 “CDK-2 介导的疾病” 或 “CDK-2 介导的病状” 还指通过用 CDK-2 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 此类 病状包括但不限于癌症、阿尔茨海默病、再狭窄、血管发生、肾小球性肾炎、巨细胞病 毒、 HIV、疱疹、银屑病、动脉粥样硬化、脱发和自身免疫疾病如类风湿性关节炎，例 如在 Fischer， P.M. 和 Lane， D.P.， Current Medicinal Chemistry，7，1213-1245(2000) ； Mani， S.， Wang， C.， Wu， K.， Francis， R. 和 Pestell， R.， Exp.Opin.Invest.Drugs， 9，1849(2000) ；Fry，D.W. 和 Garrett，M.D.，Current Opinion in Oncologic，Endocrine & Metabolic Investigational Drugs，2，40-59(2000) 中所记载的病状。
     如本文所用，术语 “ERK 介导的疾病” 或 “ERK 介导的病状” 是指其中 ERK 可能起作用的任何疾病或其它有害的病状。 术语 “ERK 介导的疾病” 或 “ERK 介导 的病状” 还指通过用 ERK-2 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 此类病状包括但不 限于癌症、中风、糖尿病、肝肿大、心血管疾病 ( 包括心脏扩大 )、阿尔茨海默病、囊 性纤维化、病毒病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、银屑病、过敏性病症 ( 包 括哮喘 )、炎症、神经学病症和与激素相关的疾病。 ERK-2 蛋白激酶及其在多种疾病 中的作用已记载于例如 Bokemeyer 等人，1996， Kidney Int.49，1187 ；Anderson 等人， 1990， Nature 343，651 ；Crews 等人，1992， Science 258，478 ；Bjorbaek 等人，1995， J.Biol.Chem.270，18848 ；Rouse 等 人，1994， Cell 78，1027 ；Raingeaud 等 人，1996， Mol.Cell Biol.16，1247 ；Raingeaud 等 人，1996 ；Chen 等 人，1993Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90，10952 ；Oliver 等 人，1995， Proc.Soc.Exp.Biol.Med.210，162 ；Moodie 等 人， 1993， Science 260，1658 ；Frey 和 Mulder，1997， Cancer Res.57，628 ；Sivaraman 等 人，1997， J Clin.Invest.99，1478 ；Whelchel 等人，1997， Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.16， 589 中。
     如本文所用，术语 “AKT 介导的疾病” 或 “AKT 介导的病状” 是指其中已知 AKT 起作用的任何疾病或其它有害的病状。术语 “AKT 介导的疾病”或 “AKT 介导的病 状”还指通过用 AKT 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 AKT 介导的疾病或病状包括 但不限于增殖性病症、癌症和神经变性病症。 AKT( 也称为蛋白激酶 B) 与多种疾病的关 联已记载于例如 Khwaja， A.， Nature， pp.33-34，1990 ；Zang， Q.Y. 等人， Oncogene， 192000 ；Kazuhiko， N. 等人， The Journal of Neuroscience，202000 中。
     如本文所用，术语 “Src 介导的疾病” 或 “Src 介导的病状” 是指其中已知 Src 起作用的任何疾病或其它有害的病状。 术语 “Src 介导的疾病” 或 “Src 介导的病状” 还指通过用 Src 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 此类病状包括但不限于高钙血症、 骨质疏松症、骨关节炎、癌症、骨转移的对症治疗和佩吉特病。 Src 蛋白激酶及其在多 种疾病中的作用已记载于例如 Soriano，Cell，69，551(1992) ；Soriano 等人， Cell，64， 693(1991) ；Takayanagi， J.Clin.Invest.，104，137(1999) ；Boschelli， Drugs of the Future 2000，25(7)，717， (2000) ；Talamonti， J.Clin.Invest.，91，53(1993) ；Lutz， Biochem.Biophys.Res. 243 ， 503(1998) ；Rosen ， J.Biol.Chem. ， 261 ， 13754(1986) ；Bolen ， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2251(1987) ；Masaki， Hepatology，27，1257(1998) ； Biscardi ， Adv.Cancer Res. ， 76 ， 61(1999) ；Lynch ， Leukemia ， 7 ， 1416(1993) ； Wiener， Clin.Cancer Res.，5，2164(1999) ；Staley， Cell Growth Diff.，8，269(1997) 中。
     如本文所用，术语 “Lck 介导的疾病” 或 “Lck 介导的病状” 是指其中已知 Lck 起作用的任何疾病状态或其它有害的病状。 术语 “Lck 介导的疾病” 或 “Lck 介导的病 状” 还指通过用 Lck 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 Lck 介导的疾病或病状包括 但不限于自身免疫疾病，如移植排斥、变态反应、类风湿性关节炎和白血病。 Lck 与多 种疾病的关联已记载于例如 Molina 等人， Nature，357，161(1992) 中。
     如本文所用，术语 “Abl 介导的疾病” 或 “Abl 介导的病状” 是指其中已知 Abl 起作用的任何疾病状态或其它有害的病状。 术语 “Abl 介导的疾病” 或 “Abl 介导的病 状” 还指通过用 Abl 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 Abl 介导的疾病或病状包括 但不限于白血病，特别是慢性髓样白血病。 Abl 与多种疾病的关联已记载于例如 Druker 等人， N.Engl.J.Med.2001，344，1038-1042 中。
     如本文所用，术语 “cKit 介导的疾病”或 “cKit 介导的病状”是指其中已知 cKit 起作用的任何疾病状态或其它有害的病状。 术语 “cKit 介导的疾病” 或 “cKit 介导的 病状” 还指通过用 cKit 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 cKit 介导的疾病或病状包 括但不限于肥大细胞增多症 / 肥大细胞白血病、胃肠道间质瘤、鼻窦自然杀伤 (sinonasal natural killer)/T 细胞淋巴瘤、精原细胞瘤 / 无性细胞瘤、甲状腺癌 (throid carcinoma)、 小细胞肺癌、恶性黑素瘤、腺样囊性癌、卵巢癌、急性髓性白血病、退行性大细胞淋巴 瘤、血管肉瘤、子宫内膜癌、小儿 T 细胞急性淋巴细胞白血病 / 淋巴瘤、乳腺癌和前列腺 癌。 cKit 与多种疾病的关联已记载于例如 Heinrich 等人， J Clinical Oncology2002，20， 1692-1703 中。
     如本文所用，术语 “Flt3 介导的疾病”或 “Flt3 介导的病状”是指其中已知 Flt3 起作用的任何疾病状态或其它有害的病状。 术语 “Flt3 介导的疾病” 或 “Flt3 介导的病 状” 还指通过用 Flt3 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 Flt3 介导的疾病或病状包括 但不限于急性髓性白血病、混合性白血病和急性淋巴细胞性白血病。 Flt3 与多种疾病的 关联已记载于例如 Sternberg 和 Licht， Curr.Opin Hematol.2004，12，7-13 中。
     如本文所用，术语 “KDR 介导的疾病” 或 “KDR 介导的病状” 是指其中已知 KDR 起作用的任何疾病状态或其它有害的病状。 术语 “KDR 介导的疾病”或 “KDR 介 导的病状” 还指通过用 KDR 抑制剂治疗而缓解的那些疾病或病状。 KDR 介导的疾病或 病状包括但不限于肺癌、乳腺癌、胃肠道癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌和子宫内膜癌、颅 内肿瘤 ( 包括多形性胶质母细胞瘤 (glioblatoma multiforme))、散发性毛细血管血管母细 胞瘤 (sporadic capillary hemangioblastoma)、骨髓恶性肿瘤 ( 包括 T 细胞淋巴瘤、急性成淋 巴细胞性白血病、Burkitt 淋巴瘤和前髓细胞性白血病 )、老年性黄斑变性、疱疹性眼病、 类风湿性关节炎、脑缺血和子宫内膜异位。 KDR 与多种疾病的关联已记载于 Ferrara， Endocrine Reviews 2004，25，581-611 中。
     如本文所用，术语 “HSP90 介导的疾病” 或 “HSP90 介导的病状” 是指其中已知 HSP90 起作用的病状。 所述病状包括但不限于炎性病症、异常细胞增殖、自身免 疫病症、缺血，纤维发生 (fibrogenetic) 病症 ( 包括但不限于硬皮症、多肌炎、全身性狼 疮、类风湿性关节炎、肝硬化、瘢痕形成、间质性肾炎和肺纤维化 )。 (Strehlow， WO 02/02123 ；PCT/US01/20578)。
     治疗方法
     本文所述的化合物特别用于治疗或预防由激酶或 HSP90 介导的病症。 在一实施 方案中，本文所述的化合物用于治疗或预防增殖性病症，包括癌症转移。 在另一实施方 案中，本文所述的化合物用于治疗或预防与激酶或 HSP90 有关的炎性病症。
     NF2 和 NF1 患者中的肿瘤的特别之处在于它们是生长缓慢的肿瘤。 NF2 和 NF1 肿瘤在肿瘤抑制基因中均具有杂合性的突变或缺失，但所述肿瘤抑制基因是不同的，即 分别为 NF2 基因和 NF1 基因。 本发明的发明人已发现 HSP90 抑制剂有效地阻碍了缺乏 NF2 的和缺乏 NF1 的肿瘤细胞的增殖，并且还延迟了小鼠中的缺乏 NF2 的和缺乏 NF1 的 肿瘤的生长。 Merlin 调节多种细胞表面受体的多度和周转，并且与多种途径相互作用。 这些蛋白质中的许多是 HSP90 的客户蛋白。 例如，ErbB2 和其它受体酪氨酸激酶、AKT 和 Raf 是公认的 HSP90 的客户蛋白。 此外，已在 NF2 患者的人神经鞘瘤 ( 与正常的神经 相比 ) 中，缺乏 NF2 的人肿瘤异种移植物 ( 例如脑膜瘤和间皮瘤 ) 中，和缺乏 Nf-2 的小 鼠许旺细胞 (Schwann cell) 肿瘤中发现了 PI3K/AKT 途径的异常活化 ( 参考 2007 年 6 月 4 日提交的标题为 “Treatment of Neurofibromatosis with Inhibitors of a Signal Transduction Pathway” 的 PCT/US2007/70366，其整体援引加入 )。 Neurofibromin 是 Ras 的负调节 物。 Ras 的直接下游效应物 Raf 是公知的 HSP90 的客户蛋白。 还证明 Neurofibromin 对 AKT 的调节。 因此抑制 HSP90 的化合物很可能能够降低缺乏 NF2 的细胞或缺乏 NF1 的 细胞中的 AKT 和其它 HSP90 客户蛋白 ( 例如 ErbB2、IGF-IR 和 Raf) 的量。 这些蛋白质 的量或活性的降低可以用于降低或稳定缺乏 NF2 的细胞或缺乏 NF1 的细胞的增殖，或者 引起缺乏 NF2 的细胞或缺乏 NF1 的细胞的凋亡。 抑制 HSP90 的活性的化合物是这样的化 合物，其与 HSP90 蛋白直接结合，或翻译后地修饰 HSP90 蛋白，或调节 HSP 蛋白 ( 例如 HSP70 和 HSP27) 的转录 (Zaarur 等人，2006，Cancer Res.66(3) ：1783-1791)。 例如，可 以通过组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂将 HSP90 乙酰化及灭活 (Kovacs 等人，2005， Mol.Cell 18(5) ：601-607 ；Fuino 等 人，2003， Mol.Cancer Ther.2 ：971-984 ；Aoyagi 和 Archer，2005， Trends Cell.Biol.15(11) ：565-567)。 因此，确定 HSP90 抑制化合物用于 可能对传统化疗和其它针对快速生长的异质癌症细胞的癌症疗法没有很好的应答的治疗 缺乏 NF2 的肿瘤和缺乏 NF1 的肿瘤。
     NF-2 相关肿瘤
     患有 II 型神经纤维瘤病的患者患有缺乏 NF2 的肿瘤。 该基因特征 ( 即 NF2 基 因的失活 ) 将在 NF2 患者中发现的肿瘤与基因异质性肿瘤 ( 如乳腺癌肿瘤和结肠癌肿瘤 ) 区分开来。 例如，NF2 患者患有缺乏 NF2 的脑膜瘤，而一些非缺乏 NF2 的脑膜瘤患者可 能在许多不同的致癌基因或肿瘤抑制基因中含有突变。
     如本文所用，“缺乏 NF2 的肿瘤”是指含有非功能性 NF2 基因的肿瘤。 非功能 性 NF2 基因可以是 NF2 基因内的一个或多个插入突变或缺失突变 ( 例如误义突变或无义 突变、导致无 / 低 NF2 基因表达的启动子或增强子或内含子中的突变，或整个 NF2 基因的缺失 ) 所导致的。 在间皮瘤和患有 NF2 的患者中发现缺乏 NF2 的肿瘤，所述缺乏 NF2 的肿瘤包括神经鞘瘤、脑膜瘤和其它与神经系统相关的肿瘤。 还在所有患有散发性神经 鞘瘤 (sporadic schwannomas) 的患者和 50％ -70％的患有脑膜瘤的患者中发现缺乏 NF2 的 肿瘤。
     存在缺乏 NF2 的双侧前庭神经鞘瘤 ( 即许旺细胞肿瘤 ) 是 NF2 的标志。 本发明 的方法可以用于抑制缺乏 NF2 的神经鞘瘤细胞的生长和 / 或将其杀死，所述缺乏 NF2 的 神经鞘瘤细胞包括与前庭神经鞘瘤、脊髓和其它外周神经鞘瘤以及散发性神经鞘瘤相关 的那些神经鞘瘤细胞。
     Merlin 以及信号蛋白和途径
     如 本 文 所 用， “缺 乏 NF2 的 肿 瘤” 是 指 含 有 非 功 能 性 NF2 基 因 的 肿 瘤。 Merlin 与蛋白质和途径相互作用或对其进行调节，但不限于此，所述蛋白质和途径 例 如 Paxillin /Integrin - β 1/ErbB 2、 EGFR 、 Patched / Smoothened 、 HRS、 CD 44、 E-Cadherin、Fat、EBP50/NHE-RF/PDGFR、Wingless、Notch、Rac-PAK、PI3K-AKT、 Ras-Raf-Mek-Erk2、Hippo 途径，以及它们的下游蛋白质 (downstream proteins)。 图 1 是 Merlin 与多种细胞表面蛋白质和信号途径的相互关系的示意图。 治疗 NF2 可能需要针对 多种蛋白质和途径。
     NF1 相关肿瘤
     患有 I 型神经纤维瘤病的患者患有缺乏 NF1 的肿瘤。 该基因特征 ( 即 NF1 基因 的失活 ) 将在 NF1 患者中发现的肿瘤与基因异质性肿瘤 ( 如乳腺癌肿瘤和结肠癌肿瘤 ) 区 分开来。 例如，所有在 NF1 患者中发现的肿瘤都具有 NF1 基因突变，而患有其它癌症的 患者则具有不同基因中的突变或不同基因的过度表达。
     如本文所用， “缺乏 NF1 的肿瘤” 是指含有非功能性 NF1 基因的肿瘤。 非功 能性 NF1 基因可以是 NF1 基因内的一个或多个插入突变或缺失突变 ( 例如误义突变或无 义突变、导致无 / 低 NF1 基因表达的启动子或增强子或内含子中的突变，或整个 NF1 基 因的缺失 ) 所导致的。 在患有 NF1 的患者中发现缺乏 NF1 的肿瘤，所述缺乏 NF1 的肿 瘤包括皮肤神经纤维瘤、皮下神经纤维瘤、丛状神经纤维瘤，以及 MPNST 和其它与神经 系统相关的肿瘤。 缺乏 NF1 还使个体易患白血病的罕见形式 JMML。
     NF1 的诊断通过执行 NIH 临床标准或通过用突变分析发现 NF1 突变得以证实。 本发明的方法可以用于抑制缺乏 NF1 的肿瘤的生长或将其杀死，所述缺乏 NF1 的肿瘤包 括皮肤神经纤维瘤、皮下神经纤维瘤、丛状神经纤维瘤、 MPNST、神经胶质瘤、星状细 胞瘤、嗜铬细胞瘤和 JMML。
     本发明提供式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物作为 HSP90 抑制剂用于治疗、预防 或改善由神经纤维瘤病导致的肿瘤或症状的用途。 还提供包含所述化合物的组合物以及 制备所述化合物的方法。
     本发明包括通过使缺乏 NF2 的或缺乏 NF1 的肿瘤细胞接触根赤壳菌素及其衍生 物 ( 即用根赤壳菌素及其衍生物治疗缺乏 NF2 的或缺乏 NF1 的肿瘤细胞 ) 来抑制所述细 胞的生长的方法，所述根赤壳菌素及其衍生物例如一种或多种上述的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物。 本发明还包括通过使缺乏 NF2 的或缺乏 NF1 的肿瘤细胞接触根赤壳菌素及 其衍生物来降低所述细胞的增殖的方法，所述根赤壳菌素及其衍生物例如一种或多种上述的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物。
     在一实施方案中，通过将用本发明的化合物治疗的缺乏 NF2 的或缺乏 NF1 的肿 瘤细胞的样品与对照 ( 例如未治疗的缺乏 NF2 的或缺乏 NF1 的肿瘤细胞的样品，或用已 知的惰性化合物治疗的细胞样品 ) 相比较，以确定对 NF2 或 NF1 细胞生长的抑制。 在 使细胞接触本发明的化合物之前，缺乏 NF2 的细胞样品或缺乏 NF1 的细胞样品 ( 经治疗 的和对照 ) 均应由大约相同数量的细胞构成，并具有相同的细胞类型 ( 例如缺乏 NF2 的 神经鞘瘤或缺乏 NF1 的 MPNST 细胞 )。 与对照相比，用根赤壳菌素及其衍生物治疗的 缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细胞在经化合物治疗后可能在数量上下降至少 约 10％、至少约 20％、至少约 30％、至少约 40％、至少约 50％、至少约 60％、至少约 70％、至少约 80％、至少约 90％或约 100％。
     在本发明的一实施方案中，将所述药物组合物直接施用于缺乏 NF2 的肿瘤或缺 乏 NF1 的肿瘤的位点。 例如，可以通过局部治疗 ( 包括局部治疗和病灶内 (intralesional) 或皮内治疗 ) 将所述 HSP90 抑制剂施用于肿瘤位点。 因此，可以将所述抑制剂注射到缺 乏 NF2 的肿瘤或缺乏 NF1 的肿瘤中、局部施用到其上或附近。 在本发明的一实施方案 中，通过本领域已知的方法将所述抑制剂病灶内施用到缺乏 NF2 的肿瘤或缺乏 NF1 的肿 瘤上。
     本发明包括治疗、预防或改善个体中的由神经纤维瘤病导致的肿瘤或症状的方 法，其包括向患有 II 型神经纤维瘤病 (NF2) 或与 NF2 功能丧失相关的病状、或者患有 I 型神经纤维瘤病 (NF1) 或与 NF1 功能丧失相关的病状的所述个体给药治疗有效量的至少 一种包含至少一种本发明化合物的组合物，为了确定治疗效用，其与作为对照水平的未 用所述组合物治疗的情形相比较，抑制或减缓一种或多种缺乏 NF2 的肿瘤或缺乏 NF1 的 肿瘤的生长，减少所述肿瘤的数量或抑制和 / 或减少相关的症状。 本发明特别涉及给药 至少一种包含本发明化合物的组合物，其引起一种或多种缺乏 NF2 的肿瘤或一种或多种 缺乏 NF1 的肿瘤的大小和 / 或数量的下降。
     本发明的方法包括给药抑制或降低 HSP90 复合物的功能的本发明的化合物。 更 具体地，本发明的化合物与 HSP90 蛋白结合并对其进行抑制、翻译后地修饰 HSP90 蛋 白，和 / 或从 HSP70 或其它 HSP 蛋白的正常水平开始增加在它们缺乏 NF2 的或缺乏 NF1 的肿瘤中的水平。 给药本发明的化合物引起所述个体中的 HSP70 的上调或增加。 此外， 所述方法包括给药降解或减少一种或多种 HSP90 客户蛋白以及所述客户蛋白的磷酸化形 式的本发明的化合物。 此外，所述方法包括给药抑制或降低与一种或多种 HSP90 客户蛋 白缔合的信号途径蛋白质的活性或磷酸化的本发明的化合物。 所述一种或多种客户蛋白 选自 ErbB2、 AKT 和 Raf。 所述 HSP90 抑制剂抑制或降低信号途径蛋白质 ( 如 PI3K、 mTOR、 GSK3、4E-BP1、 Bad、 FKHR、 HSP90、 S6K、 S6、 Mek 和 Erk1/2) 的活性或 磷酸化。
     本发明的方法治疗、预防或改善由 II 型神经纤维瘤病 (NF2) 或与 NF2 功能丧失 相关的病状引起的肿瘤或症状。 更具体地，所述一种或多种缺乏 NF2 的肿瘤包括前庭神 经鞘瘤，并且更具体地，包括单侧前庭神经鞘瘤或双侧前庭神经鞘瘤。 此外，所述待治 疗的一种或多种缺乏 NF2 的肿瘤包括脊髓神经鞘瘤、散发性神经鞘瘤、外周神经鞘瘤、 神经鞘瘤、脑膜瘤、间皮瘤、室管膜瘤、神经胶质瘤和星形细胞瘤。所述方法包括给药本发明的化合物以获得以下结果 ：所述个体的听力、平衡和 视力中的至少一项的改善 ；肌肉质量 (muscle mass) 的增加 ；所述个体中的肿瘤负荷的减 少，其中使用 MRI 或 CAT 扫描来确认后者。
     本发明的方法治疗、预防或改善由 I 型神经纤维瘤病 (NF1) 或与 NF1 功能丧失相 关的病状引起的肿瘤或症状。 更具体地，所述一种或多种缺乏 NF1 的肿瘤包括皮肤神经 纤维瘤和丛状神经纤维瘤、视神经星形细胞瘤 (optic pathway astrocytoma)、视神经瘤、 视神经胶质瘤、脑星形细胞瘤、脑神经胶质瘤、室管膜瘤、嗜铬细胞瘤和神经节瘤、横 纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、恶性周围神经鞘瘤 (MPNST)、恶性神经鞘瘤和 JMML。
     本发明还包括抑制或减少缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细胞的生长或 数量的方法，其包括使缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细胞与至少一种包含至 少一种本发明化合物的组合物相接触，其抑制或减缓一种或多种缺乏 NF2 的肿瘤或缺乏 NF1 的肿瘤的生长和 / 或降低其数量。 所述方法包括使所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细胞与所述化合物在体外或离体相接触。所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞是缺乏 Nf2 的小鼠许旺细胞，并且所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞是缺乏 Nf1 的小鼠许旺细胞。 或者所述 缺乏 NF2 的肿瘤细胞是缺乏 NF2 的人神经鞘瘤细胞，并且所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞是缺 乏 NF1 的人许旺细胞。 所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞选自缺乏 NF2 的神经鞘瘤细胞系细胞、 缺乏 NF2 的脑膜瘤细胞系细胞和缺乏 NF2 的间皮瘤细胞系细胞。 所述缺乏 NF2 的肿瘤细 胞选自 HEI193 细胞、 SF1335 细胞、 BAR 细胞和 RAV 细胞。 所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞 选自人 MPNST 细胞、源自 NF1 患者的原发性神经纤维瘤细胞、由 cisNf1 ；p53 小鼠建立 的缺乏 Nf1 ；p53 的小鼠 MPNST 细胞系，以及 Nf1-/- 小鼠细胞，例如许旺细胞、小鼠胚 胎细胞和白血病细胞。 更具体地，所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞选自 ST88-14、88-3、90-8 和 sNF96.2。 与所述 HSP90 抑制剂接触的缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细胞可 以存在于体内。 所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞或所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞来自于人类、犬、 大鼠或小鼠。
     本发明的方法包括使缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细胞与本发明的抑 制 HSP90 功能的化合物相接触。 本发明进一步包括使所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞或所述缺 乏 NF1 的肿瘤细胞与引起 HSP70 上调的本发明的化合物相接触。 进一步地，所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞或所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞与本发明的化合物的接触引起 ErbB2 和 / 或磷 酸化 ErbB2 的降解、Akt 和 / 或磷酸化 Akt 的降解，或者 Raf 和 / 或磷酸化 Raf 的降解。 更具体地，所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞或所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞与本发明的化合物的接 触引起 ErbB2、Akt 或 Raf 信号途径的下游蛋白质的磷酸化的下降。 用抗体检测所述蛋白 质的降解或上调，或者磷酸化蛋白质的下降。
     在另一实施方案中，本发明包括筛选用于治疗 NF-2 或 NF-1 的测试化合物的方 法，其包括将缺乏 NF-2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞用所述测试化合物治疗或者与其接 触，其中一种或多种 HSP90 客户蛋白的降解、或与一种或多种 HSP90 客户蛋白相关的信 号途径的活性降低、或 HSP70 的增加表明了对 NF-2 或 NF-1 的有效治疗。 所述方法进一 步包括评价对 HSP90 功能的抑制。 对 HSP90 功能的抑制引起 HSP70 的上调。 所述一种 或多种 HSP90 客户蛋白选自 ErbB2、AKT 和 Raf。 此外，所述与一种或多种 HSP90 客户 蛋白相关的信号途径是 ErbB2 途径、AKT 途径或 Raf 途径，其包含至少一种选自 ErbB2、AKT、 Raf、 mTOR、 GSK3、4E-BP1、 Bad、 FKHR、 S6K、 S6、 Mek 和 Erk1/2 的蛋白 质。 具体地，所述一种或多种客户蛋白是 AKT，所述 AKT 被所述测试化合物降解，引 起 AKT 的磷酸化的下降。 所述治疗引起 S6、 GSK3、 FKHR、 Mek 或 Erk1/2 的磷酸化 的下降。 用抗体检测磷酸化的下降。
     本发明的方法进一步包括测量用所述测试化合物治疗后的缺乏 NF-2 的细胞或缺 乏 NF-1 的细胞，其中用所述测试化合物治疗后的缺乏 NF-2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞 数量的下降或者用所述测试化合物治疗后的缺乏 NF-2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞增殖的 下降表明了有效的治疗。 此外，所述方法进一步包括将治疗后的缺乏 NF2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞与未治疗的缺乏 NF2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞相比较，其中与未治疗的缺 乏 NF2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞相比，用所述测试化合物治疗后的一种或多种 HSP90 客 户蛋白的下降表明了有效的治疗。 此外，所述方法进一步包括将治疗后的缺乏 NF2 的细 胞或缺乏 NF-1 的细胞与未治疗的缺乏 NF2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞相比较，其中与未 治疗的缺乏 NF2 的细胞或缺乏 NF-1 的细胞相比，用所述测试化合物治疗后的缺乏 NF2 的 细胞或缺乏 NF-1 的细胞的数量的下降，或者用所述测试化合物治疗后的缺乏 NF2 的细胞 或缺乏 NF-1 的细胞增殖的下降表明了有效的治疗。用所述测试化合物对所述缺乏 NF2 的 细胞或缺乏 NF1 的细胞的治疗发生在体外或离体。 所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞是缺乏 Nf2 的小鼠许旺细胞，并且所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞是缺乏 Nf1 的小鼠许旺细胞。 同样，所 述缺乏 NF2 的肿瘤细胞是缺乏 NF2 的人神经鞘瘤细胞，并且所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞是 缺乏 NF1 的人许旺细胞。
     所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞选自缺乏 NF2 的神经鞘瘤细胞系细胞、缺乏 NF2 的脑 膜瘤细胞系细胞和缺乏 NF2 的间皮瘤细胞系细胞。 所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞选自 HEI193 细胞、SF1335 细胞、BAR 细胞和 RAV 细胞。 所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞选自人 MPNST 细 胞、源自 NF1 患者的原发性神经纤维瘤细胞、由 cisNf1 ；p53 小鼠建立的缺乏 Nf1 ；p53 的小鼠 MPNST 细胞系，以及 Nf1-/- 小鼠细胞，例如许旺细胞、小鼠胚胎细胞和白血病 细胞。 更具体地，所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞选自 ST88-14、88-3、90-8 和 sNF96.2。 与 所述 HSP90 抑制剂接触的缺乏 NF2 的肿瘤细胞或缺乏 NF1 的肿瘤细胞可以存在于体内。 所述缺乏 NF2 的肿瘤细胞或所述缺乏 NF1 的肿瘤细胞来自于人类、犬、大鼠或小鼠。
     本发明的一方面涉及用于治疗癌症的化合物和组合物。
     本发明的另一方面涉及以下癌症的治疗 ：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺 癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、食道癌、喉癌、胶质母细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮 瘤、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、肺腺癌、骨癌、结肠癌、腺瘤、胰腺癌、 腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱 癌、肝癌和胆道癌、肾癌、髓性病症、淋巴病症、霍奇金病、毛细胞癌、口腔癌和咽 ( 口 ) 癌、唇癌、舌癌、口癌、咽癌、小肠癌、结肠 - 直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑癌和 中枢神经系统癌症，以及白血病。
     本发明的另一方面是治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者给药有效量的 本文所述的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物。
     血管发生的特征为内皮细胞增殖从而形成新血管 ( 通常称为新生血管形成 )。 对 内皮细胞有丝分裂的抑制导致对血管发生的抑制。 因此本发明的另一方面涉及对包括不期望的血管发生在内的不期望的有丝分裂的抑制。 如本文所定义，以不期望的细胞有丝 分裂为特征的哺乳动物疾病包括但不限于内皮细胞的过度或异常刺激 ( 例如动脉粥样硬 化 )、实体瘤和肿瘤转移、良性肿瘤 ( 例如血管瘤、听神经瘤、沙眼和化脓性肉芽肿 )、 血管功能障碍、伤口愈合异常、炎性和免疫病症、白塞病、痛风或痛风性关节炎、伴随 血管发生异常的类风湿性关节炎、皮肤疾病 ( 例如银屑病 )、糖尿病性视网膜病变和其它 眼部血管发生疾病，例如早产儿视网膜病 ( 晶体后纤维增生症 )、黄斑变性、角膜移植片 排斥、新生血管性青光眼和 Osler Weber 综合征 (Osler-Weber-Rendu 病 )。
     其它不期望的血管发生包括包含排卵和囊胚植入的正常过程。 上述组合物可通 过减少或防止胚胎植入所需的子宫血管形成而用作节育剂。 因此，上述组合物可用于阻 断排卵和囊胚植入或阻断月经 ( 诱发闭经 )。
     根据本发明，可治疗包括新生血管形成在内的与不期望的有丝分裂相关的疾 病。 这样的疾病包括但不限于眼新生血管性疾病、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜 病、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼和晶体后纤维增生症、流行性角膜结膜炎、维 生素 A 缺乏病、接触镜超戴症、异位性角膜炎、上角膜缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜 炎、干燥综合征 ( syndrome)、红斑痤疮、小水疱病 (phylectenulosis)、梅毒、 分枝杆菌 (Mycobacteria) 感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯 疱疹 (Herpes simplex) 感染、带状疱疹 (Herpes zoster) 感染、原虫感染、卡波西肉瘤、莫 伦溃疡、角膜 Terrien 边缘性变性、边缘性角质层分离、创伤、类风湿性关节炎、全身性 狼疮、多动脉炎、韦格内结节病、巩膜炎、斯 - 琼二氏病、类天疱疮、放射状角膜切开 术和角膜移植片排斥。
     根据本发明，可治疗包括新生血管形成在内的与不期望的有丝分裂相关的其它 疾病。 这样的疾病包括但不限于镰状细胞性贫血、结节病、弹性假黄色瘤、佩吉特病、 静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎 / 玻璃体炎、 Lyme′ s 病、全 身性红斑狼疮、伊尔斯病、白塞病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、眼假组织胞浆菌 病、贝斯特病、近视、视窝、 Stargart 病、睫状体扁平部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综 合征、弓形体病和激光治疗后并发症。 其它疾病包括但不限于与发红相关的疾病 ( 虹膜 和角的新生血管形成 ) 和由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式 的增生性玻璃体视网膜病变 ( 无论是否与糖尿病相关 )。
     本发明的另一方面涉及炎性疾病的治疗，所述炎性疾病包括但不限于内皮细胞 的过度或异常刺激 ( 例如动脉粥样硬化 )、实体瘤和肿瘤转移、良性肿瘤 ( 例如血管瘤、 听神经瘤、沙眼和化脓性肉芽肿 )、血管功能障碍、伤口愈合异常、炎性和免疫病症、 白塞病、痛风或痛风性关节炎、伴随血管发生异常的类风湿性关节炎、皮肤疾病 ( 例如 银屑病 )、糖尿病性视网膜病变和其它眼部血管发生疾病，例如早产儿视网膜病 ( 晶体 后纤维增生症 )、黄斑变性、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼或 Osler Weber 综合征 (Osler-Weber-Rendu 病 )。其它不期望的血管发生包括包含排卵和囊胚植入的正常过程。 因此，上述组合物可用于阻断排卵和囊胚植入或阻断月经 ( 诱发闭经 )。
     本发明的另一方面涉及在患者中抑制 HSP90 活性的方法，其包括向患者给药有 效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药学可接受的盐或前药。 本发明还提供治疗 由 HSP90 介导的疾病的方法。本发明的另一方面涉及在患者中抑制 AuroraA 活性的方法，其包括向患者给药 有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药学可接受的盐或前药。
     本发明的另一方面涉及用 GSK-3 抑制剂治疗或预防 GSK-3 介导的疾病的方法， 其包括向患者给药有效量的式 I、II、III、IV 或 V 的化合物或其药学可接受的盐或前药。
     本发明的一方面涉及在有此需要的患者中增强糖原合成和 / 或降低葡萄糖的血 液水平的方法，所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的式 I、II、III、IV 或 V 的化合 物或其药物组合物。 此方法特别用于糖尿病患者。 另一方法涉及抑制高度磷酸化的 Tau 蛋白的产生，其用于中止或延缓阿尔茨海默病的进展。 另一方法涉及抑制 β- 连环蛋白 的磷酸化，其用于治疗精神分裂症。
     本发明的另一方面涉及在生物样品中抑制 GSK-3 的活性，该方法包括使所述生 物样品接触式 I、 II、 III、 IV 或 V 的 GSK-3 抑制剂。
     本方面的另一方面涉及在患者中抑制 GSK-3 活性的方法，其包括向所述患者给 药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及治疗或预防 CDK-2 介导的疾病的方法，其包括向需要此 类治疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 CDK-2 活性，该方法包括向所 述患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及治疗或预防 ERK-2 介导的疾病的方法，其包括向需要此 类治疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 ERK-2 活性，该方法包括向所 述患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及治疗或预防 AKT 介导的疾病的方法，其包括向需要此类 治疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 AKT 活性，该方法包括向所述 患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及治疗或预防 Src 介导的疾病的方法，其包括向需要此类治 疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 Src 活性，该方法包括向所述患 者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及用 Lck 抑制剂治疗或预防 Lck 介导的疾病的方法，其包括 向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合 物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 Lck 活性，该方法包括向所述 患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及用 Abl 抑制剂治疗或预防 Abl 介导的疾病的方法，该方法 包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的式 I、II、III、IV 或 V 的化合物或其药物组 合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 Abl 活性，该方法包括向所述 患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。本发明的另一方面涉及治疗或预防 cKit 介导的疾病的方法，其包括向需要此类 治疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 cKit 活性，该方法包括向所述 患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及治疗或预防 Flt3 介导的疾病的方法，其包括向需要此类 治疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 Flt3 活性，该方法包括向所述 患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     本发明的另一方面涉及治疗或预防 KDR 介导的疾病的方法，其包括向需要此类 治疗的患者给药治疗有效量的式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或其药物组合物。
     本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中抑制 KDR 活性，该方法包括向所述 患者给药式 I、 II、 III、 IV 或 V 的化合物或包含所述化合物的组合物。
     有效抑制蛋白激酶的量是 ：当与不存在抑制剂时的酶活性比较时，引起对所述 激酶活性的可测量的抑制量。 任何方法均可用于测定抑制，例如下文所述的生物测试实 施例。
     药物组合物
     通过吸入、全身、口服、局部或经皮给药 ( 任选地在药学可接受的载体或稀释 剂中的 ) 含有有效量的本文所述的化合物或其药学可接受的盐、酯或前药的组合物，可 治疗患有呼吸病症的哺乳动物，特别是人类。
     所述化合物或组合物通常通过口服或吸入给药来给药。 或者，可经皮下、静脉 内、腹膜内、肌内、肠胃外、口服、粘膜下、通过吸入、经由缓释贴剂经皮，或局部给 药有效剂量范围的化合物来治疗目标病状。
     通过使用常规技术并通过观察在类似情况下获得的结果，可以容易地测定有效 剂量。 在测定有效剂量时，考虑了许多因素，包括但不限于 ：患者的物种 ；其大小、年 龄和一般健康 ；涉及的具体疾病 ；所述疾病的涉及程度或其严重性 ；单个患者的反应 ； 所给药的特定化合物 ；给药方式 ；所给药的制剂的生物利用度特征 ；所选的剂量方案 ； 和伴随药物 (concomitant medication) 的使用。
     在一单独的实施方案中，本发明的化合物是吸入剂量形式。 在该实施方案中， 所述化合物可以是气溶胶混悬液 (aerosol suspension)、干粉或液体颗粒的形式。 可以将 所述化合物制备成鼻腔喷雾剂或将其制备于吸入器 ( 例如计量吸入器 ) 中用于递送。 加 压计量吸入器 ( “MDI” ) 通常递送雾化 (aerosolized) 的颗粒，所述颗粒与或不与表 面活性剂和合适的架桥剂 (bridging agent) 一同悬浮于含氯氟烃抛射剂 ( 例如 CFC-11、 CFC-12) 或非含氯氟烃或替代的抛射剂 ( 例如氟碳化合物、HFC-134A 或 HFC-227) 中。 还可使用于粉吸入器 ( 不论是呼吸启动的或通过空气或气体压力递送的 )，例如于 1993 年 1 月 7 日公布的 Schering 公司的国际专利申请 PCT/US92/05225 中所公开的干粉吸入 器，以及可用于单独地或与某些药学可接受的载体 ( 例如乳糖 ) 组合地递送作为大聚集体 (aggregates) 中细粉的雾化颗粒的 TurbuhalerTM( 获自 Astra Pharmaceutical Products， Inc.) 或 RotahalerTM( 获自 Allen & Hanburys) ；以及雾化器。
     通过使用泵式喷瓶，还可以按具体测量量以水混悬液的形式给药本发明的化合物。 本发明的水混悬液组合物可通过将所述化合物与水和其它药物可接受的赋形剂混合 来制备。 本发明的水混悬液组合物还可含有水、辅料和 / 或一种或多种赋形剂，例如 ： 助悬剂，例如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基 (hydroxpropyl)- 甲基纤维素 ；湿润 剂，例如甘油和丙二醇 ；用于调节 pH 的酸、碱或缓冲物质，例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷 酸、磷酸钠以及柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂的混合物 ；表面活性剂，例如聚山梨酯 80 ；和 抗微生物防腐剂，例如苯扎氯胺、苯乙基醇和山梨酸钾。
     对于本文描述的所有情况，通常全身剂量为每天 0.01mg/kg 体重至 1500mg/ kg 体重，其作为单次日剂量或分开的日剂量。 对于所述情况，优选的剂量为每天 0.5-1500mg。 对于期望的情况，更特别优选的剂量为每天 5-750mg。 代表性剂量还可 以 为 0.01-1500mg/kg/ 天、0.02-1000mg/kg/ 天、0.2-500mg/kg/ 天、0.02-200mg/kg/ 天、0.05-100mg/kg/ 天、0.05-50mg/kg/ 天、0.075-50mg/kg/ 天、0.1-50mg/kg/ 天、 0.5-50mg/kg/ 天、1-50mg/kg/ 天、2-50mg/kg/ 天、5-50mg/kg/ 天、10-50mg/kg/ 天、 25-50mg/kg/ 天、25-75mg/kg/ 天、25-100mg/kg/ 天、100-150mg/kg/ 天、 或 150mg/ kg/ 天或更多，其作为单次日剂量或分开的日剂量。 在一实施方案中，以约 1mg/kg 至约 5mg/kg、约 5mg/kg 至约 10mg/kg、约 10mg/kg 至约 25mg/kg、或约 25mg/kg 至约 50mg/ kg 的剂量提供所述化合物。 用于局部施用的一般剂量为活性化合物重量的 0.001-100％。
     所述化合物可以任何合适的剂型单位方便地给药，包括但不限于每单位剂型 含有约 7-3000mg、约 70-1400mg 或约 25-1000mg 的活性成分的剂型单位。 例如，约 50-1000mg 的口服剂量通常是方便的，包括 50mg、100mg、200mg、250mg、300mg、 400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg 或 1000mg 的一种或多种剂型。 优选较 低的剂量，例如约 10-100mg 或 1-50mg。 还包括 0.1-50mg、0.1-20mg 或 0.1-10mg 的剂 量。 此外，在通过非口服途径 ( 例如通过注射或吸入 ) 给药的情况下，可应用较低的剂 量。
     将所述化合物给药足够的时间周期，以改善与所治疗的病状相关的不期望的症 状和临床体征。
     以在没有严重毒性效应的情况下足以将治疗量的化合物向患者体内递送的量将 活性化合物包含于药学可接受的载体或稀释剂中。 可用于这些药物组合物的药学可接 受的载体通常为本领域所知。 它们包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷 脂、血清蛋白 ( 例如人血清白蛋白 )、缓冲物质 ( 例如磷酸盐 )、甘氨酸、山梨酸、山梨 酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、溶剂、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋 白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙 烯吡咯烷酮、纤维素系物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、油、聚乙 烯 - 聚氧丙烯 - 嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。 药学可接受的媒介物可包含多于一种 赋形剂的混合物，其中可选择组分和比率从而优化制剂的期望特征，包括但不限于储存 期、稳定性、载药量、递送部位、溶出速率、自乳化、释放速率和释放部位的控制以及 代谢。
     通过本领域已知的多种技术可以制备制剂。 制剂技术的实例可参见文献出版物 和教科书，例如 “Water-insoluble drug formulation”， Rong Liu 编辑，2000， Interpharm Press。如果静脉内给药，载体可以是生理盐水、抑菌水、 Cremophor ELTM(BASF， Parsippany，NJ) 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。 本发明组合物的无菌注射形式可以是水混悬 液或油混悬液。 根据本领域已知的技术，可使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制 这些混悬液。 所述无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无 菌注射溶液或混悬液，例如在 1，3- 丁二醇中的溶液。 可使用的可接受的媒介物和溶剂 是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。 此外，无菌不挥发油方便地用作溶剂或助悬介质。 为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。 脂肪酸 ( 例 如油酸 ) 及其甘油酯衍生物用于制备注射剂，也可使用天然药学可接受的油 ( 例如橄榄油 或蓖麻油 )，特别是其聚氧乙烯化的形式。这些油溶液或混悬液还可包含长链醇稀释剂或 分散剂 ( 例如羧甲基纤维素或类似分散剂 )，其通常用于配制药学可接受的剂型 ( 包括乳 剂和混悬剂 )。 还可以为了配制目的而使用其它常用表面活性剂 ( 例如 Tween、 Span 和 其它表面活性乳化剂 ) 或常用于制备药学可接受的固体、液体或其它剂型的生物利用度 增强剂。
     药物组合物中活性化合物的浓度取决于药物的吸收、失活和排泄速率以及本领 域技术人员所知的其它因素。 应注意，剂量值还会随待改善的病状的严重性而变化。 还 应理解，对于任何特定的个体，应根据个体需要以及管理或监督组合物给药的人的专业 判断而随时调整具体剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅为示例，并且并非意图限制 要求保护的组合物的范围或实践。 所述活性成分可一次给药，或可分为多个较小给药剂 量在不同时间间隔给药。
     口服是用于全身递送所述活性化合物的一种给药方式。 口服组合物通常会包括 惰性稀释剂或可食用载体。 它们可包封于明胶胶囊中或压制成片剂。 为了口服治疗性给 药的目的，可将所述活性化合物与赋形剂掺在一起，并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使 用。 可包含药学相容的粘合剂和 / 或佐剂物质作为组合物的部分。
     片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或具有相似性质的化合物 ： 粘合剂，例如微晶纤维素、黄耆树胶或明胶 ；赋形剂，例如淀粉或乳糖 ；崩解剂，例如 海藻酸、 Primogel 或玉米淀粉 ；润滑剂，例如硬脂酸镁或 Sterotes ；助流剂，例如胶体 二氧化硅 ；甜味剂，例如蔗糖或糖精 ；或者矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橘子香料 (organge flavoring)。
     当剂量单位形式是胶囊剂时，除了以上类型的物质，其还可含有液体载体，例 如脂肪油。 此外，剂量单位形式可含有改良剂量单位的物理形式的多种其它物质，例如 糖包衣、紫胶或其它肠溶剂 (enteric agent)。
     所述化合物或其盐可作为酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂 (wafer)、咀嚼胶 (chewing gum) 等等给药。 除所述活性化合物以外，糖浆还可含有作为甜味剂的蔗糖和某 些防腐剂、染料和着色剂及矫味剂。
     在优选实施方案中，所述活性化合物与会保护所述化合物免于从体内迅速清除 的载体一同制备，例如控释制剂，包括植入剂和微胶囊化递送体系。 可使用可生物降 解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯 (polyorthoester) 和聚乳酸。 本领域技术人员清楚制备此类制剂的方法。 所述物质还可商 购自 Alza Corporation 和 Nova Pharmaceuticals， Inc.。 还优选脂质体混悬液 ( 包括针对病毒抗原的单克隆抗体感染的细胞的脂质体 ) 作为药学可接受的载体。 这些可根据本领域 技术人员已知的方法进行制备，例如美国专利 4,522,811( 其整体援引加入本文 ) 中所记载 的方法。 例如，可如下制备脂质体制剂 ：将合适的脂质 ( 例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬 脂酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰磷脂酰胆碱 (arachadoyl phosphatidyl choline) 和胆固醇 ) 溶 解于无机溶剂，然后蒸发所述无机溶剂，在容器表面上留下干燥脂质薄膜。 然后将所述 化合物的水溶液引入容器中。 然后手动旋转所述容器从而使脂质物质离开所述容器的边 缘并分散脂质聚集体 (lipid aggregates)，由此形成脂质体混悬液。
     用于局部施用的合适的媒介物或载体可通过常规技术制备，例如施用于直肠、 阴道、鼻腔或口腔粘膜的洗剂、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、酊剂、喷雾剂、散 剂、糊剂、缓释透皮贴剂、栓剂。 除了以上列举的用于全身给药的其它物质外，还可使 用增稠剂、软化剂和稳定剂来制备局部用组合物。 增稠剂的实例包括凡士林、蜂蜡、 黄原胶或聚乙烯，湿润剂例如山梨醇，软化剂例如矿物油、羊毛脂及其衍生物，或角鲨 烯。
     组合治疗
     所述化合物还可与不损害期望作用的其它活性物质或与补充期望作用的物质混 合。 所述活性化合物可与用于治疗呼吸病症的其它药物联合 ( 即组合或交替 ) 给药。
     所述化合物可与通常用于治疗或预防哮喘的药物 ( 例如某些抗炎药物和支气管 扩张剂 ) 组合或交替给药。 皮质类固醇 ( 吸入的和口服的 )、肥大细胞稳定剂和白三烯调 节药物通常是对患有哮喘的人有用的抗炎药物。 这些药物减少气道的肿胀和粘液产生。 支气管扩张剂通常通过松弛紧环气道的肌肉带 (muscle band) 来缓解哮喘的症状。 该作 用迅速打开气道，使更多的空气进入和离开肺部。 支气管扩张剂还有助于从肺中清除粘 液。
     常用的化合物包括预防而非缓解症状的吸入皮质类固醇。 吸入皮质类固醇包 括 ：氟替卡松和沙美特罗吸入剂 (Advair，包含皮质类固醇 ( 氟替卡松 ) 加上长期作用的 支气管扩张药物 ( 在该情况下是 β-2 肾上腺素能受体激动剂沙美特罗 ) 的组合药物 )、 氟尼缩松气雾吸入剂 (aerobid，氟尼缩松 )、曲安奈德气雾剂 (azmacort，曲安西龙 )， flovent( 氟替卡松 )、甲泼尼龙、泼尼松、普米克 (pulmicort) 或施立稳 (serevent) 干粉 吸入器 ( 沙美特罗散剂 )、茶碱、 qvar 和 xopenex( 左旋沙丁胺醇 )。 吸入皮质类固醇 以三种形式进入 ：计量吸入器 (MDI)、干粉吸入器 (DPI) 和喷雾器溶液。 全身性类固 醇包括 ：甲泼尼龙 (Medrol、 Methylpred、 Solu-Medrol)、泼尼松 (Deltasone) 和泼尼松 龙 (Prelone、 Prediapred、 Orapred)。 肥大细胞稳定剂包括色甘酸钠 (Intal) 和尼多米钠 (Tilade)，其通过防止刺激性和炎性物质从肥大细胞中释放而起作用。 白三烯调节剂包括 安可来 (accolate) 和顺尔宁 (singular)，以及安可来 ( 扎鲁司特 )、顺尔宁 ( 孟鲁司特 ) 和 zyflo( 齐留通 )。
     所述化合物可以与非甾体抗炎剂 ( 例如布洛芬、吲哚美辛、非诺洛芬、甲芬那 酸、氟芬那酸、舒林酸 ) 组合给药。 所述化合物还可以与皮质类固醇一起给药。 用于组 合或交替治疗的本文所述的任意化合物均可作为任意前药给药，当向接受者给药时，所 述前药能够直接或间接提供所述母体化合物。 非限定性实例是药学可接受的盐 ( 或称为 “生理学可接受的盐” ) 和已在合适位置上烷基化或酰基化的化合物。 该修饰可以实现所述化合物的生物活性，在某些情况下增强所述活性使之超越母体化合物。
     化合物的制备方法
     可以使用模块化合成方法来制备非前药形式 ( 例如活性形式或带有保护基团的 活性形式 ) 的大环化合物。 用于制备非前药形式的大环化合物的方法和步骤详细记载于 2007 年 8 月 10 日提交的标题为 “Macrocyclic Compounds Useful as Inhibitors of Kinase and HSP90” 的国际申请 PCT/US2007/017754 和美国序列号 11/891,652 中，其内容整体援引 加入本文。 可以通过本领域技术人员已知的制备前药的方法由活性大环化合物合成各种 前药。 例如，可以通过使羟基与磷酸化试剂 ( 例如磷酰氯类似物 ) 反应来制备所述羟基 的磷酸酯。 可以通过用碱性离子树脂 ( 如 Dowex 550a) 处理最终化合物得到所有膦酸酯 的钠盐。
     以下路线 1、2 和 3 阐明了合成二磷酸酯前药、其中磷酸酯在羰基的对位的单磷 酸酯前药以及其中磷酸酯在羰基的邻位的单磷酸酯前药的一般合成策略。
     路线 1 ：用于合成二磷酸酯前药的一般合成策略
     路线 2 ：用于合成对 - 单磷酸酯前药的一般合成策略路线 3 ：用于合成邻 - 单磷酸酯前药的一般合成策略
     本文使用以下缩写 ： Ac 乙酰基 (CH3C ＝ O) ADP 二磷酸腺甘 AIBN 偶氮二 ( 异丁腈 ) All 烯丙基 ATP 三磷酸腺苷 BER 硼氢化物交换树脂 BBN 硼杂双环壬烷 (Borabicyclononane) Bn 苄基 Bz 苯甲酰基 CAN 硝酸高铈铵 CSA 樟脑磺酸 δ 化学位移 (NMR) dba 二亚苄基丙酮 DBU 1，8- 二氮杂双环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 DDQ 2，3- 二氯 -5，6- 二氰基 -1，4- 苯醌 DEAD 偶氮二羧酸二乙酯 DIAD 偶氮二羧酸二异丙酯 d.e. 非对映异构体过量 DET 酒石酸二乙酯 DHP 二氢吡喃 DIBAL 或 Dibal-H 二异丁基氢化铝 DIC N， N’ - 二异丙基碳二亚胺 DMAP 4- 二甲基氨基吡啶 DMDO 二甲基二环氧乙烷DMF 二甲基甲酰胺 DMPI 戴斯 - 马丁试剂 (Dess-Martin periodinane) DMSO 二甲基亚砜 DNA 脱氧核糖核酸 dppe 1，2- 双 ( 二苯基膦基 ) 乙烷 EC50 获得 50％体内最大效应所需的血浆浓度 EDC 盐酸 1- 乙基 -3-[3- 二甲基氨基丙基 ] 碳二亚胺 EDTA 乙二胺四乙酸 e.e. 对映异构体过量 EOM 乙氧甲基 (CH3CH2OCH2-) FDA 食品与药品管理局 Fmoc 9- 芴基甲氧羰基 GI50 50％抑制细胞生长所需浓度 Grubbs’ II Grubbs’ 第二代催化剂 ：( 钌 [1，3- 双 (2，4，6- 三甲基苯 基 )-2- 咪唑烷亚基 ) 二氯 ( 苯基亚甲基 )( 三环己基膦 )
     HFIP HMDS HMPA HOBT HPLC HRMS HSP90 Hunig 碱 IC50 imid.六氟异丙醇 六甲基二硅胺 (hexamethyldisilazide) 六甲基磷酸三酰胺 N- 羟基苯并三唑 高效液相色谱 (High performance chromatography) 高分辨质谱 热激蛋白质 90 二异丙基乙胺 体外 50％抑制所需的药物浓度 咪唑Ipc2BH 二异松蒎基硼烷 (bis-isopinocamphorylborane) J 偶合常数 KHMDS 六甲基二硅基氨基钾 (Potassium hexamethyldisilyamide) L.C. 液相色谱 LDA 异丙基氨基锂 (Lithium diisopropylamide) LiHMDS 六甲基二硅基氨基锂 (LiN(SiMe3)2) μM 微摩尔浓度 (μmol.l-1) MAP 促分裂原活化蛋白 mCPBA 间氯过氧苯甲酸MOM 甲氧甲基 (CH3OCH2-) mRNA 信使核糖核酸 M.S. 质谱 NaHMDS 六甲基二硅基氨基钠 NMR 核磁共振 NMM N- 甲基吗啉 NMO N- 甲基吗啉 -N- 氧化物 NOE(SY) 核奥弗豪泽效应 PCC 氯铬酸吡啶鎓盐 PDC 重铬酸吡啶鎓盐 PG 保护基 PMB 对甲氧基苄基 PNA 肽核酸 Piv 特戊酰基 PS聚合物载体 PS-TBD (1，5，7)- 三氮杂 - 二环并 [4.4.0] 十二 -5- 烯 -7- 甲基苯乙 烯 Pyr 或 Py 吡啶 rac 外消旋 RAL 二羟基苯甲酸内酯 RCM 闭环复分解 (Ring-closing metathesis) RedAl 双 ( 甲氧乙氧基 ) 氢化铝钠 Rf 保留因子 RNA 核糖核酸 RT 室温 SAE 夏普勒斯不对称环氧化 SAR 构效关系 SEM 2- 三甲基甲硅烷基乙氧甲氧基 TBAF 氟化四正丁基铵 TBAI 碘化四正丁基铵 TBDPS 叔丁基二苯基甲硅烷基 TBHP 叔丁基过氧化氢 TBS 叔丁基二甲基甲硅烷基 Teoc 2-( 三甲基甲硅烷基 ) 乙氧羰基 Tf 三氟甲基磺酸酯 (CF3SO3)(triflate) TFA 三氟乙酸 TFAA 三氟乙酸乙酸酐 THF 四氢呋喃 THP 四氢吡喃TLC 薄层色谱 TMS 三甲基甲硅烷基 Ts 甲苯磺酰基 (p-CH3C6H4SO2) p-TSOH 对甲苯磺酸实施例
     实施例 1 ：对 - 单氨基磷酸酯 (para-mono-phosphoamidate) 化合物 10a 和 10b 的合成 ：
     向相应的苯酚大环化合物 10a 或 10b(1.0 当量 ) 的 CH2Cl2 溶液中加入 DBU(0.9 当量 )、双 ( 二甲基氨基 ) 磷酰氯 (1.0 当量 ) 和 DMAP( 催化量 )。 将反应混合物在室温 下搅拌过夜。 然后用饱和 NH4Cl 水溶液和盐水洗涤有机相，然后用 MgSO4 干燥。 通过 柱色谱 (EtOAc 至 5％ MeOH 的 EtOAc 溶液 ) 纯化并分离期望的单磷酸酯 11a 和 11b，产 率为 50-60％。
     H NMR ( CDCl 3 ， 400 MHz ) δ 11 . 53( s ， 1 H ) ， 11 . 16( s ， 1 H ) ， 7 . 11( s ， 1H)，7.06(s，1H)，6.51(d， J ＝ 16.1Hz，1H)，5.97(dt， J ＝ 15.6，7.5Hz，1H)， 5.42-5.35(m，1H)，5.32-5.28(m，2H)，5.13(d， J ＝ 15.6Hz，1H)，5.09-5.05(m， 2 H ) ， 4 . 78( s ， 2 H ) ， 4 . 76( s ， 2 H ) ， 4 . 37-4 . 33( m ， 4 H ) ， 4 . 12( s ， 2 H ) ， 4 . 10( s ， 2H)，3.53-3.52(m，4H)，3.42-3.41(m，4H)，2.70(s，6H)，2.70(s，6H)，2.68(s， 6 H ) ， 2 . 67( s ， 6 H ) ， 2 . 57-2 . 54( m ， 4 H ) ， 2 . 40-2 . 38( m ， 2 H ) ， 2 . 30-2 . 29( m ， 2 H ) ， 2 . 21-2 . 17( m ， 4 H ) ， 1 . 60-1 . 57( m ， 2 H ) ， 1 . 56-1 . 52( m ， 8 H ) ， 1 . 44-1 . 40( m ， 2 H ) ； HRMS(MALDI-TOF)m/z 633.2263([M+Na+] ；C28H40ClN4O7PNa 理论值 633.2221)。
     1H NMR ( CDCl 3， 400 MHz ) δ 11 . 22( s ， 1 H ) ， 11 . 20( s ， 1 H ) ， 6 . 81( d ， J ＝ 2.1Hz，1H)，6.79(d，J ＝ 1.7Hz，1H)，6.66(d，J ＝ 16.1Hz，1H)，6.65(d，J ＝ 2.1Hz， 1H)，6.57(d， J ＝ 1.7Hz，1H)，6.16(dt， J ＝ 16.1，7.0Hz，1H)，6.07(dt， J ＝ 16.1， 6.4Hz，1H)，5.80(d， J ＝ 16.1Hz，1H)，5.40-5.34(m，2H)，5.32-5.29(m，2H)， 4.82(s，2H)，4.76(s，2H)，4.53-4.51(m，4H)，4.29(s，2H)，4.00(s，2H)，3.56(bs， 4H)，3.40(bs，4H)，2.73-2.72(m，2H)，2.70(s，12H)，2.67(s，12H)，2.49-2.46(m， 2 H ) ， 2 . 14( bs ， 4 H ) ， 2 . 11-2 . 05( m ， 4 H ) ， 1 . 65-1 . 64( m ， 4 H ) ， 1 . 58-1 . 56( m ， 8 H ) ； HRMS(MALDI-TOF)m/z599.2652([M+Na+] ；C28H41N4O7PNa 理论值 599.2611)。
     实施例 2 ：邻 - 单氨基磷酸酯 (ortho-mono-phosphoamidate) 化合物 13 的合成 ：
     1在氮气氛中，在 0℃下向双酚 10a(300mg，0.63mmol，1.0 当量 ) 的 CH2Cl2(5mL) 溶液中加入 i-Pr2Net(104μL，0.63mmol，1.0 当量 ) 和 EOMCl(58μL，0.63mmol，1.0 当 量 )。 将反应缓慢升温至室温，并持续搅拌过夜。 然后将反应混合物用饱和 NH4Cl 水溶 液 (15mL) 洗涤，并用 CH2Cl2(20mL×2) 萃取 ；然后合并有机层，并用盐水 (20mL) 洗 涤，并用无水 Na2SO4 干燥。 蒸发后，将残余物通过柱色谱 ( 洗脱剂 ：石油醚∶乙酸乙酯 ＝ 3 ∶ 2) 纯化，以得到 165mg 的期望的单保护的化合物 12(49％ )。 还可以通过在室温 下的 MeOH ∶ THF 中用 TFA 处理来将羰基邻位的 EOM 基团选择性脱保护而得到所述化 合物。
     在氮气氛中，在 0℃下向单 -EOM 保护的大环 12(165mg，0.31mmol，1.0 当量 )的 CH2Cl2(5mL) 溶液中加入 DBU(93μL，0.62mmol，2.0 当量 )、双 ( 二甲基氨基 ) 磷酰 氯 (67μL，0.46mmol，1.5 当量 ) 和 DMAP(3.8mg，0.03mmol，0.10 当量 )。 将反应缓 慢升温至室温，并持续搅拌过夜。 将反应混合物用饱和 NH4Cl 水溶液 (15mL) 洗涤，并 用 CH2Cl2(15mL×2) 萃取，然后用盐水 (20mL) 洗涤合并的有机层，并用无水 Na2SO4 干 燥。 蒸发后，将残余物通过柱色谱 ( 洗脱剂 ：石油醚∶乙酸乙酯＝ 1 ∶ 1，然后 EA，以 及 EA ∶ MeOH ＝ 10 ∶ 1) 纯化，以得到 114mg 的期望的单保护的化合物 13(55％ )。
     实施例 3 ：双氨基磷酸酯 (bis-phosphoamidate) 化合物 14 的合成
     向相应的双酚大环化合物 10a(1.0 当量 ) 的 CH2Cl2 溶液中加入 DBU(2.0 当量 )、 双 ( 二甲基氨基 ) 磷酰氯 (3.0 当量 ) 和 DMAP( 催化量 )。 将反应混合物在室温下搅拌 过夜。 将混合物用盐水萃取，并用 MgSO4 干燥。 通过柱色谱 (EtOAc 至 5％ MeOH 的 EtOAc 溶液 ) 纯化期望的二磷酸酯 14。
     H NMR(CDCl3，400MHz)δ6.47(d， J ＝ 16.4Hz，1H)，6.45(d， J ＝ 1.5Hz， 1H)，6.43(s，1H)，6.04(dt，J ＝ 16.4，6.4Hz，1H)，5.93(dt，J ＝ 15.8，7.0Hz，1H)， 5.37(d， J ＝ 15.8Hz，1H)，5.29-5.08(m，4H)，4.75(s，2H)，4.66(s，2H)，4.18(t， J ＝ 5.6Hz，2H)，4.14(t， J ＝ 4.9Hz，2H)，3.89(s，2H)，3.78(s，2H)，3.53-3.50(m， 4H)，3.44-3.40(m，4H)，2.73(s，6H)，2.72(s，6H)，2.71(s，6H)，2.69(s，6H)， 2 . 67( s ， 6 H ) ， 2 . 66( s ， 6 H ) ， 2 . 65( s ， 6 H ) ， 2 . 63( s ， 6 H ) ， 2 . 34-2 . 27( m ， 4 H ) ， 2.07-1.99(m，4H)，1.60-1.57(m，4H)，1.53-1.50(m，12H) ；HRMS(MALDI-TOF)m/ z 767.2814([M+Na+] ；C32H51ClN6O8P2Na 理论值 767.2830)。
     实施例 4 ：磷酸酯化合物 1a、1b 和 15 的合成 ：
     如下所述，通过水解相应的氨基磷酸酯化合物 11a、11b 和 14 来制备磷酸酯化合 物 1a、1b 和 15。 在 MeOH/H2O 50/50 溶液中用 5％ TFA 溶液处理相应的氨基磷酸酯大 环的溶液。 将混合物在室温下搅拌，然后通过 LCMS 处理直至耗尽全部原料。 在真空中
     110除去溶剂，并通过反相 (C18) 色谱纯化所述化合物。
     H NMR ( CD 3 OD ， 400 MHz ) δ 7 . 38( s ， 1 H ) ， 7 . 35( s ， 1 H ) ， 6 . 54( d ， J ＝ 16.6Hz，1H)，6.19(dt， J ＝ 16.1，6.4Hz，1H)，6.04(dt， J ＝ 15.6，7.5Hz，1H)， 5.46-5.42(m，2H)，5.31-5.17(m，3H)，4.85(s，2H)，4.83(s，2H)，4.39-4.29(m， 4 H ) ， 4 . 10( s ， 2 H ) ， 4 . 07( s ， 2 H ) ， 3 . 60-3 . 58( m ， 4 H ) ， 3 . 52-3 . 49( m ， 2 H ) ， 3 . 45-3 . 42( m ， 2 H ) ， 2 . 44-2 . 38( m ， 4 H ) ， 2 . 26-2 . 22( m ， 4 H ) ， 2 . 12-2 . 09( m ， 2 H ) ， 2.01-1.99(m，2H)，1.76-1.61(m，10H)，1.55-1.54(m，2H)， 六 个 OH 信 号 不 可 见 ； HRMS(MALDI-TOF)m/z 579.1217([M+Na+] ；C24H30ClN2O9PNa 理论值 579.1276)。
     1H NMR ( CD 3 OD ， 400 MHz ) δ 6 . 81( s ， 1 H ) ， 6 . 80( s ， 1 H ) ， 6 . 73( d ， J ＝ 16.0Hz，1H)，6.59(s，1H)，6.47(s，1H)，6.33-6.16(m，2H)，5.92(d， J ＝ 16.1Hz， 1 H ) ， 5 . 47-5 . 37( m ， 4 H ) ， 4 . 87( s ， 2 H ) ， 4 . 81( s ， 2 H ) ， 4 . 41( t ， J ＝ 4 . 8 Hz ， 4 H ) ， 3.92(s，2H)，3.64(s，2H)，3.62-3.58(m，4H)，3.55-3.52(m，4H)，2.50-2.48(m， 4H)，2.16-2.12(m，8H)，1.72-1.70(m，4H)，1.61-1.60(m，8H)， 六 个 OH 信 号 不 可 见 ；HRMS(MALDI-TOF)m/z 545.1654([M+Na+] ；C24H31N2O9PNa 理论值 545.1665)。
     1H NMR ( CD 3 OD ， 400 MHz ) δ 7 . 76( s ， 1 H ) ， 7 . 72( s ， 1 H ) ， 6 . 54( d ， J ＝ 16.0Hz，1H)，6.27(dt， J ＝ 16.1，6.4Hz，1H)，6.05(dt， J ＝ 15.5，7.5Hz，1H)， 5.51-5.19(m，5H)，4.84(s，2H)，4.82(s，2H)，4.31(t， J ＝ 4.8Hz，2H)，4.25(t， J
     111＝ 4.3Hz，2H)，3.94(s，2H)，3.81(s，2H)，3.59-3.57(m，4H)，3.52-3.50(m，4H)， 2 . 44-2 . 39( m ， 4 H ) ， 2 . 14-2 . 09( m ， 4 H ) ， 2 . 01-2 . 00( m ， 2 H ) ， 1 . 72-1 . 69( m ， 2 H ) ， 1.65-1.60(m，8H)，1.36-1.34(m，2H)，1.32-1.31(m，2H)， 八 个 OH 信 号 不 可 见 ； HRMS(MALDI-TOF)m/z 659.0947([M+Na+] ；C24H31ClN2O12P2Na 理论值 659.0939)。
     实施例 5 ：磷酸酯化合物 1a、1b、29、30、31 和 32 的合成 ：
     根据以下路线 4 和 5 中所述的合成方法制备其它磷酸酯化合物，包括化合物 29、 30、31 和 32。
     如以下路线 4 所示，在通过先前开发的基于闭环复分解 (RCM) 的合成路线 (Moulin， E. ；Barluenga， S. ；Totzke， F. ；Winssinger， N.， Chem.Eur.J.2006，12， (34)，8819-8834) 放大化合物 26 或 27 大环的合成的过程中，我们注意到少量含顺式烯烃 的大环的污染产生 RCM。因此我们研究了基于 Mitsunobu 大环内酯化 (macrolactonization) 的替代策略，其中上述烯烃的几何构型是固定的。 如路线 4 所示，将酯 16(Barluenga， S. ；Wang， C. ；Fontaine， J.G. ；Aouadi， K. ；Beebe， K. ；Tsutsumi， S. ；Neckers， L. ；Winssinger， N.， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2008，47， (23)，4432-5) 用 LDA 去质子 化，并与 Weinreb 酰胺 24 反应，以在肟形成之后得到大环 18。 将全部的甲硅烷基脱保 护，然后进行大环化得到化合物 26 和 27，在脱保护时使用磺酸树脂。 虽然所述化合物是 作为肟的 E/Z 混合物而得到的，但可以通过重结晶分离更具活性的 E 异构体至纯度大于 90％，或通过 HPLC 纯化得到单独的 E 异构体。 通过基于公认的化学的顺序，由含有所 需反式烯烃的烯烃 20 得到 Weinreb 酰胺 24。 因此分别由化合物 16a 和 b 以 17％和 25％ 的产率得到化合物 26 和 27。 这些合成可以容易地放大以制备超过 10g 的 pochoxime A 或 B。
     路线 4 ：化合物 26(pochoxime A) 和化合物 27(pochoxime B) 的合成
     试 剂 和 条 件 ：(a)LDA(2.0 当 量 )， THF， -78 ℃，5min ；24(0.9 当 量 )， -78，15min，17a(65 ％ )17b(54 ％ ) ；(b)25(2.5 当 量 )， 吡 啶，40 ℃，24h， 18a(50％ )18b(81％ ) ；(c)TBAF(2.5 当量 )，23℃，3h ；(d)Ph3P(1.5 当量 )，DIAD(1.5 当 量 )， 甲 苯，0-23 ℃，5h，19a(60 ％ )19b(61 ％ ) ；(e)PS-SO3H(5.0 当 量，3.0mmol/ g)， MeOH，23 ℃，2h，26(90 ％ )27(95 ％ ) ；(f)TBDPSCl(1.0 当 量 )， Imid(1.5 当 量 )， DMF，23 ℃，5h，85 ％ ；(g)Imid(1.5 当量 )， Ph3P(1.1 当量 )，碘 (1.1 当量 )， 0 ℃，6h ；KCN(5.0 当 量 )， DMSO，60 ℃，2h， ＞ 90 ％ ；(h)Dibal-H(1.05 当 量 )， CH2Cl2， -78 ℃，30min，85 ％ ；(i)LiCl(1.2 当 量 )，23(1.2 当 量 )， DBU(1.0 当 量 )， CH3CN，23℃，45min，80％ ；DBU ＝ 1，8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 ；Dibal-H ＝二异丁基氢化铝 ；Imid ＝咪唑 ；PS ＝聚苯乙烯 ；TBDPSCl ＝叔丁基二苯基氯硅烷。
     如以下路线 5 所示，由于对位苯酚具有更强的酸性，可以使用 1.0 当量的双 ( 二 甲基氨基 ) 磷酰氯和 0.9 当量的 DBU 将化合物 26、27 和 28 在该部位选择性衍生化。 在 二氯甲烷中用湿 TFA 水解磷酰胺键，然后使用阴离子交换树脂 (Amberlite) 中和，以优 异的产率得到 pochoxime 衍生物 1a、1b、29、30、31 和 32。 为了获得对位的磷酸酯， 首先用 EOM 基团选择性地保护邻位苯酚，然后实施相同方法以引入磷酸酯，由此得到 pochoxime A 衍生物 30。 以相同方式制备作为邻位取代的类似物的二磷酸酯衍生物 31， 但使用过量的双 ( 二甲基氨基 ) 磷酰氯和 2 当量的 DBU。 最后，可以通过相同方法， 使用二叔丁基氯甲基膦酸酯 (Ueda， Y. ；Matiskella， J.D. ；Golik， J. ；Connolly， T.P. ； Hudyma， T.W. ；Venkatesh， S. ；Dali， M. ；Kang， S.H. ；Barbour， N. ；Tejwani， R. ；Varia， S. ；Knipe， J. ；Zheng， M. ；Mathew， M. ；Mosure， K. ；Clark， J. ； Lamb， L. ；Medin， I ；Gao， Q. ；Huang， S. ；Chen， C.P. ；Branson， J.J.， Bioorg.Med. Chem.Lett.2003，13， (21)，3669-72) 而非双 ( 二甲基氨基 ) 磷酰氯，获得膦酰氧甲基 (phosphonooxymethyl) 衍生物 32。 在所有情况下，磷酰胺的酸性水解或叔丁基脱保护导 致肟的异构化 (E ∶ Z 大约为 1 ∶ 1)。
     路线 5 ：磷酸酯化合物 1a、1b、29、30、31 和 32 的合成。
     试 剂 和 条 件 ：(a)P(O)Cl(NMe2)2(1-3.0 当 量 )， DBU(0.9-2.0 当 量 )， DMAP(0.01 当量 )，CH2Cl2，23℃，12h，50-60％；(b)TFA(5％ )，CH3CN/H2O 50/50 ；
     23 ℃， 定 量 ；(c)AmberliteIRA68， H2O/CH3CN 1/1， 定 量 ；(d)EOMCl(1.0 当 量 )， iPr2EtN(1.0 当量 )， CH2Cl2，0-23 ℃，12h，49 ％ ；(e) 二叔丁基氯甲基膦酸酯 (1.0 当 量 )，Bu4NI(1.0 当量 )，CH2Cl2，23℃，12h，(68％ ) ；DBU ＝ 1，8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 ；DMAP ＝ 4- 二甲基氨基吡啶 ；EOMCl ＝乙氧甲基氯 ；TFA ＝三氟乙酸。
     生物测定
     体外测试磷酸酯前药的溶解度和稳定性的一般步骤 ：
     首先在几种不同的有机系和水系介质中测试结晶磷酸酯药物 1a 和 1b，所述介质 包括水、 PBS、 ETOH、 DMA、 CMC 和 PG。 发现与母体药物相比，所述磷酸酯前药在 水和 PBS 中高度可溶。
     在 4mL 洁净玻璃管中的小批结晶药物的最大观测溶解度为 ：
     1 ：在 50％ DMA 中至少为 82.5mg/mL
     2 ：在水中至少为 85mg/mL
     3 ：1a 在 0.5％ CMC/0.1％ Tween-20/0.45％ NaCl 中为 87.5mg/mL
     4 ：1a 在 PBS 中为 55mg/mL
     5 ：1a 在 10％ ETOH/20％ PG/70％水中为 155mg/mL
     6 ：1a 在 10％ ETOH/20％ PG/70％水中为 50mg/mL
     母体化合物和所述前药对一组癌细胞系的增殖的的抑制
     在多种肿瘤细胞系中进行细胞增殖测定，所述肿瘤细胞系包括乳腺癌细胞系 (BT474 和 MDA-MB468)、白血病细胞系 (K562CML 和 MV4 ；11AML)、结肠癌细胞系 (HCT116)、前列腺癌细胞系 (PC-3)、对 Tarceva 和 Iressa 有耐药性的非小细胞肺癌细胞 系 (NSCLC、HCC829 和 H1975)、胃癌细胞系 (N87) 以及胶质母细胞瘤细胞系 (A172)。 将适量的细胞 ( 在 4 天中达到约 70％融合 ) 铺于 96 孔板中，并在媒介物，或在 4 天中增 加浓度的 1a 母体、其它活性类似物 (1b 母体和 29 母体 ) 或 17AAG(0.001-5 □ M) 的存在 下进行培养。 根据生厂商 (Perkin Elmer， Boston， MA) 的规程使用 ATPlite 试剂盒，通 过存在于活细胞中的 ATP 含量来测量第四天的细胞生存。 使用 XLfit 软件，通过拟合数 据计算 IC50。 在大量癌细胞系中，化合物 1a、1b 和 29 的母体药物表现出非常相似的和强 效的抗增殖活性。 有趣的是， pochoxime 保持对 MDA-MB468( 对 17-AAG 的敏感性明 显更低 ) 的抗增殖活性。
     表 1 母体化合物的生长抑制和 HSP90α 亲和性
     pochoxime 衍生物的生长抑制 (IC50) 和 HSP90 亲和性 (nM)
     细胞系 BT474( 乳腺癌 ) MDA231( 乳腺癌 ) MDA-MB468( 乳腺癌 )1a 母体 7 7 91b 母体 2 2 229 母体 6 6 617AAG 5 NM 780N87( 胃癌 )4121116CN 102015673 A CN 102015683 A说6 3 9 31 25 42 21明4 2书7 3 NM NM NM NM 18 48 11 NM 56 35 NM 3281/83 页K562( 白血病 ) MV4 ；11( 白血病 ) HCT116( 结肠癌 ) HCC827( 肺癌 ) H1975( 肺癌 ) A172( 胶质母细胞瘤 ) HSP90 □亲和力
     11 NM NM NM 15为了确定磷酸酯前药能否在细胞内转化为其活性母体，我们评价了 1b( 即 1b 母 体的磷酸酯前药 ) 在阻碍 BT474、MDA-MB468 和 N87 细胞系的增殖方面的效能。 如表 2 所示，1b 表现出强效的细胞活性，但它通常弱于 1b 母体 ( 表 1)。 因为前药 1b 在体外 不与 Hsp90 结合，所以观察到的细胞活性一定是由于前药通过存在于这些细胞中的磷酸 酶转化为母体化合物所产生的。
     表 2 1b 的生长抑制和 HSP90α 亲和性 1b 的生长抑制 (IC50) 和 HSP90 亲和性 (nM)细胞系 BT474( 乳腺癌 ) MDA-MB468( 乳腺癌 ) N87( 胃癌 ) HSP90 □亲和力 1b 14 37 19 ＞ 10000使用组织匀浆、血浆和模拟胃液的前药的体外转化的步骤和结果
     因为母体药物的苯酚环的两个 OH 基团是生物活性所必需的，因此除非磷酸酯 前药在体内快速发生水解，否则所述前药不会具有活性。 通过使用小鼠小肠匀浆和肝匀 浆、小鼠血浆和人工胃液在体外培养磷酸酯前药来评价前药在体内的水解。 从裸鼠中收 集新鲜血浆。 通过将 3 倍体积的盐水加入新鲜收集的小鼠组织中，并使用玻璃均质器均 质来制备肝匀浆和肠匀浆。 通过将 80mL 的 1M 盐酸加入 800mL 水中，然后补充 2.0g 的氯 化钠和 3.2g 的胃蛋白酶粉末来制备胃液。 用水将人工胃液的最终体积调节至 1000mL(pH ＝ 1.1)。将适当体积的前药储备溶液加入上述媒介物，以获得化合物 1a 的最终浓度 5μg/ mL 和化合物 1b 的最终浓度 80μg/mL。 在第 0、2、5、15、30 和 60 分钟收集 100μL 的 样品。 立即加入含有内标物的 5 倍体积的甲醇。 对于从胃液中培养的样品，在注入 LC/ MS/MS 之前，加入 1 倍体积的 0.01M 的氢氧化钠。 经 LC/MS/MS 分析所有样品，以定
     量 1a、1b 以及相应母体药物的浓度。 通过使用各媒介物得到的标准曲线定量 1a 和 1b 的 母体药物的浓度。 图 1A 和 1B 显示了 1a 和 1b 的崩解及其相应母体的形成。 结果表明 ： 在肝匀浆和肠匀浆中，1a 和 1b 减少，而其各自的母体药物快速形成。 所述母体药物累积 至约 20％，其保持稳定长达 60 分钟。 1a 和 1b 二者均在血浆内稳定 ( 在第 60 分钟时约 90％保持不变 )，而在人工胃液中的稳定性稍差 ( 在第 60 分钟时约 70％保持不变 )。
     然后我们使用组织匀浆和模拟胃液 ( 胃蛋白酶溶液， pH 1.1) 评价其它前药的体 外转化。 如表 3 所示，在胃液和血浆中发生少量的转化，而在肝匀浆和肠匀浆中均获得 明显的转化。 有趣的是，29 和 31 的转化比 1a、1b、30 和 32 更有效率，二磷酸酯 31 的 最好结果为在肠匀浆中 60 分钟内达到 43.51.6％的转化。 这些数据表明 pochoxime 前药 (pro-pochoxime)31 会是最合适的前药候选。
     表 3 磷酸酯前药在组织匀浆、血浆和模拟胃液中向母体药物的转化 (％ )
     1a 肝 肠 血浆 胃液
     1b 23.2 26.6 2.2 0.429 29.4 41.6 1.4 030 10.5 11.6 0 031 30.5 43.5 0 032 17.9 18.7 4.0 0.318.2 18.9 3.4 0.4体外评价在小鼠全血中的血浆和细胞间的分配的步骤
     通过心脏穿刺术从小鼠中取出全血，并置于 EDTA 抗凝血试管中。 以 5μg/mL 的最终浓度 ( 至少 2mL) 将检品加入全血中，并在 37℃下培养。 在第 0( 培养后即刻 )、 5 分钟、15 分钟和 30 分钟取 200μL 全血，然后进行离心以分离血浆和细胞成分 (cellular element)。 将血浆转入洁净试管中。 通过加入 3 倍体积 (150μL) 用冰预冷的甲醇来处 理 50μL 的血浆和细胞成分。 离心后，对在血浆和细胞成分中的检品的上清液均进行 LC-MS/MS 分析。 表 4 中列举了不同时间点的血浆和细胞成分中的浓度。
     表 4. 在血浆和细胞成分中的检品浓度
     1a 和 1b 在血浆中的浓度大于在全血中的指定浓度 (5μg/mL)，这表明所述检品的分配主要在血浆中。
     评价前药在小鼠中的药代动力学和生物利用度的步骤 ：
     体外研究使得我们能够评价前药向母体药物的水解。 然而，为了测试该前药途 径是否确实改善了口服生物利用度，我们可以在体内测试前药。 本研究的目的在于 ：(i) 在口服给药后确定小鼠中的水溶性前药的血浆药代动力学 (PK) 特征，以及 (ii) 确定所述 前药的生物利用度。 将磷酸酯前药溶于合适的媒介物中以得到最终浓度为 25mg/ml 的用 于口服给药的澄清溶液 (pH 约为 7)。向成年 Balb/c 小鼠 (5-6 周龄，体重 ：17g 至 20g) 给 药 4mg/kg、20mg/kg、100mg/kg、500mg/kg 的前药，并且需要每组三只小鼠。 为了建 立基线水平，在给药前 24 小时，以及在口服给药前药后的约第 0.5、1、2、4、8、12 和 24 小时从所有小鼠中收集血样。 将血样在 10,000rpm 下离心 3 至 5 分钟，然后立即分离。 立即用 3 倍体积的冷甲醇提取血浆中的化合物。 测定母体和前药在血浆中的浓度。 将定 量限 (LOQ ＝ 2.5ng/mL) 以下的血浆浓度指定为零。 通过模型无关 (model-independent) 方法计算药代动力学参数。 通过梯形法则计算药物浓度曲线下面积 (AUC) 和一阶矩药物 浓度曲线下面积 (AUMC)，并外推至无穷大。 如果可能的话，通过线性回归从血浆浓度 对数 (log plasma concentration)- 时间点的末期斜率计算在 b 相的消除半衰期 (t1/2b)。 作 为 F(％ ) ＝ ( 剂量 iv×AUC 口服 (0 →∞ ))/( 剂量口服 ×AUCiv(0 →∞ ))*100％计算口服生 物利用度。 小鼠中的初步研究表明 ：通过静脉内或口服给药前药 31，达到 31 母体在肝 中的高浓度 (Cmax ：通过静脉内给药 (4mg/kg) 为 3838ng/g，以及通过口服给药 (30mg/ kg) 为 12469ng/g)，但 31 母体在血浆中的浓度较低 (Cmax ：通过静脉内给药 (4mg/kg) 为 197.2ng/mL，以及通过口服给药 (30mg/kg) 为 329.2ng/mL)。 此外，计算得到口服生 物利用度为约 12.3％。
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