移动式色谱柱隔板 技术领域 本发明属于色谱领域， 更具体地属于采用色谱柱通过色谱法纯化多肽的领域。本 文报告了一种色谱柱隔板 (separator)， 其可以将色谱柱分成上色谱柱室和下色谱柱室， 且 所述隔板在色谱柱内具有可变的位置， 即， 所述隔板可以随着周围色谱材料的压力依赖性 压缩而滑动。
发明背景
多肽在当今医疗产业组合中具有重要作用。对于人类应用， 每种药用物质必须满 足不同的标准。 为了确保生物药剂对人类的安全性， 将会导致严重损害的核酸、 病毒和宿主 细胞蛋白特别需要被去除。为了满足质量管理规范， 一个或多个纯化步骤需要遵照制造工 艺。其中， 纯度、 产量和收率在确定适当的纯化工艺中具有重要作用。
在通常的色谱法中， 采用色谱柱， 所述色谱柱基本上包括具有上配件 (fitting) 和下配件的柱壳体， 所述柱壳体依次地包括柱顶部处的入口、 柱底部处的出口、 上色谱柱筛 板 (frit)、 下色谱柱筛板、 上分配板和色谱材料。
常 规 的 色 谱 法 及 其 用 途 对 于 本 领 域 技 术 人 员 是 已 知 的。 参 见， 例 如， Chromatography( 色谱法 )， 第 5 版， Part A ： Fundamentals and Techniques( 部分 A ： 基 本原理和技术 )， Heftmann， E.( 编辑 )， Elsevier Science Publishing Company， 纽约， (1992) ； Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences( 生 物科学中的色谱法和电迁移法 )， Deyl， Z.( 编辑 )， Elsevier Science BV， 阿姆斯特丹， 荷 兰， (1998) ； Chromatography Today( 当今色谱法 )， Poole， C.F.， 和 Poole， S.K.， Elsevier Science Publishing Company， 纽约， (1991) ； Scopes， Protein Purification ： Principles and Practice( 蛋白质纯化 ： 原理和实践 )(1982) ； Sambrook， J.， 等 ( 编辑 )， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室指南 )， 第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 冷泉港， N.Y.， 1989 ； 或 Current Protocols in Molecular Biology( 现 代分子生物学实验技术 )， Ausubel， F.M.， 等 ( 编辑 )， John Wiley & Sons， Inc.， 纽约。
为了纯化已经通过例如细胞培养法制备的免疫球蛋白， 通常采用不同色谱步骤的 组合。通常蛋白 A 亲和色谱法后紧接着进行一个或两个额外的分离步骤。最后的纯化步骤 是所谓的 “精细纯化步骤 (polishing step)” 以去除痕量的杂质和污染物， 如聚集的免疫球 蛋白、 残留的 HCP( 宿主细胞蛋白 )、 DNA( 宿主细胞核酸 )、 病毒或内毒素。对于该精细纯化 步骤， 通常使用流通模式的阴离子交换材料。
在 WO 2006/048514 中， 报道了一种容器， 其包括开口的、 形状互补的上端部和下 端部和膜滤器， 其中色谱混合物置于所述容器中， 所述膜滤器固定于所述容器的下端部。 在 US 6,458,273 中报道了一种高通量液相色谱柱组件， 其包括与具有分离室的分离柱流体连 通的具有加样室的加样柱， 所述加样柱具有第一内径和第一长度， 所述分离柱的直径小于 所述加样柱的内径且长度大于所述加样柱的长度。
高压液相色谱柱报道于 US 4,719,011 中， 其可以被模块化地修改长度和 / 或内径 并且在模块化系统中可以包含其他部件， 例如， 柱区段 (column section)、 用于连接不同内
径的柱区段的转接器和锥形转接器， 和用于注入或排出流体的端板构件。EP 1 916 522 中 报道了一种柱装置， 其包括 ： 具有多个粒子的固定相， 其适于与流动相相互作用以便分离溶 解在流动相中的样品流体中的不同化合物 ； 用于至少部分地容纳固定相的壳体 ； 和分离固 定相的各区段并且与所述壳体强制连接的隔板。
在 WO 00/010675 中报道了分段式色谱柱， 其包括多个被多个多孔构件分隔并限 定边界的介质床。在 US 3,398,512 中报道了一种色谱设备。在 US 3,453,811 中报道了其 中具有分配元件的色谱柱。在 EP-A 1 892 526 中， 报道了一种色谱柱和使用所述色谱柱的 筒式色谱柱。在 US 3,657,864 中报道了一种用于解析挥发性混合物的分离系统。
发明概述
本文报道的此隔板允许更换上色谱柱室中的色谱材料而无需更换下色谱柱室中 的色谱柱材料， 其还允许， 例如， 在一个色谱柱内组合具有不同的色谱功能基团的两种不同 的色谱材料， 并且在隔板的存在下， 可以提供更多的均匀填充的色谱柱。此外， 本文报道的 隔板减少了色谱柱施加的背压， 即， 其减少了色谱柱内部的压力。 在添加至柱填充物的每个 隔板处， 压降减小。
作为一个方面， 本文报道了用于液相色谱柱中的环形导向环， 其特征在于所述导 向环具有包括两个轴向对称的横截面区域 (5 和 6) 的垂直横截面， 其中每个所述轴向对称 的横截面区域具有 ： a) 锥形结构， 其中所述锥形是从所述导向环的外部向内部逐渐变细， 和
b) 用于安装筛板的凹口 (8)， 所述凹口具有指向所述导向环内部的开口。
在一个实施方案中， 所述凹口是矩形凹口。 在进一步的实施方案中， 每个所述横截 面区域具有三角形形状且最长边 (7) 的长度为所述凹口 (8) 的直径的至少 1.5 倍。在进一 步的实施方案中， 所述环由橡胶、 塑料、 聚硅氧烷、 聚四氟乙烯、 聚乙烯或聚丙烯制成。
如本文报道的另一方面是如本文报道的导向环用于将筛板安装至圆筒形液相色 谱柱中的用途。
另一个方面是一种色谱柱隔板， 其包括如本文报道的导向环和安装至所述导向环 中的筛板。
在一个实施方案中， 所述筛板是 ：
a) 单个筛板， 或
b) 具有上筛板和下筛板的双筛板。
在另一个实施方案中， a) 所述筛板具有 1μm 至 20μm 的孔径， 或 b) 每个所述筛板 彼此独立地具有 1μm 至 20μm 的孔径， 由此所述上筛板的孔径小于所述下筛板的孔径。在 另一个实施方案中， 所述筛板由金属、 聚硅氧烷、 聚丙烯、 聚乙烯、 聚四氟乙烯、 烧结物料或 它们的组合制成。在进一步的实施方案中， 所述隔板包括距离固定件 (distance holder)， 所有距离固定件均与所述隔板的一侧连接。
在一个实施方案中， 所述色谱柱隔板的特征在于 ：
a) 所述隔板将色谱柱分隔成上色谱柱室和下色谱柱室， 并且
b) 所述隔板通过沿色谱柱的内壁滑动在色谱柱内具有可变的位置。
在一个实施方案中， 所述色谱柱隔板包括一个筛板， 在另一个实施方案中， 所述隔 板包括上筛板和下筛板。在进一步的实施方案中， 所述色谱柱隔板或所述上筛板或所述下
筛板的孔径为 1μm 至 20μm， 由此上筛板的孔径小于所述下筛板的孔径。在另一个实施方 案中， 所述筛板由金属、 聚硅氧烷、 聚丙烯、 聚乙烯、 聚四氟乙烯、 烧结物料或它们的组合制 成。在一个实施方案中， 所述色谱柱隔板具有连接至一侧的 3 个或更多个距离固定件。在 一个具体实施方案中， 所述距离固定件连接到具有较大孔径的色谱柱隔板的一侧。
如本文报道的另一个方面是如本文报道的色谱柱隔板用于将色谱柱分成多个室 的用途。 如本文报道的进一步方面是如本文报道的色谱柱隔板用于将色谱柱分隔成上色谱 柱室和下色谱柱室的用途。 还有另一个方面是如本文报道的色谱柱隔板用于将色谱柱中的 色谱材料分隔成两个不同的部分的用途。 如本文报道的再一个方面是如本文报道的色谱柱 隔板用于分隔一个色谱柱中两种不同的色谱材料的用途。
如本文报道的进一步方面是根据本发明的色谱柱隔板用于将包含色谱材料的色 谱柱分隔成两个分开的室， 由此所述色谱柱隔板被包埋在色谱柱中的色谱材料中的用途， 如本文报道的色谱柱隔板用于将包含色谱材料的色谱柱分隔成两个分开的室， 由此所述色 谱柱隔板分隔一个色谱柱中两种不同的色谱材料的用途。
如本文报道的还有的另一个方面是包括至少一个， 即， 一个或多个如本文报道的 色谱柱隔板的色谱柱。在一个实施方案中， 所述色谱柱包括一个或两个色谱柱隔板。在此 方面的进一步实施方案中， 任一色谱柱隔板与第一种色谱材料接触并与第二种色谱材料接 触， 由此所述第一种和第二种色谱材料是 ：
a) 具有相同的色谱功能基团且具有相同或不同粒度的色谱材料， 或
b) 具有不同的色谱功能基团的色谱材料。
如本文报道的另一个方面是色谱柱用于纯化多肽的用途， 所述色谱柱包括至少一 个如本文报道的色谱柱隔板。
如本文报道的另一个方面是色谱柱施加装置， 由此所述装置在其底部处具有与如 本文报道的色谱柱隔板的上表面形状相反的形状和小于所述导向环的外径的直径。
发明详述
本文报道了一种用于液相色谱柱中的环形导向环， 其特征在于所述导向环具有包 括两个轴向对称的横截面区域的垂直横截面， 其中每个所述轴向对称的横截面区域具有 ：
a) 锥形结构， 其中所述锥形是从所述导向环的外部向内部逐渐变细， 和
b) 用于安装筛板的凹口， 所述凹口具有指向所述导向环内部的开口。
报道了一种色谱柱隔板， 其用于将色谱柱中的色谱材料分隔成两个分开的部分， 由此 ：
a) 所述隔板将色谱柱分隔成上色谱柱室和下色谱柱室， 和
b) 所述隔板在色谱柱内具有可变的位置， 和
c) 所述隔板包埋在所述色谱材料中。
在柱色谱法中， 通过色谱分离法经由与色谱材料的相互作用将至少一种或多种目 的多肽， 即待纯化的一种或多种多肽， 与不感兴趣的其他多肽和物质分开。
术语 “多肽” 表示天然或合成产生的、 由通过肽键连接的氨基酸残基组成的聚合 物。少于约 20 个氨基酸残基的多肽可以称为 “肽” 。包含一条或多条氨基酸链或一条具有 100 个以上的氨基酸残基的氨基酸链的多肽可以称为 “蛋白” 。另外多肽可以包含非氨基酸 成分， 诸如糖基。 糖基和其他非氨基酸成分可以由产生所述多肽的细胞加入， 并且其将随着细胞的类型而变化。 多肽以其氨基酸主链结构来限定 ； 通常不指定诸如糖基的取代基， 但可 以存在取代基。在一个实施方案中， 所述多肽是免疫球蛋白， 或免疫球蛋白片段， 或包含免 疫球蛋白或免疫球蛋白片段的融合蛋白。
术语 “免疫球蛋白” 表示通常包含两个轻链多肽 ( 轻链， LC) 和两个重链多肽 ( 重 链， HC) 的多肽。每条重链和轻链包含可变区 ( 通常是链的氨基末端部分 )， 所述可变区 包含与抗原相互作用的特异性结合区 (CDR， 互补决定区 )。每个重链和轻链还包含恒定 区 ( 通常是链的羧基末端部分 )， 所述恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞、 一些吞噬细胞和经典补体系统的第一成 分 (C1q)。通常轻链包含轻链可变区和轻链恒定区， 而重链包含重链可变区、 铰链区和和重 链恒定区， 即 C H1 结构域、 CH2 结构域、 CH3 结构域和任选的 CH4 结构域。免疫球蛋白可以多 种形式存在， 包括， 例如， 片段 Fv、 Fab 和 F(ab)2 以及单链 ( 例如， Huston， J.S. 等， Proc. Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院院刊 )85(1988)5879-5883 ； Bird， R.E.， 等， Science( 科 学 )242(1988)423-426 ； 通常， Hood， L.E.， 等， Immunology( 免疫学 )， Benjamin N.Y.， 第二 版 (1984) 以及 Hunkapiller， T. 和 Hood， L.， Nature( 自然 )323(1986)15-16)。取决于重 链恒定结构域的氨基酸序列， 免疫球蛋白被分为不同的类型 ： IgA、 IgD、 Ige、 IgG 和 IgM。这 些类型中的一些被进一步分为亚类 ( 同型 )， 例如， IgG 分为 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgG4， 或 IgA 分为 IgA1 和 IgA2。根据免疫球蛋白所属的免疫球蛋白类型， 免疫球蛋白的重链恒定区 分别称为 a(IgA)、 d(IgD)、 e(IgE)、 g(IgG) 和 m(IgM)。另外可能存在两种类型的免疫球蛋 白轻链， λ 型轻链和 κ 型轻链。
术语 “色谱材料” 当在本申请内使用时一方面表示可以在目的多肽的色谱纯化中 在无需进一步修饰的条件下使用的固体材料， 诸如羟磷灰石， 以及还表示包含已经例如通 过共价键引入 / 连接色谱功能基团修饰的散装芯材的材料， 诸如 SP-sepharose 散装芯 材被理解为不参与色谱分离， 即待分离多肽和色谱材料的色谱功能基团之间的相互作用。 其仅仅提供色谱功能基团连接的三维构架， 并且确保包含待纯化多肽的溶液可以接触色谱 功能基团。在一个实施方案中， 所述散装芯材是固相。因此， 在另一个实施方案中， “色谱材 料” 是连接色谱功能基团的固相。在另一个实施方案中， “色谱功能基团” 是可电离疏水基 团， 或疏水基团， 或其中不同的色谱功能基团组合在一起以便结合仅特定类型的多肽的复 合基团， 或共价结合的带正电荷或负电荷的基团。
通常待纯化多肽作为经缓冲的水性溶液施加至色谱材料。
术语 “施加于 (applying to)” 及其语法等价物当在本申请中使用时表示色谱纯化 多肽的部分步骤， 其中使包含待纯化的目的多肽的溶液与色谱材料接触。这表示包含待纯 化多肽的溶液在色谱柱的上部入口处被加入至包含色谱材料的色谱柱。 包含待纯化的目的 多肽的溶液通过色谱材料， 由此允许色谱材料和溶液中的物质之间的相互作用。取决于条 件， 诸如例如 pH、 电导率、 盐浓度、 温度和 / 或流速， 包含在所述溶液中的物质与色谱材料特 异性地相互作用， 由此取决于与色谱材料的相互作用， 实现它们通过色谱柱的移动。 目的多 肽可以从纯化步骤后获得的溶液中， 即， 从洗脱液中， 通过本领域技术人员熟悉的方法， 诸 如沉淀、 盐析、 超滤、 渗滤、 冻干、 亲和色谱、 或溶剂体积减小从而获得基本均质形式的目的 物质而回收。
术语 “缓冲的” 当在本申请中使用时表示其中由于酸性或碱性物质的添加或释放引起的 pH 改变通过缓冲物质来调平的溶液。可以使用导致所述作用的任何缓冲物质。在 一个实施方案中， 使用药用缓冲物质， 诸如， 例如， 磷酸或其盐、 乙酸或其盐、 柠檬酸或其盐、 吗啉或其盐、 2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸或其盐、 组氨酸或其盐、 甘氨酸或其盐、 或三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 (TRIS) 或其盐。在一个实施方案中， 所述缓冲物质是磷酸或其盐， 或乙酸或其盐， 或柠檬酸或其盐， 或组氨酸或其盐。 任选地缓冲的溶液可以包含额外的盐， 诸如， 例如， 氯化 钠、 硫酸钠、 氯化钾、 硫酸钾、 柠檬酸钠、 或柠檬酸钾。
在液相色谱柱色谱纯化方法中， 色谱材料位于柱壳体内并且表示为 “固定相” 。为 了使固定相能够与施加于其上的溶液中的物质 / 多肽相互作用， 固定相被 “流动相” 包绕或 包埋在 “流动相” 中。术语 “流动相” 表示液体， 例如， 缓冲的， 水溶液， 水和有机溶剂的混合 物， 或有机溶剂， 其用于其中采用固定相的色谱纯化法中。
已充分地确定了不同的色谱法， 并且这些色谱法广泛用于多肽回收和纯化， 诸如 采用微生物蛋白 ( 例如， 蛋白 A 或蛋白 G 亲和色谱 ) 的亲和色谱、 离子交换色谱 ( 例如， 阳 离子交换 ( 羧甲基树脂 )， 阴离子交换 ( 氨乙基树脂 ) 和混合模式交换 )， 嗜硫吸附 ( 例如， 采用 β- 巯基乙醇和其他 SH 配体 )， 疏水相互作用或芳烃吸附色谱 ( 例如， 采用苯基 - 琼脂 糖， 氮杂 - 嗜沙蟾毒树脂 (aza-arenophilic resins)， 或间氨基苯硼酸 )， 金属螯合物亲和 色谱法 ( 例如， 采用 Ni(II)- 和 Cu(II)- 亲和材料 )， 尺寸排阻色谱， 和电泳法 ( 诸如凝胶电 泳， 毛细管电泳 )( 参见， 例如， Vijayalakshmi， M.A.， Appl.Biochem.Biotech.( 应用生物化 学和生物技术 )75(1998)93-102)。 术语 “疏水电荷诱导色谱” ， 简称 “HCIC” ， 表示采用 “疏水电荷诱导色谱材料” 的色 谱法。 “疏水电荷诱导色谱材料” 是包含色谱功能基团的色谱材料， 所述色谱功能基团可以 在一个 pH 范围内与待纯化物质 / 多肽形成疏水键并且在另一个 pH 范围内带有正电荷或负 电荷， 即 HCIC 使用可电离的疏水基团作为色谱功能基团。通常， 多肽在中性 pH 条件下结合 于疏水电荷诱导材料， 并且之后通过改变 pH 值生成电荷排斥而被回收。示例性的 “疏水电 荷诱导色谱材料” 是 BioSepra MEP 或 HEA Hypercel(Pall Corp.， USA)。
术语 “疏水相互作用色谱” ， 简称 “HIC” ， 表示其中采用 “疏水相互作用色谱材料” 的色谱法。 “疏水相互作用色谱材料” 是结合了作为色谱功能基团的疏水基团， 诸如丁基、 辛基或苯基的色谱材料。被施加的多肽根据其表面暴露的氨基酸侧链的疏水性而被分离， 所述表面暴露的氨基酸侧链可以与疏水相互作用色谱材料的疏水基团相互作用。 多肽和色 谱材料之间的相互作用可以受温度、 溶剂和溶剂的离子强度影响。例如温度升高支持多肽 和疏水相互作用色谱材料之间的相互作用， 因为氨基酸侧链的运动增加并且在较低温度下 包埋在多肽内部的疏水氨基酸侧链变得可以接近。此外， kosmotropic 盐促进疏水相互作 用而离液盐 (chaotropic salt) 减弱疏水相互作用。 “疏水相互作用色谱材料” 例如是， 苯 基琼脂糖 (Phenylsepharose)CL-4B、 6 FF、 HP、 苯基 Superose(Phenyl Superose)、 辛基琼 脂糖 (Octyl-Sepharose)CL-4B、 4FF 和丁基琼脂糖 (Butylsepharose)4FF( 所有均可获自 Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH， 德国 )， 它们经由缩水甘油醚与散装材料连接 而获得。
术语 “亲和色谱” 当在本申请中使用时表示采用 “亲和色谱材料” 的色谱法。在亲 和色谱中， 多肽根据与色谱材料的色谱功能基团形成静电相互作用、 形成疏水键和 / 或形 成氢键， 基于其生物学活性或化学结构而被分离。为了从亲和色谱材料回收特异性结合的
多肽， 加入竞争性配体或改变色谱条件， 诸如缓冲液的 pH 值、 极性或离子强度。 “亲和色谱 材料” 是包含复合色谱功能基团的色谱材料， 在所述复合色谱功能基团中不同的单一色谱 功能基团组合在一起以便仅结合特定类型的多肽。 此色谱材料特异性地结合特定类型的多 肽， 这取决于其色谱功能基团的特异性。示例性的 “亲和色谱材料” 是 “金属螯合色谱材料” 诸如包含 Ni(II)-NTA 或 Cu(II)-NTA 的材料， 用于结合包含六聚组氨酸标签的融合多肽或 具有大量表面暴露的组氨酸、 半胱氨酸和 / 或色氨酸残基的多肽， 或 “抗体结合色谱材料” 诸如蛋白 A， 或 “酶结合色谱材料” 诸如包含酶底物类似物、 酶辅因子或酶抑制剂作为色谱功 能基团的色谱材料， 或 “凝集素结合色谱材料” 诸如包含多糖、 细胞表面受体、 糖蛋白或完整 细胞作为色谱功能基团的色谱材料。
术语 “金属螯合色谱” 当在本申请中使用时表示采用 “金属螯合色谱材料” 的色 谱法。金属螯合色谱基于金属离子和多肽的表面暴露的氨基酸侧链的电子给体基团之间 螯合物的形成， 所述金属离子作为色谱功能基团与散装芯材结合， 诸如 Cu(II)， Ni(II) 或 Zn(II) ； 所述多肽尤其是具有包含咪唑的侧链和包含硫醇基的侧链。所述螯合物在那些侧 链至少部分不被质子化的 pH 值下形成。通过 pH 值的改变， 即， 通过质子化从色谱材料回收 结合的多肽。 示例性的 “金属螯合色谱材料” 是 HiTrap Chelating HP(Amersham Pharmacia Biotec Europe GmbH， 德国 )， 或 Fractogel EMD(EMD Chemicals Inc， USA)。 术语 “离子交换色谱” 当在本申请中使用时表示采用 “离子交换色谱材料” 的色谱 法。术语 “离子交换色谱材料” 的涵义依赖于阳离子是否在 “阳离子交换色谱” 或 “阳离子 交换色谱材料” 中被交换， 或阴离子是否在 “阴离子交换色谱” 或 “阴离子交换色谱材料” 中 被交换。术语 “离子交换色谱材料” 当在本申请中使用时表示固定的高分子量固相， 其携带 共价结合的带电荷基团作为色谱功能基团。为了总体上的电荷中性， 非共价结合的抗衡离 子与共价结合的带电荷基团缔合。 “离子交换色谱材料” 具有以其非共价结合的抗衡离子 交换周围溶液中类似的带电荷离子的能力。取决于其可交换的抗衡离子的电荷， “离子交 换色谱材料” 称为 “阳离子交换色谱材料” 或 “阴离子交换色谱材料” 。此外取决于带电荷 基团的性质， “离子交换色谱材料” 称为例如， 具有磺酸基 (S)， 或羧甲基 (CM) 的阳离子交 换色谱材料。取决于带电荷基团的化学性质， “离子交换色谱材料” 可以另外地分类为强或 弱离子交换色谱材料， 这取决于共价结合的带电荷取代基的强度。例如， 强阳离子交换色 谱材料具有磺酸基作为色谱功能基团， 弱阳离子交换色谱材料具有羧酸基作为色谱功能基 团。 “阳离子交换色谱材料” ， 例如， 可以不同的名称获自大量的公司， 诸如例如， Bio-Rex， Macro-Prep CM( 可获自 Biorad Laboratories， Hercules， CA， USA)， 弱阳离子交换剂 WCX 2( 可 获 自 Ciphergen， 弗 里 蒙 特， CA， USA)， Dowex MAC-3( 可 获 自 陶 氏 化 学 公 司 (Dow chemical company)- 液体离析物， 米德兰， MI， USA)， Mustang C( 可获自 Pall Corporation， East Hills， NY， USA)， 纤 维 素 CM-23， CM-32， CM-52， hyper-D， 和 partisphere( 可 获 自 Whatman plc， Brentford， UK)， Amberlite IRC 76， IRC 747， IRC 748， GT 73( 可获自 Tosoh Bioscience GmbH， 斯图加特， 德国 )， CM 1500， CM 3000( 可获自 BioChrom Labs， TM Terre Haute， IN， USA)， 和 CM-Sepharose Fast Flow( 可获自 GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH， Freiburg， 德国 )。
术语 “羟磷灰石色谱” 当在本申请中使用时表示采用特定形式的磷酸钙作为色 谱材料的色谱法。示例性的羟磷灰石色谱材料是 Bio-Gel HT， Bio-Gel HTP， Macro-Prep
Ceramic( 可获自 Biorad Laboratories)， I 型、 II 型羟磷灰石， HA Ultrogel(Sigma Aldrich Chemical Corp.， USA)， 羟磷灰石快速流动和高分辨率 (Hydroxyapatite Fast Flow and High Resolution)(Calbiochem)， 或 TSK 凝胶 HA-1000(Tosoh Haas Corp.， USA)。
术语 “结合 - 和 - 洗脱模式” 及其语法等价物在本发明中使用时表示色谱法的操 作模式， 其中包含待纯化多肽的溶液施加至色谱材料， 由此待纯化的物质 / 多肽结合至色 谱材料。结果待纯化的物质 / 多肽保留在色谱材料上， 而非目的物质 / 多肽通过流过而被 去除。之后在第二步骤中待纯化的物质 / 多肽从色谱材料上被洗脱并且因此随洗脱溶液从 固定相中被回收。这不一定表示 100％的非目的物质 / 多肽被去除， 但基本上 100％的非目 的物质 / 多肽被去除， 即， 在一个实施方案中， 至少 50％的非目的物质 / 多肽被去除， 在另一 个实施方案中至少 75％的非目的物质 / 多肽被去除， 在进一步的实施方案中， 至少 90％的 非目的物质 / 多肽被去除， 和在一个实施方案中， 多于 95％的非目的物质 / 多肽被去除。
术语 “流通模式” 及其语法等价物当在本发明中使用时表示色谱法的操作模式， 其 中包含待纯化的物质 / 多肽的溶液被施加至色谱材料， 由此待纯化的物质 / 多肽不结合至 色谱材料。结果待纯化的物质 / 多肽以流通方式获得。还存在于溶液中的非目的物质 / 多 肽结合至色谱材料并且从溶液中被去除。这不一定表示 100％的非目的物质 / 多肽从溶液 中被去除， 但基本上 100％的非目的物质 / 多肽被去除， 即， 在一个实施方案中， 至少 50％的 非目的物质 / 多肽从溶液中被去除， 在另一个实施方案中， 至少 75％的非目的物质 / 多肽从 溶液中被去除， 在进一步的实施方案中， 至少 90％的非目的物质 / 多肽从溶液中被去除， 且 在一个实施方案中， 多于 95％的非目的物质 / 多肽从溶液中被去除。
术语 “连续洗脱” 和 “连续洗脱法” 在本申请中可交换使用， 它们表示其中例如， 导 致洗脱 ( 即， 结合的物质 / 多肽从色谱材料的溶出 ) 的物质的浓度被连续升高或降低的色 谱法， 即， 通过一系列小的步幅改变浓度， 在一个实施方案中每个步幅不大于导致洗脱的物 质的浓度的 2％， 在另一个实施方案中不大于 1％。在此 “连续洗脱” 中， 一种或多种条件， 例如， 色谱法的 pH， 离子强度， 盐浓度， 和 / 或流动， 可以线性地改变， 或指数地改变， 或渐进 地改变。在一个实施方案中， 所述改变是线性的。
术语 “分阶洗脱” 和 “分阶洗脱法” 在本申请中是可互换的， 它们表示其中例如导致 洗脱 ( 即， 结合的物质 / 多肽从色谱材料的溶出 ) 的物质的浓度， 即在一个实施方案中， 立 即从一个值 / 水平升高或降低至下一个值 / 水平。在此 “分阶洗脱” 中， 一种或多种条件， 例如， 色谱法的 pH， 离子强度， 盐浓度， 和 / 或流动， 全部从第一 ( 例如， 起始 ) 值立即改变 为第二 ( 例如， 最终 ) 值。在一个实施方案中， 该步骤中的改变大于导致洗脱的物质浓度的 5％的变化， 在另一个实施方案中大于 10％的变化。 “分阶洗脱” 表示条件递增地改变， 即逐 步的改变， 与线性改变相反。在 “分阶洗脱法” 中， 在每次递增后收集新的级分。在每次递 增后保持条件直至该洗脱法中的下一步骤。
如本文报道的一个方面是用于色谱柱中的色谱柱隔板。 一个隔板的存在将色谱柱 分成上色谱柱室和下色谱柱室， 并且所述隔板在色谱柱内具有可变的位置， 所述位置通过 导向环提供， 即， 其可以根据色谱材料的压力依赖性压缩和膨胀在色谱柱内垂直地滑动， 并 且所述隔板包埋在色谱材料中。
在粗制多肽的柱色谱分离或纯化中， 通常采用包括色谱材料和流动相的色谱柱。 通过向流动相施加压力驱使流动相通过色谱柱并随后通过色谱材料。通过流动相的介导，压力也施加到色谱材料， 由此建立了从色谱柱的入口至色谱柱的出口的压降。在色谱柱的 出口处， 压力降低至外部的大气压。因此， 最高压力施加到色谱柱中色谱材料的上部部分。
施加的压力通常一方面取决于色谱材料的粒度， 还取决于流动相的粘度， 因为设 定恒流通过色谱柱， 而不是恒压。一般来说， 压力随着色谱材料粒度的减小而增加。在通过 色谱材料的恒定流速下， 例如， 在色谱材料的再生或清洗期间， 流动相粘度的改变导致施加 到色谱材料的压力的改变。 通常色谱材料不是压力不敏感材料， 即， 其可被压缩并且在压缩 后膨胀。 因此， 随着施加压力的增加， 色谱材料被压缩并且色谱柱内的色谱材料高度， 即， 床 高， 减小。同样， 随着施加压力的减小， 色谱材料再次膨胀并且色谱柱内的色谱材料高度至 多增大至施加压力之前的高度。 色谱材料的此压缩和膨胀同时是整个色谱材料的宏观过程 和色谱材料的单个粒子的微观过程。随着此压缩 - 膨胀循环的次数增加， 色谱材料的粒子 粉碎成较小的粒子。 随着色谱材料的粒子粒度的减小， 色谱材料填料变得更加紧密， 并且随 之， 同时维持通过色谱柱 ( 即， 色谱材料 ) 的恒定液相流动所需的压力增大。这样再次导致 色谱材料粒子的进一步粉碎， 再次导致压力增加， 等等。
色谱柱分离通常可以操作直达最大压力。当达到此压力上限时， 必须整体更换色 谱柱填料。 已经发现如本文报道的由导向环和安装在其中的筛板组成的色谱柱隔板不会干 扰色谱分离过程， 而是使得能够仅可更换一部分色谱材料， 例如， 当达到最大操作压力时， 无需更换整个色谱柱填料。即， 根据本发明的色谱柱隔板容许更换上色谱柱室中的色谱材 料而不干扰下色谱柱室中的色谱材料。因此， 能够去除包含在包括如本文报道的色谱柱隔 板的色谱柱中的全部色谱材料的有限部分， 例如， 在此部分已经塌陷或磨碎或填料质量下 降时， 而无需去除色谱材料的其他部分。 色谱材料的这种部分去除是有可能的， 因为一方面 隔板将色谱柱中的全部色谱材料分成不同的部分， 并且在另一方面其防止下色谱柱室中装 填的色谱材料受到去除上色谱柱室中色谱材料的干扰。因此， 至少未暴露于最大压力变化 并且因此没有被磨碎的那部分色谱材料可以进一步被使用而对分离效率没有负面的影响。 但是， 通过保留一部分色谱材料， 可以实现商品成本的降低。
如本文报道的色谱柱隔板包括导向环， 在所述导向环中可以安装由任意惰性材料 制成的筛板。 “惰性材料” 是不会干扰色谱分离过程的材料， 即， 在相同条件下或以其他方式 采用相同条件， 用包括一个或多个如本文报道的色谱柱隔板的色谱柱获得的色谱图与用未 包括色谱柱隔板的色谱柱获得的色谱图是一样的。 此类惰性材料是例如， 金属， 尤其是不锈 钢， 聚硅氧烷， 聚丙烯， 聚乙烯， 聚四氟乙烯， 烧结物料或它们的组合， 尤其是聚四氟乙烯涂 覆的不锈钢。
在一个实施方案中， 如本文报道的色谱柱隔板可以包括单筛板或在另一个实施方 案中包括上筛板和下筛板的组合。如果隔板包括一个筛板， 则该筛板的孔径小于色谱材料 的粒子的尺寸。在一个实施方案中， 所述孔径为色谱材料粒子的平均直径的 10％以下以便 防止筛板的孔被粉碎的色谱材料粒子阻塞。如果隔板包括两个筛板， 则两个筛板可以具有 相同的孔径或两个筛板可以具有不同的孔径。因为色谱材料粉碎成较小的粒子， 在一个实 施方案中， 上筛板的孔径小于下筛板， 在一个实施方案中， 上筛板的孔径为色谱材料粒子的 平均直径的 10％以下。在一个实施方案中， 色谱柱隔板的上筛板和 / 或下筛板为金属网。 在进一步的实施方案中， 上筛板的孔径小于下筛板的孔径。 在一个实施方案中， 色谱柱隔板
或色谱柱隔板的下筛板的孔径为 1μm 至 20μm， 或 1μm 至 10μm， 或 1μm 至 5μm。在另一 个实施方案中， 色谱柱隔板的上筛板的孔径为色谱柱隔板的下筛板孔径的 5％以下， 或色谱 柱隔板的上筛板的孔径为色谱柱隔板下筛板孔径的 10％， 或色谱柱隔板上筛板的孔径为色 谱柱隔板的下筛板孔径的 20％以下。在进一步的实施方案中， 色谱柱隔板下筛板的孔径为 20μm 或 10μm 或 5μm， 且上筛板的孔径为 5μm 或 1μm。
因此， 根据本发明的色谱柱隔板的使用允许下色谱柱室中的色谱材料的较长时间 使用， 以及同时用于减少色谱法的成本。
在一个实施方案中， 上色谱柱室为下色谱柱室体积的 5％至 15％， 在另一个实施 方案中为 10％。在另一个实施方案中， 上色谱柱室为下色谱柱室体积的 20％至 30％， 在一 个实施方案中， 为 25％。 还在进一步的实施方案中， 上色谱柱室的体积与下色谱柱室的体积 相同。
要指出的是如本文报道的色谱柱隔板不会使存在于色谱柱的入口和出口处的隔 板或筛板无法使用。此外， 在色谱材料内还放置额外的隔板。由于与流动相的流动方向垂 直的柱色谱柱的横截面是环状的， 因此筛板且同样隔板也具有环状的外形。隔板的高度小 于色谱柱填料的总长度。 在一个实施方案中， 隔板的高度为 0.1cm 至 10cm， 在另一个实施方 案中为 0.25cm 至 5cm， 且在进一步的实施方案中， 为 0.5cm 至 2cm。隔板的高度为连接至上 色谱柱室的筛板表面和连接至下色谱柱室的筛板表面之间的距离。 如果隔板包括上筛板和 下筛板， 则两个单个筛板的总高度可以小于隔板的高度。 在此实施方案中， 隔板内存在的额 外空间可以用于， 例如， 在筛板放置传感器以记录， 例如， UV 吸收， 或压力， 或经过隔板的流 动相的电导率， 或用于提供额外的阀以去除流动相或用于在色谱柱填料内的一个位置处添 加流动相。 如果隔板包括上筛板和下筛板， 则在一个实施方案中两个筛板具有相同的高度。 在另一个实施方案中， 上筛板和下筛板具有不同的高度。
在一个实施方案中， 色谱柱隔板的直径小于引入其的色谱柱的内径。
在图 1 中， 显示了示例性的色谱柱隔板。在图 1a) 中， 绘制了具有单筛板的隔板， 其包括筛板 (1) 和配件 (2)。在图 1b) 中， 显示了具有上筛板 (3) 和下筛板 (4) 以及配件 (2) 的隔板。在图 1c) 中， 显示了隔板的导向环的垂直横截面， 其包括两个轴向对称的横截 面区域 (5 和 6)， 其中每个轴向对称的横截面区域具有 a) 锥形结构， 其中所述锥形从所述导 向环的外部向内部逐渐变细， 和 b) 用于安装筛板的凹口 (8)， 所述凹口 (8) 具有指向所述导 向环内部的开口。
如本文报道的色谱柱隔板除了筛板以外还包括配件或导向环 ( 两个术语可以交 换使用 ) 用于当所述隔板置于色谱柱内时密封筛板的外缘和色谱柱壁之间的距离。在一个 实施方案中， 配件或导向环由柔性材料制成， 所述柔性材料诸如橡胶， 塑料， 聚硅氧烷， 聚四 氟乙烯， 聚乙烯， 聚丙烯等。 配件或导向环必须是柔性的以便调平一个色谱柱的内径的小差 异或相同标称直径的不同色谱柱之间的小差异， 以防止液相或色谱材料在筛板外部通过隔 板。要指出的是如本文报道的隔板可以仅通过流动相而不通过色谱材料。即筛板的孔径小 于色谱材料粒子的尺寸。
配件或导向环具有环形形状， 其横截面可以具有任何形状， 只要其具有用于接纳 筛板的矩形凹口。例如， 在一个实施方案中， 配件的横截面具有三角形的形状， 在具有最大 内角的三角形的角中具有用于接纳筛板的矩形凹口。在进一步的实施方案中， 配件或导向环具有横截面或提供三角形形式的横截面区域， 在另一个实施方案中提供直角三角形形式 的横截面区域， 其中所述筛板连接至内角为 90°的三角形的角。 在另一个实施方案中， 导向 环的横截面区域为梯形形式， 其在平行边的短边处具有用于接纳筛板的矩形凹口。在一个 实施方案中， 配件为矩形形式， 在另一个实施方案中， 为具有 90°， 90°， 80°和 100°的内 角的矩形。 在一个实施方案中， 80°和 100°的内角位于矩形的上边或底边处。 在一个实施 方案中， 当隔板放置在色谱柱内时， 导向环的最长边是隔板的外缘， 并与色谱柱壁接触。在 另一个实施方案中， 最长边具有垂直定向。 还在另一个实施方案中， 配件或导向环的横截面 区域为具有 90°内角的矩形形式， 在短边之一中或在正方形的情况下在一条边中具有用于 接纳筛板的矩形凹口。 具有凹口的边是配件的指向隔板的中心且同样指向色谱柱的中心的 那条边， 或换句话说， 所述凹口处于与流动相的流动方向平行并且具有小于筛板的外径的 直径的配件或导向环的那条边中。 导向环除了具有防止液相和色谱材料粒子在筛板旁经过 隔板的功能， 其还具有防止在施加外部压力时色谱材料的压缩和膨胀期间整个隔板在色谱 柱中的倾斜和随之被卡住。如本文报道的隔板放置在装填入色谱柱中的色谱材料内。因为 可以沿色谱柱的内壁滑动， 因此所述隔板可以自由地移动并且准确地放入色谱柱内。在装 填色谱柱和从色谱柱中取出隔板期间这是有用的。 因此， 为了防止在隔板下方形成腔隙， 和 随之对色谱分离过程的负面影响， 如本文报道的隔板以允许隔板随着包埋所述隔板的色谱 材料的压缩和膨胀而沿色谱柱的内壁滑动的方式进行构造。在一个实施方案中， 导向环的 垂直横截面区域为三角形或梯形的形式， 在所述形式中所述导向环具有锥形结构， 其中所 述锥形从所述导向环的外部向内部逐渐变细， 即导向环的外缘分别高于其内缘或凹口。在 一个实施方案中， 导向环的外缘高度为凹口高度的至少 1.5 倍。在另一个实施方案中， 导向 环的外缘高度为凹口高度的至少 1.5 倍， 或 2 倍， 或 3 倍， 或多于 3 倍。
如果隔板包括上筛板和下筛板， 在一个实施方案中， 配件或导向环是单个配件或 环， 且在另一个实施方案中， 配件或导向环由上配件或环和下配件或环制成。 在后一种情况 下， 在一个实施方案中， 两个配件或环具有接触区， 所述接触区包括上配件或环的下边和下 配件或环的上边， 由此接触边是平的， 即， 没有凹口或凹槽， 并且与上筛板的下边和下筛板 的上边成直线， 即， 上配件的下边和上筛板的下边形成无偏移的单个表面， 并且同样下配件 或环的上边和下筛板的上边形成无偏移的单个表面， 由此两个表面是平行的。
通常， 配件或导向环的最小内径或上配件和下配件的最小内径小于筛板的外径， 即， 配件或导向环在筛板的外周长内朝向色谱柱的中心延伸。
在一个实施方案中， 配件或导向环在其上表面处包括三个或更多个孔， 每个孔具 有为色谱柱隔板施加装置所使用的螺纹。在进一步的实施方案中， 下配件或导向环在其上 表面处包括三个或更多个无螺纹孔。在一个实施方案中， 配件包括 3 至 6 个具有或不具有 螺纹的孔。
在图 2 中， 显示了不同的配件或导向环的横截面区域。在图 2a) 中， 显示了三角形 配件的横截面区域， 在图 2b) 中， 显示了梯形配件的横截面区域， 且在图 2c) 中， 显示了矩形 配件的横截面区域。从图 2 中的横截面区域可以看出， 配件或导向环覆盖筛板的外径充分 地延伸。
在图 3 中， 显示了具有包括三个螺纹孔的导向环的隔板的立体图。
色谱柱隔板可以用不同的方法插入至色谱柱中。 用于将如本文报道的色谱柱隔板插入至包括第一部分色谱材料的色谱柱中的方法包括将色谱柱隔板置于色谱柱内的液体 或色谱材料或色谱材料浆的表面的上面， 向所述色谱柱的顶部施加压力， 并且随之使所述 色谱柱隔板在色谱柱内沿流动相的流动方向移动直至该色谱柱隔板处于色谱柱内的预定 位置处。
在不同的或备选方法中， 使用色谱柱隔板施加装置。 此装置包括中央的钟形本体 ； 与所述装置的顶部连接的用于使该装置上下移动的设备 ； 至少三个与色谱柱隔板连接的连 接件， 由此所述连接件连接 / 固定至隔板和本体 ； 以及本体中的至少一个孔， 当该装置置于 色谱柱中时所述孔用于该装置下方区域和该装置上方区域之间的压力调节。 在一个实施方 案中， 所述连接件是在其下端部具有螺纹的杆， 所述螺纹用于将所述连接件固定至色谱柱 隔板的配件。 在将隔板放置在其预定位置后， 将该装置的本体从柱中取出， 将连接件从隔板 的配件拧出， 并且也从柱中取出。同样通过颠倒步骤的次序从柱中取出包括单个筛板的隔 板。
如果隔板包括上筛板和下筛板， 则通过颠倒如前面所概述的步骤的次序取出上筛 板。为了取出下筛板， 使用抓取器， 该抓取器钩住下导向环的上表面中存在的孔。
在图 4 中显示了具有导向环的色谱柱隔板， 所述导向环包括三个具有螺纹的孔， 所述孔经由三个连接件连接至色谱柱隔板施加装置。
用包埋有如本文报道的色谱柱隔板的色谱材料装填色谱柱分为两个装填阶段。 以 根据通用方法将第一部分色谱材料装填入柱中来开始装填。 之后将如本文报道的色谱柱隔 板放置在第一部分色谱材料的上面。 最后在隔板的上面根据通用方法将第二部分色谱材料 装填至柱中。此装填法是从底部至顶部的装填。相反， 没有包括根据本发明的隔板的柱从 顶部装填， 尤其需要较高的装填压力。因此， 如果使用一个隔板， 如本文报道的色谱柱隔板 提供了以两个相继的步骤装填色谱柱的方式， 或如果使用两个以上的隔板则提供了以三个 以上相继的步骤装填色谱柱的方式。采用如本文报道的隔板， 柱被分成上室和下室 ( 一个 隔板 ) 或下室、 中间室和上室 ( 两个隔板 )， 其中每个室本身相当于具有减小的色谱材料床 高的色谱柱。随着将色谱柱分成较小的室， 改变即减小了 ( 一个室中色谱材料的 ) 体积与 ( 该室的 ) 表面的比率， 并且增加了色谱材料填料的稳定性。
在图 5 中， 绘制了包括一个 ( 图 5a)、 两个 ( 图 5b) 和三个 ( 图 5c) 色谱柱隔板的 色谱柱。
对于色谱材料、 待纯化多肽和色谱条件的每种组合， 必须单独地确定需要更换色 谱材料的时间点。这可以取决于例如， 待遵循的规范或收率。一旦决定要更换色谱材料， 可 以去除上室中的色谱材料部分而不干扰或损坏色谱柱下室中的色谱材料部分的填料。 在使 用色谱柱期间色谱材料的破碎导致具有减小的直径 ( 尺寸 ) 的色谱材料粒子。这些粒子越 小， 更多的隔板的筛板的孔被阻塞。因此， 还建议从柱中取出隔板， 清洗筛板并且一旦将上 室中的色谱材料部分去除并在向色谱柱的上室中填充新的色谱材料之前将隔板再次引入 至柱中。如果使用包括上筛板和下筛板的隔板， 仅上筛板需要被去除并且下筛板可以仍然 在原位。在此实施方案中， 下室中色谱材料的装填很少或甚至根本不被干扰。
可以在任何色谱柱中使用如本文报道的色谱柱隔板以便将色谱柱分成两个、 三个 或多个单独的和独立的室。
在作出本发明时在我们的实验室中可获得足量的多肽促红细胞生成素以评价该色谱柱隔板的性能。这不意在限制本发明的范围， 而仅作为实例给出以说明本发明。
在图 6 中， 显示了采用 Vydac C4 色谱材料色谱分离促红细胞生成素的 UV- 吸收洗 脱图， 由此采用不包括色谱柱隔板的色谱柱获得色谱图 a) 且采用包括一个如本文报道的 色谱柱隔板的色谱柱获得色谱图 b)。可以看出色谱图是相同的， 由此显示隔板对色谱行为 没有影响。 因此， 采用根据本发明的隔板， 能够将色谱柱中的色谱材料分成两个或多个不同 的部分或室而不会干扰色谱分离过程。
在图 7 中， 显示了在多用途色谱柱的连续再生循环中包括如本文报道的色谱柱隔 板的色谱柱的背压增加。再生步骤最适合对此进行例证， 因为在此步骤中在色谱循环中发 生最高的背压。如从图 7 中可见， 在连续再生步骤中背压持续地增加， 可能是由于色谱材料 不断破坏的缘故。在循环 58 次后， 色谱柱的上室中用过的和破损的色谱材料更换为新鲜 的， 即， 新的色谱材料。通过仅更换上面部分的色谱材料， 实现了后续再生步骤中背压的大 幅降低。因此， 如本文报道的色谱柱隔板首先不会影响色谱分离， 其次提供了简易、 有效和 成本节约的色谱柱填料更新。要指出的是在此柱中的色谱材料再次更换， 并且随后下室中 的色谱材料运行 98 个连续的分离循环而无需更换。不使用如本文报道的隔板， 柱材料必须 在平均 15 个循环后要被更换。
在图 8 中， 显示了 Vydac C4 色谱柱的塔板数目的确定。在色谱图 a) 中， 用于确定 塔板数目的示踪物质的峰分成两个峰。这显示该色谱柱填料有缺陷， 例如， 色谱材料的破 坏， 例如， 其开放了备选的流路， 引起可观察到的峰加倍。在色谱图 b) 中， 显示了在更换色 谱柱上室中的色谱材料部分后塔板数目的确定。再没有看到峰的加倍。
此外， 采用如本文报道的色谱柱隔板， 能够将第一色谱材料装填至下室中， 并且将 不同的第二色谱材料装填至色谱柱的上室中。采用两种不同的色谱材料， 获得了混合型色 谱柱。
在图 9 和 10 中， 显示了色谱分离 IL13 受体 α 抗体的不同 UV- 吸收洗脱图。通常 抗体可以通过阳离子交换色谱和阴离子交换色谱的组合来纯化， 由此离子交换色谱可以具 有任何次序。在图 9 中， 显示了第一个柱中的第一 SP- 琼脂糖阳离子交换色谱 ( 图 9a) 和 第二柱中的第二 Q- 琼脂糖阴离子交换色谱 ( 图 9b) 的 UV- 吸收洗脱图。在此两步程序中， 包含抗体的洗脱液在施加至第二色谱柱之前已经被处理。在图 10 中， 显示了通过如本文报 道的混合型色谱纯化抗体的分析性 SEC 洗脱图。图 10a) 显示了图 9b) 的产物峰的分析图。 图 10b) 是在混合型色谱柱的上室中采用 SP- 琼脂糖和在混合型色谱柱的下室中采用 Q- 琼 脂糖的混合型色谱的产物峰的图。图 10c) 提供了在混合型色谱柱的上室中使用 Q- 琼脂糖 和在混合型色谱柱的下室中采用 SP- 琼脂糖的混合型色谱的产物峰的图。如从图 10 中给 出的色谱图可见， 混合型色谱结果基本上与单独的色谱步骤相同， 仅由于色谱步骤的不同 次序引起保留时间稍有不同。
如本文报道的色谱柱隔板 ：
- 提供了在上和下色谱柱室中使用不同类型的相同色谱材料的手段， 例如， 在上色 谱柱室中可以使用具有较高机械稳定性的色谱材料， 且在下色谱柱室中可以使用具有较低 机械稳定性的色谱材料 ；
- 提供了更换上色谱柱室中用过的或磨碎的或塌陷的色谱材料而不需要更换下色 谱柱室中的色谱材料的手段 ；- 提供了在每个色谱柱室中使用不同的具有不同的色谱功能基团的色谱材料从而 能够组合两种不同的色谱法的手段。
通过使用如本文报道的色谱柱隔板， 例如可以在下色谱柱室中使用对压力敏感的 色谱材料， 因为隔板减小了引导至下色谱柱室中的色谱材料的压力。即通过使用如本文报 道的隔板， 可以实现色谱材料内部的压力减小。 因此， 包括如本文报道的隔板的色谱柱与具 有相同的床高但没有如本文报道的隔板的色谱柱相比具有减小的背压 ( 背压是驱使流动 相通过色谱材料所需的压力 )， 即， 减小了总压力以及压力变化和压力增量。 如上所述， 减小 的压力和减小的压力变化可以提供增加数目的色谱循环， 无需更换色谱柱内的色谱材料。 在一个实施方案中， 包括具有距离固定件的色谱柱隔板的色谱柱的下色谱柱室中的色谱材 料选自 DEAE- 琼脂糖或 HA-Ultrogel。
另外通过使用如本文报道的隔板， 色谱柱可以以增加的流动相流速操作。这是由 于必须施加于色谱柱以实现预定流速所需的压力减小所导致的 ( 参见图 11)。
在一个实施方案中， 所述色谱柱隔板包括指向色谱柱的下端部的距离固定件。在 另一个实施方案中， 所述色谱柱隔板包括 3-6 个距离固定件。
提供下面的实施例和附图用于辅助理解本发明， 本发明的真实范围在后附的权利 要求中给出。要理解在不背离本发明的实质的前提下可以对给出的步骤作出改动。 附图说明 图 1 根据本发明的示例性色谱柱隔板 ： a) 具有单个筛板的隔板， 其包括筛板 (1) 和配件 (2) ； b) 具有上筛板 (1) 和下筛板 (3) 以及上配件 (2) 和下配件 (4) 的隔板 ； c) 隔 板的导向环的垂直横截面， 包括两个轴向对称的横截面区域 (5 和 6)， 每个轴向对称的横截 面区域具有 i) 锥形结构， 其中所述锥形从所述导向环的外部向内部逐渐变细， 和 i) 用于安 装筛板的凹口 (8)， 所述凹口 (8) 具有指向所述导向环内部的开口。
图 2 不同配件的横截面区域 ： a) 三角形配件的横截面， b) 梯形配件的横截面区域， c) 矩形配件的横截面区域， d) 上配件和下配件的横截面区域。
图 3 显示了包括三个螺纹孔的配件的立体图。
图 4 具有包括三个螺纹孔的配件的色谱柱隔板的横截面， 所述三个螺纹孔经由三 个连接件连接至色谱柱隔板施加装置。
图 5 包括一个 (a)、 两个 (b)、 和三个 (c) 色谱柱隔板的色谱柱。
图 6 采用 Vydac C4 色谱材料色谱分离促红细胞生成素的 UV- 吸收洗脱图， 由此采 用不包括根据如本文报道的色谱柱隔板的色谱柱获得色谱图 a) 且采用包括一个如本文报 道的色谱柱隔板的色谱柱获得色谱图 b)。
图 7 在多用途色谱柱的连续再生循环中包括如本文报道的色谱柱隔板的色谱柱 的背压增加。
图 8Vydac C4 色谱柱的塔板数目的确定。
图 9IL13 受体 α 抗体的色谱图的 UV- 吸收 Q- 琼脂糖洗脱图 ： a)SP- 琼脂糖阳离 子交换色谱 ； b)Q- 琼脂糖阴离子交换色谱。
图 10 分析性 SEC 洗脱图 ： a) 图 9 的产物峰的分析图 ； b) 在混合型色谱柱的上室 中采用 SP- 琼脂糖和在混合型色谱柱的下室中采用 Q- 琼脂糖的混合型色谱的产物峰的图 ；
c) 在混合型色谱柱的上室中使用 Q- 琼脂糖和在混合型色谱柱的下室中采用 SP- 琼脂糖的 混合型色谱的产物峰的图。
图 11 显示对于阴离子交换色谱材料 (DEAE 琼脂糖 (DEAE Sepharose)) 所得的柱 ( 背 ) 压 vs. 设定的流动相流动。菱形 ： 不具有如本文报道的隔板的色谱柱 ； 三角形 ： 具有 如本文报道的隔板的色谱柱。 可见采用如本文报道的隔板对于较高的床高可以实现背压的 减小。
实施例 1
促红细胞生成素的发酵和纯化
促红细胞生成素的发酵和纯化如欧洲专利 No.1 064 951 B1 中所报道的那样进 行。本文给出的数据在反相 HPLC 中在 Vydac C4 色谱材料上获得， 如 EP 1 064 951 的实施 例 1d) 中所报道的那样。
RP-HPLC 材料 Vydac C4(Vydac) 由硅胶粒子组成， 其表面携带 C4- 烷基链。将促 红细胞生成素与蛋白质杂质分离是基于疏水相互作用的强度差异来进行。 采用在稀三氟乙 酸中的乙腈梯度进行洗脱。使用不锈钢柱 ( 填充以 2.8 至 3.2 升的 Vydac C4 硅胶 ) 进行 制备性 HPLC。通过加入三氟乙酸将羟磷灰石 Ultrogel 洗脱液酸化并将其加样至 Vydac C4 柱上。对于洗涤和洗脱， 使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集各级分并立即用磷酸盐缓冲 液中和。 实施例 2
抗 -(IL-13Rα1) 抗体的制备
抗 -IL13 受体 α 抗体根据 WO 2006/072564 中报道的数据和方法制备， 尤其是根 据实施例 10 至 12 制备。
顺序色谱 (Sequential-Chromatography)
对于该离子交换色谱， 将包含抗 -IL13Rα 抗体的蛋白 A 洗脱液调节至 pH 6.5 并 施加至已经用 10mM 磷酸钾缓冲液平衡的 SP- 琼脂糖阳离子交换色谱柱上。在使用 10mM 磷 酸钾缓冲液的洗涤步骤后， 抗体用 pH 6.5 的 50mM 磷酸钾缓冲液洗脱。将 SP- 琼脂糖洗脱 液的 pH 值调节至 pH 7.1 并施加至已经用 35mM 磷酸钾缓冲液平衡的 Q- 琼脂糖阴离子交换 色谱柱上。纯化的抗体由阴离子交换色谱柱的流通物获得。
混合型色谱 (Hybrid-Chromatography)
对于采用包括根据本发明的色谱柱隔板的色谱柱的混合型 - 离子交换色谱， 将包 含抗 -IL13Rα 抗体的蛋白 A 洗脱液调节至 pH 7.1 并施加至已经用 10mM 磷酸钾缓冲液平 衡的混合型 - 色谱柱上。在用 10mM 磷酸钾缓冲液洗涤后， 抗体用 pH 7.1 的 20mM 磷酸钾缓 冲液洗脱。