移动式色谱柱隔板.pdf

1、10申请公布号CN102470286A43申请公布日20120523CN102470286ACN102470286A21申请号201080032204322申请日2010072809009859120090730EPB01D15/22200601G01N30/6020060171申请人霍夫曼拉罗奇有限公司地址瑞士巴塞尔72发明人安德烈亚斯布拉舍克罗伯托法尔肯施泰因74专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人吴小明54发明名称移动式色谱柱隔板57摘要本发明涉及一种色谱柱隔板，所述隔板将色谱柱分隔成上色谱柱室和下色谱柱室，并且所述隔板在所述色谱柱内具有可变的位置且被色谱材料包埋。所

2、述隔板允许更换所述上色谱柱室中的色谱材料而无需更换所述下色谱柱室中的色谱柱材料并且其还允许在一个色谱柱内组合具有不同的色谱功能基团的两种不同的色谱材料。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2012011786PCT申请的申请数据PCT/EP2010/0046212010072887PCT申请的公布数据WO2011/012296EN2011020351INTCL权利要求书2页说明书14页附图12页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书14页附图12页1/2页21用于液相色谱柱中的环形导向环，其特征在于所述导向环具有包括两个轴向对称的横截面区域的垂直横截面，其中

3、每个所述轴向对称的横截面区域具有A锥形结构，其中所述锥形是从所述导向环的外部向内部逐渐变细，和B用于安装筛板的凹口，所述凹口具有指向所述导向环的内部的开口。2根据权利要求1所述的环，其特征在于所述凹口是矩形凹口。3根据前述任一项权利要求所述的环，其特征在于每个所述横截面区域具有三角形形状且最长边的长度为所述凹口的直径的至少15倍。4根据前述任一项权利要求所述的环，其特征在于所述环由橡胶、塑料、聚硅氧烷、聚四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯制成。5根据权利要求14中任一项所述的导向环在将筛板安装至圆筒形液相色谱柱中的用途。6色谱柱隔板，其包括根据权利要求14中任一项所述的导向环和安装至所述导向环中的筛板。

4、7根据权利要求6所述的隔板，其特征在于所述筛板是A单个筛板，或B具有上筛板和下筛板的双筛板。8根据权利要求6或7任一项所述的隔板，其特征在于A所述筛板具有1M至20M的孔径，或B每个所述筛板彼此独立地具有1M至20M的孔径，由此所述上筛板的孔径小于所述下筛板的孔径。9根据权利要求68中任一项所述的隔板，其特征在于所述筛板由金属、聚硅氧烷、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、烧结物料或它们的组合制成。10根据权利要求69中任一项所述的隔板，其特征在于所述隔板包括距离固定件，所有所述距离固定件均与所述隔板的一侧连接。11根据权利要求610中任一项所述的色谱柱隔板用于将色谱柱分成多个室的用途。12根据权利要

5、求610中任一项所述的色谱柱隔板用于将色谱柱分隔成上色谱柱室和下色谱柱室的用途。13根据权利要求610中任一项所述的色谱柱隔板用于将色谱柱中的色谱材料分隔成两个不同的部分的用途。14根据权利要求610中任一项所述的色谱柱隔板用于分隔一个色谱柱中两种不同的色谱材料的用途。15色谱柱，其包括一个或多个根据权利要求610中任一项所述的色谱柱隔板。16根据权利要求15所述的柱，其特征在于所述色谱柱包括一个或两个色谱柱隔板。17根据权利要求15至16中任一项所述的柱，其特征在于任一色谱柱隔板与第一种色谱材料接触并与第二种色谱材料接触，由此所述第一种和第二种色谱材料是A具有相同的色谱功能基团且具有相同或不

6、同粒度的色谱材料，或B具有不同的色谱功能基团的色谱材料。18根据权利要求15至17中任一项所述的色谱柱用于纯化多肽的用途。19色谱柱填充装置，其特征在于所述装置在其底部处具有与根据权利要求6至10中权利要求书CN102470286A2/2页3任一项所述的色谱柱隔板相反的形状和小于所述导向环的外径的直径。20成套部件，其包括A根据权利要求6至10中任一项所述的色谱柱隔板，B配件，C色谱柱隔板施加装置。权利要求书CN102470286A1/14页4移动式色谱柱隔板技术领域0001本发明属于色谱领域，更具体地属于采用色谱柱通过色谱法纯化多肽的领域。本文报告了一种色谱柱隔板SEPARATOR，其可以将

7、色谱柱分成上色谱柱室和下色谱柱室，且所述隔板在色谱柱内具有可变的位置，即，所述隔板可以随着周围色谱材料的压力依赖性压缩而滑动。0002发明背景0003多肽在当今医疗产业组合中具有重要作用。对于人类应用，每种药用物质必须满足不同的标准。为了确保生物药剂对人类的安全性，将会导致严重损害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白特别需要被去除。为了满足质量管理规范，一个或多个纯化步骤需要遵照制造工艺。其中，纯度、产量和收率在确定适当的纯化工艺中具有重要作用。0004在通常的色谱法中，采用色谱柱，所述色谱柱基本上包括具有上配件FITTING和下配件的柱壳体，所述柱壳体依次地包括柱顶部处的入口、柱底部处的出口、上色谱柱

8、筛板FRIT、下色谱柱筛板、上分配板和色谱材料。0005常规的色谱法及其用途对于本领域技术人员是已知的。参见，例如，CHROMATOGRAPHY色谱法，第5版，PARTAFUNDAMENTALSANDTECHNIQUES部分A基本原理和技术，HEFTMANN，E编辑，ELSEVIERSCIENCEPUBLISHINGCOMPANY，纽约，1992；ADVANCEDCHROMATOGRAPHICANDELECTROMIGRATIONMETHODSINBIOSCIENCES生物科学中的色谱法和电迁移法，DEYL，Z编辑，ELSEVIERSCIENCEBV，阿姆斯特丹，荷兰，1998；CHROMAT

9、OGRAPHYTODAY当今色谱法，POOLE，CF，和POOLE，SK，ELSEVIERSCIENCEPUBLISHINGCOMPANY，纽约，1991；SCOPES，PROTEINPURIFICATIONPRINCIPLESANDPRACTICE蛋白质纯化原理和实践1982；SAMBROOK，J，等编辑，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL分子克隆实验室指南，第2版，COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，冷泉港，NY，1989；或CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY现代分子生物学实验技术，AUSUBEL

10、，FM，等编辑，JOHNWILEYSONS，INC，纽约。0006为了纯化已经通过例如细胞培养法制备的免疫球蛋白，通常采用不同色谱步骤的组合。通常蛋白A亲和色谱法后紧接着进行一个或两个额外的分离步骤。最后的纯化步骤是所谓的“精细纯化步骤POLISHINGSTEP”以去除痕量的杂质和污染物，如聚集的免疫球蛋白、残留的HCP宿主细胞蛋白、DNA宿主细胞核酸、病毒或内毒素。对于该精细纯化步骤，通常使用流通模式的阴离子交换材料。0007在WO2006/048514中，报道了一种容器，其包括开口的、形状互补的上端部和下端部和膜滤器，其中色谱混合物置于所述容器中，所述膜滤器固定于所述容器的下端部。在US6

11、,458,273中报道了一种高通量液相色谱柱组件，其包括与具有分离室的分离柱流体连通的具有加样室的加样柱，所述加样柱具有第一内径和第一长度，所述分离柱的直径小于所述加样柱的内径且长度大于所述加样柱的长度。0008高压液相色谱柱报道于US4,719,011中，其可以被模块化地修改长度和/或内径并且在模块化系统中可以包含其他部件，例如，柱区段COLUMNSECTION、用于连接不同内说明书CN102470286A2/14页5径的柱区段的转接器和锥形转接器，和用于注入或排出流体的端板构件。EP1916522中报道了一种柱装置，其包括具有多个粒子的固定相，其适于与流动相相互作用以便分离溶解在流动相中的

12、样品流体中的不同化合物；用于至少部分地容纳固定相的壳体；和分离固定相的各区段并且与所述壳体强制连接的隔板。0009在WO00/010675中报道了分段式色谱柱，其包括多个被多个多孔构件分隔并限定边界的介质床。在US3,398,512中报道了一种色谱设备。在US3,453,811中报道了其中具有分配元件的色谱柱。在EPA1892526中，报道了一种色谱柱和使用所述色谱柱的筒式色谱柱。在US3,657,864中报道了一种用于解析挥发性混合物的分离系统。0010发明概述0011本文报道的此隔板允许更换上色谱柱室中的色谱材料而无需更换下色谱柱室中的色谱柱材料，其还允许，例如，在一个色谱柱内组合具有不同

13、的色谱功能基团的两种不同的色谱材料，并且在隔板的存在下，可以提供更多的均匀填充的色谱柱。此外，本文报道的隔板减少了色谱柱施加的背压，即，其减少了色谱柱内部的压力。在添加至柱填充物的每个隔板处，压降减小。0012作为一个方面，本文报道了用于液相色谱柱中的环形导向环，其特征在于所述导向环具有包括两个轴向对称的横截面区域5和6的垂直横截面，其中每个所述轴向对称的横截面区域具有0013A锥形结构，其中所述锥形是从所述导向环的外部向内部逐渐变细，和0014B用于安装筛板的凹口8，所述凹口具有指向所述导向环内部的开口。0015在一个实施方案中，所述凹口是矩形凹口。在进一步的实施方案中，每个所述横截面区域具

14、有三角形形状且最长边7的长度为所述凹口8的直径的至少15倍。在进一步的实施方案中，所述环由橡胶、塑料、聚硅氧烷、聚四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯制成。0016如本文报道的另一方面是如本文报道的导向环用于将筛板安装至圆筒形液相色谱柱中的用途。0017另一个方面是一种色谱柱隔板，其包括如本文报道的导向环和安装至所述导向环中的筛板。0018在一个实施方案中，所述筛板是0019A单个筛板，或0020B具有上筛板和下筛板的双筛板。0021在另一个实施方案中，A所述筛板具有1M至20M的孔径，或B每个所述筛板彼此独立地具有1M至20M的孔径，由此所述上筛板的孔径小于所述下筛板的孔径。在另一个实施方案中，所述筛板

15、由金属、聚硅氧烷、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、烧结物料或它们的组合制成。在进一步的实施方案中，所述隔板包括距离固定件DISTANCEHOLDER，所有距离固定件均与所述隔板的一侧连接。0022在一个实施方案中，所述色谱柱隔板的特征在于0023A所述隔板将色谱柱分隔成上色谱柱室和下色谱柱室，并且0024B所述隔板通过沿色谱柱的内壁滑动在色谱柱内具有可变的位置。0025在一个实施方案中，所述色谱柱隔板包括一个筛板，在另一个实施方案中，所述隔板包括上筛板和下筛板。在进一步的实施方案中，所述色谱柱隔板或所述上筛板或所述下说明书CN102470286A3/14页6筛板的孔径为1M至20M，由此上筛板的孔

16、径小于所述下筛板的孔径。在另一个实施方案中，所述筛板由金属、聚硅氧烷、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、烧结物料或它们的组合制成。在一个实施方案中，所述色谱柱隔板具有连接至一侧的3个或更多个距离固定件。在一个具体实施方案中，所述距离固定件连接到具有较大孔径的色谱柱隔板的一侧。0026如本文报道的另一个方面是如本文报道的色谱柱隔板用于将色谱柱分成多个室的用途。如本文报道的进一步方面是如本文报道的色谱柱隔板用于将色谱柱分隔成上色谱柱室和下色谱柱室的用途。还有另一个方面是如本文报道的色谱柱隔板用于将色谱柱中的色谱材料分隔成两个不同的部分的用途。如本文报道的再一个方面是如本文报道的色谱柱隔板用于分隔一个色谱

17、柱中两种不同的色谱材料的用途。0027如本文报道的进一步方面是根据本发明的色谱柱隔板用于将包含色谱材料的色谱柱分隔成两个分开的室，由此所述色谱柱隔板被包埋在色谱柱中的色谱材料中的用途，如本文报道的色谱柱隔板用于将包含色谱材料的色谱柱分隔成两个分开的室，由此所述色谱柱隔板分隔一个色谱柱中两种不同的色谱材料的用途。0028如本文报道的还有的另一个方面是包括至少一个，即，一个或多个如本文报道的色谱柱隔板的色谱柱。在一个实施方案中，所述色谱柱包括一个或两个色谱柱隔板。在此方面的进一步实施方案中，任一色谱柱隔板与第一种色谱材料接触并与第二种色谱材料接触，由此所述第一种和第二种色谱材料是0029A具有相同

18、的色谱功能基团且具有相同或不同粒度的色谱材料，或0030B具有不同的色谱功能基团的色谱材料。0031如本文报道的另一个方面是色谱柱用于纯化多肽的用途，所述色谱柱包括至少一个如本文报道的色谱柱隔板。0032如本文报道的另一个方面是色谱柱施加装置，由此所述装置在其底部处具有与如本文报道的色谱柱隔板的上表面形状相反的形状和小于所述导向环的外径的直径。0033发明详述0034本文报道了一种用于液相色谱柱中的环形导向环，其特征在于所述导向环具有包括两个轴向对称的横截面区域的垂直横截面，其中每个所述轴向对称的横截面区域具有0035A锥形结构，其中所述锥形是从所述导向环的外部向内部逐渐变细，和0036B用于

19、安装筛板的凹口，所述凹口具有指向所述导向环内部的开口。0037报道了一种色谱柱隔板，其用于将色谱柱中的色谱材料分隔成两个分开的部分，由此0038A所述隔板将色谱柱分隔成上色谱柱室和下色谱柱室，和0039B所述隔板在色谱柱内具有可变的位置，和0040C所述隔板包埋在所述色谱材料中。0041在柱色谱法中，通过色谱分离法经由与色谱材料的相互作用将至少一种或多种目的多肽，即待纯化的一种或多种多肽，与不感兴趣的其他多肽和物质分开。0042术语“多肽”表示天然或合成产生的、由通过肽键连接的氨基酸残基组成的聚合物。少于约20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”。包含一条或多条氨基酸链或一条具有100个以上的氨基

20、酸残基的氨基酸链的多肽可以称为“蛋白”。另外多肽可以包含非氨基酸成分，诸如糖基。糖基和其他非氨基酸成分可以由产生所述多肽的细胞加入，并且其将随着说明书CN102470286A4/14页7细胞的类型而变化。多肽以其氨基酸主链结构来限定；通常不指定诸如糖基的取代基，但可以存在取代基。在一个实施方案中，所述多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或包含免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的融合蛋白。0043术语“免疫球蛋白”表示通常包含两个轻链多肽轻链，LC和两个重链多肽重链，HC的多肽。每条重链和轻链包含可变区通常是链的氨基末端部分，所述可变区包含与抗原相互作用的特异性结合区CDR，互补决定区。每个重链和轻链还

21、包含恒定区通常是链的羧基末端部分，所述恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞、一些吞噬细胞和经典补体系统的第一成分C1Q。通常轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，而重链包含重链可变区、铰链区和和重链恒定区，即CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和任选的CH4结构域。免疫球蛋白可以多种形式存在，包括，例如，片段FV、FAB和FAB2以及单链例如，HUSTON，JS等，PROCNATLACADSCIUSA美国科学院院刊85198858795883；BIRD，RE，等，SCIENCE科学2421988423426；通常，HOOD，LE，等，IMMUNOL

22、OGY免疫学，BENJAMINNY，第二版1984以及HUNKAPILLER，T和HOOD，L，NATURE自然32319861516。取决于重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白被分为不同的类型IGA、IGD、IGE、IGG和IGM。这些类型中的一些被进一步分为亚类同型，例如，IGG分为IGG1、IGG2、IGG3和IGG4，或IGA分为IGA1和IGA2。根据免疫球蛋白所属的免疫球蛋白类型，免疫球蛋白的重链恒定区分别称为AIGA、DIGD、EIGE、GIGG和MIGM。另外可能存在两种类型的免疫球蛋白轻链，型轻链和型轻链。0044术语“色谱材料”当在本申请内使用时一方面表示可以在目的多肽的

23、色谱纯化中在无需进一步修饰的条件下使用的固体材料，诸如羟磷灰石，以及还表示包含已经例如通过共价键引入/连接色谱功能基团修饰的散装芯材的材料，诸如SPSEPHAROSE散装芯材被理解为不参与色谱分离，即待分离多肽和色谱材料的色谱功能基团之间的相互作用。其仅仅提供色谱功能基团连接的三维构架，并且确保包含待纯化多肽的溶液可以接触色谱功能基团。在一个实施方案中，所述散装芯材是固相。因此，在另一个实施方案中，“色谱材料”是连接色谱功能基团的固相。在另一个实施方案中，“色谱功能基团”是可电离疏水基团，或疏水基团，或其中不同的色谱功能基团组合在一起以便结合仅特定类型的多肽的复合基团，或共价结合的带正电荷或负

24、电荷的基团。0045通常待纯化多肽作为经缓冲的水性溶液施加至色谱材料。0046术语“施加于APPLYINGTO”及其语法等价物当在本申请中使用时表示色谱纯化多肽的部分步骤，其中使包含待纯化的目的多肽的溶液与色谱材料接触。这表示包含待纯化多肽的溶液在色谱柱的上部入口处被加入至包含色谱材料的色谱柱。包含待纯化的目的多肽的溶液通过色谱材料，由此允许色谱材料和溶液中的物质之间的相互作用。取决于条件，诸如例如PH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，包含在所述溶液中的物质与色谱材料特异性地相互作用，由此取决于与色谱材料的相互作用，实现它们通过色谱柱的移动。目的多肽可以从纯化步骤后获得的溶液中，即，从洗脱液中

25、，通过本领域技术人员熟悉的方法，诸如沉淀、盐析、超滤、渗滤、冻干、亲和色谱、或溶剂体积减小从而获得基本均质形式的目的物质而回收。0047术语“缓冲的”当在本申请中使用时表示其中由于酸性或碱性物质的添加或释放说明书CN102470286A5/14页8引起的PH改变通过缓冲物质来调平的溶液。可以使用导致所述作用的任何缓冲物质。在一个实施方案中，使用药用缓冲物质，诸如，例如，磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉或其盐、2N吗啉代乙磺酸或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、或三羟甲基氨基甲烷TRIS或其盐。在一个实施方案中，所述缓冲物质是磷酸或其盐，或乙酸或其盐，或柠檬酸或其盐，或组氨酸或其盐。任

26、选地缓冲的溶液可以包含额外的盐，诸如，例如，氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠、或柠檬酸钾。0048在液相色谱柱色谱纯化方法中，色谱材料位于柱壳体内并且表示为“固定相”。为了使固定相能够与施加于其上的溶液中的物质/多肽相互作用，固定相被“流动相”包绕或包埋在“流动相”中。术语“流动相”表示液体，例如，缓冲的，水溶液，水和有机溶剂的混合物，或有机溶剂，其用于其中采用固定相的色谱纯化法中。0049已充分地确定了不同的色谱法，并且这些色谱法广泛用于多肽回收和纯化，诸如采用微生物蛋白例如，蛋白A或蛋白G亲和色谱的亲和色谱、离子交换色谱例如，阳离子交换羧甲基树脂，阴离子交换氨乙基树脂和混合模式交换

27、，嗜硫吸附例如，采用巯基乙醇和其他SH配体，疏水相互作用或芳烃吸附色谱例如，采用苯基琼脂糖，氮杂嗜沙蟾毒树脂AZAARENOPHILICRESINS，或间氨基苯硼酸，金属螯合物亲和色谱法例如，采用NIII和CUII亲和材料，尺寸排阻色谱，和电泳法诸如凝胶电泳，毛细管电泳参见，例如，VIJAYALAKSHMI，MA，APPLBIOCHEMBIOTECH应用生物化学和生物技术75199893102。0050术语“疏水电荷诱导色谱”，简称“HCIC”，表示采用“疏水电荷诱导色谱材料”的色谱法。“疏水电荷诱导色谱材料”是包含色谱功能基团的色谱材料，所述色谱功能基团可以在一个PH范围内与待纯化物质/多肽

28、形成疏水键并且在另一个PH范围内带有正电荷或负电荷，即HCIC使用可电离的疏水基团作为色谱功能基团。通常，多肽在中性PH条件下结合于疏水电荷诱导材料，并且之后通过改变PH值生成电荷排斥而被回收。示例性的“疏水电荷诱导色谱材料”是BIOSEPRAMEP或HEAHYPERCELPALLCORP，USA。0051术语“疏水相互作用色谱”，简称“HIC”，表示其中采用“疏水相互作用色谱材料”的色谱法。“疏水相互作用色谱材料”是结合了作为色谱功能基团的疏水基团，诸如丁基、辛基或苯基的色谱材料。被施加的多肽根据其表面暴露的氨基酸侧链的疏水性而被分离，所述表面暴露的氨基酸侧链可以与疏水相互作用色谱材料的疏水

29、基团相互作用。多肽和色谱材料之间的相互作用可以受温度、溶剂和溶剂的离子强度影响。例如温度升高支持多肽和疏水相互作用色谱材料之间的相互作用，因为氨基酸侧链的运动增加并且在较低温度下包埋在多肽内部的疏水氨基酸侧链变得可以接近。此外，KOSMOTROPIC盐促进疏水相互作用而离液盐CHAOTROPICSALT减弱疏水相互作用。“疏水相互作用色谱材料”例如是，苯基琼脂糖PHENYLSEPHAROSECL4B、6FF、HP、苯基SUPEROSEPHENYLSUPEROSE、辛基琼脂糖OCTYLSEPHAROSECL4B、4FF和丁基琼脂糖BUTYLSEPHAROSE4FF所有均可获自AMERSHAMPH

30、ARMACIABIOTECHEUROPEGMBH，德国，它们经由缩水甘油醚与散装材料连接而获得。0052术语“亲和色谱”当在本申请中使用时表示采用“亲和色谱材料”的色谱法。在亲和色谱中，多肽根据与色谱材料的色谱功能基团形成静电相互作用、形成疏水键和/或形成氢键，基于其生物学活性或化学结构而被分离。为了从亲和色谱材料回收特异性结合的说明书CN102470286A6/14页9多肽，加入竞争性配体或改变色谱条件，诸如缓冲液的PH值、极性或离子强度。“亲和色谱材料”是包含复合色谱功能基团的色谱材料，在所述复合色谱功能基团中不同的单一色谱功能基团组合在一起以便仅结合特定类型的多肽。此色谱材料特异性地结合

31、特定类型的多肽，这取决于其色谱功能基团的特异性。示例性的“亲和色谱材料”是“金属螯合色谱材料”诸如包含NIIINTA或CUIINTA的材料，用于结合包含六聚组氨酸标签的融合多肽或具有大量表面暴露的组氨酸、半胱氨酸和/或色氨酸残基的多肽，或“抗体结合色谱材料”诸如蛋白A，或“酶结合色谱材料”诸如包含酶底物类似物、酶辅因子或酶抑制剂作为色谱功能基团的色谱材料，或“凝集素结合色谱材料”诸如包含多糖、细胞表面受体、糖蛋白或完整细胞作为色谱功能基团的色谱材料。0053术语“金属螯合色谱”当在本申请中使用时表示采用“金属螯合色谱材料”的色谱法。金属螯合色谱基于金属离子和多肽的表面暴露的氨基酸侧链的电子给体

32、基团之间螯合物的形成，所述金属离子作为色谱功能基团与散装芯材结合，诸如CUII，NIII或ZNII；所述多肽尤其是具有包含咪唑的侧链和包含硫醇基的侧链。所述螯合物在那些侧链至少部分不被质子化的PH值下形成。通过PH值的改变，即，通过质子化从色谱材料回收结合的多肽。示例性的“金属螯合色谱材料”是HITRAPCHELATINGHPAMERSHAMPHARMACIABIOTECEUROPEGMBH，德国，或FRACTOGELEMDEMDCHEMICALSINC，USA。0054术语“离子交换色谱”当在本申请中使用时表示采用“离子交换色谱材料”的色谱法。术语“离子交换色谱材料”的涵义依赖于阳离子是否在

33、“阳离子交换色谱”或“阳离子交换色谱材料”中被交换，或阴离子是否在“阴离子交换色谱”或“阴离子交换色谱材料”中被交换。术语“离子交换色谱材料”当在本申请中使用时表示固定的高分子量固相，其携带共价结合的带电荷基团作为色谱功能基团。为了总体上的电荷中性，非共价结合的抗衡离子与共价结合的带电荷基团缔合。“离子交换色谱材料”具有以其非共价结合的抗衡离子交换周围溶液中类似的带电荷离子的能力。取决于其可交换的抗衡离子的电荷，“离子交换色谱材料”称为“阳离子交换色谱材料”或“阴离子交换色谱材料”。此外取决于带电荷基团的性质，“离子交换色谱材料”称为例如，具有磺酸基S，或羧甲基CM的阳离子交换色谱材料。取决于

34、带电荷基团的化学性质，“离子交换色谱材料”可以另外地分类为强或弱离子交换色谱材料，这取决于共价结合的带电荷取代基的强度。例如，强阳离子交换色谱材料具有磺酸基作为色谱功能基团，弱阳离子交换色谱材料具有羧酸基作为色谱功能基团。“阳离子交换色谱材料”，例如，可以不同的名称获自大量的公司，诸如例如，BIOREX，MACROPREPCM可获自BIORADLABORATORIES，HERCULES，CA，USA，弱阳离子交换剂WCX2可获自CIPHERGEN，弗里蒙特，CA，USA，DOWEXMAC3可获自陶氏化学公司DOWCHEMICALCOMPANY液体离析物，米德兰，MI，USA，MUSTANGC可

35、获自PALLCORPORATION，EASTHILLS，NY，USA，纤维素CM23，CM32，CM52，HYPERD，和PARTISPHERE可获自WHATMANPLC，BRENTFORD，UK，AMBERLITEIRC76，IRC747，IRC748，GT73可获自TOSOHBIOSCIENCEGMBH，斯图加特，德国，CM1500，CM3000可获自BIOCHROMLABS，TERREHAUTE，IN，USA，和CMSEPHAROSETMFASTFLOW可获自GEHEALTHCAREAMERSHAMBIOSCIENCESEUROPEGMBH，FREIBURG，德国。0055术语“羟磷灰石

36、色谱”当在本申请中使用时表示采用特定形式的磷酸钙作为色谱材料的色谱法。示例性的羟磷灰石色谱材料是BIOGELHT，BIOGELHTP，MACROPREP说明书CN102470286A7/14页10CERAMIC可获自BIORADLABORATORIES，I型、II型羟磷灰石，HAULTROGELSIGMAALDRICHCHEMICALCORP，USA，羟磷灰石快速流动和高分辨率HYDROXYAPATITEFASTFLOWANDHIGHRESOLUTIONCALBIOCHEM，或TSK凝胶HA1000TOSOHHAASCORP，USA。0056术语“结合和洗脱模式”及其语法等价物在本发明中使用时

37、表示色谱法的操作模式，其中包含待纯化多肽的溶液施加至色谱材料，由此待纯化的物质/多肽结合至色谱材料。结果待纯化的物质/多肽保留在色谱材料上，而非目的物质/多肽通过流过而被去除。之后在第二步骤中待纯化的物质/多肽从色谱材料上被洗脱并且因此随洗脱溶液从固定相中被回收。这不一定表示100的非目的物质/多肽被去除，但基本上100的非目的物质/多肽被去除，即，在一个实施方案中，至少50的非目的物质/多肽被去除，在另一个实施方案中至少75的非目的物质/多肽被去除，在进一步的实施方案中，至少90的非目的物质/多肽被去除，和在一个实施方案中，多于95的非目的物质/多肽被去除。0057术语“流通模式”及其语法等

38、价物当在本发明中使用时表示色谱法的操作模式，其中包含待纯化的物质/多肽的溶液被施加至色谱材料，由此待纯化的物质/多肽不结合至色谱材料。结果待纯化的物质/多肽以流通方式获得。还存在于溶液中的非目的物质/多肽结合至色谱材料并且从溶液中被去除。这不一定表示100的非目的物质/多肽从溶液中被去除，但基本上100的非目的物质/多肽被去除，即，在一个实施方案中，至少50的非目的物质/多肽从溶液中被去除，在另一个实施方案中，至少75的非目的物质/多肽从溶液中被去除，在进一步的实施方案中，至少90的非目的物质/多肽从溶液中被去除，且在一个实施方案中，多于95的非目的物质/多肽从溶液中被去除。0058术语“连续

39、洗脱”和“连续洗脱法”在本申请中可交换使用，它们表示其中例如，导致洗脱即，结合的物质/多肽从色谱材料的溶出的物质的浓度被连续升高或降低的色谱法，即，通过一系列小的步幅改变浓度，在一个实施方案中每个步幅不大于导致洗脱的物质的浓度的2，在另一个实施方案中不大于1。在此“连续洗脱”中，一种或多种条件，例如，色谱法的PH，离子强度，盐浓度，和/或流动，可以线性地改变，或指数地改变，或渐进地改变。在一个实施方案中，所述改变是线性的。0059术语“分阶洗脱”和“分阶洗脱法”在本申请中是可互换的，它们表示其中例如导致洗脱即，结合的物质/多肽从色谱材料的溶出的物质的浓度，即在一个实施方案中，立即从一个值/水平

40、升高或降低至下一个值/水平。在此“分阶洗脱”中，一种或多种条件，例如，色谱法的PH，离子强度，盐浓度，和/或流动，全部从第一例如，起始值立即改变为第二例如，最终值。在一个实施方案中，该步骤中的改变大于导致洗脱的物质浓度的5的变化，在另一个实施方案中大于10的变化。“分阶洗脱”表示条件递增地改变，即逐步的改变，与线性改变相反。在“分阶洗脱法”中，在每次递增后收集新的级分。在每次递增后保持条件直至该洗脱法中的下一步骤。0060如本文报道的一个方面是用于色谱柱中的色谱柱隔板。一个隔板的存在将色谱柱分成上色谱柱室和下色谱柱室，并且所述隔板在色谱柱内具有可变的位置，所述位置通过导向环提供，即，其可以根据

41、色谱材料的压力依赖性压缩和膨胀在色谱柱内垂直地滑动，并且所述隔板包埋在色谱材料中。0061在粗制多肽的柱色谱分离或纯化中，通常采用包括色谱材料和流动相的色谱柱。通过向流动相施加压力驱使流动相通过色谱柱并随后通过色谱材料。通过流动相的介导，说明书CN102470286A108/14页11压力也施加到色谱材料，由此建立了从色谱柱的入口至色谱柱的出口的压降。在色谱柱的出口处，压力降低至外部的大气压。因此，最高压力施加到色谱柱中色谱材料的上部部分。0062施加的压力通常一方面取决于色谱材料的粒度，还取决于流动相的粘度，因为设定恒流通过色谱柱，而不是恒压。一般来说，压力随着色谱材料粒度的减小而增加。在通

42、过色谱材料的恒定流速下，例如，在色谱材料的再生或清洗期间，流动相粘度的改变导致施加到色谱材料的压力的改变。通常色谱材料不是压力不敏感材料，即，其可被压缩并且在压缩后膨胀。因此，随着施加压力的增加，色谱材料被压缩并且色谱柱内的色谱材料高度，即，床高，减小。同样，随着施加压力的减小，色谱材料再次膨胀并且色谱柱内的色谱材料高度至多增大至施加压力之前的高度。色谱材料的此压缩和膨胀同时是整个色谱材料的宏观过程和色谱材料的单个粒子的微观过程。随着此压缩膨胀循环的次数增加，色谱材料的粒子粉碎成较小的粒子。随着色谱材料的粒子粒度的减小，色谱材料填料变得更加紧密，并且随之，同时维持通过色谱柱即，色谱材料的恒定液

43、相流动所需的压力增大。这样再次导致色谱材料粒子的进一步粉碎，再次导致压力增加，等等。0063色谱柱分离通常可以操作直达最大压力。当达到此压力上限时，必须整体更换色谱柱填料。0064已经发现如本文报道的由导向环和安装在其中的筛板组成的色谱柱隔板不会干扰色谱分离过程，而是使得能够仅可更换一部分色谱材料，例如，当达到最大操作压力时，无需更换整个色谱柱填料。即，根据本发明的色谱柱隔板容许更换上色谱柱室中的色谱材料而不干扰下色谱柱室中的色谱材料。因此，能够去除包含在包括如本文报道的色谱柱隔板的色谱柱中的全部色谱材料的有限部分，例如，在此部分已经塌陷或磨碎或填料质量下降时，而无需去除色谱材料的其他部分。色

44、谱材料的这种部分去除是有可能的，因为一方面隔板将色谱柱中的全部色谱材料分成不同的部分，并且在另一方面其防止下色谱柱室中装填的色谱材料受到去除上色谱柱室中色谱材料的干扰。因此，至少未暴露于最大压力变化并且因此没有被磨碎的那部分色谱材料可以进一步被使用而对分离效率没有负面的影响。但是，通过保留一部分色谱材料，可以实现商品成本的降低。0065如本文报道的色谱柱隔板包括导向环，在所述导向环中可以安装由任意惰性材料制成的筛板。“惰性材料”是不会干扰色谱分离过程的材料，即，在相同条件下或以其他方式采用相同条件，用包括一个或多个如本文报道的色谱柱隔板的色谱柱获得的色谱图与用未包括色谱柱隔板的色谱柱获得的色谱

45、图是一样的。此类惰性材料是例如，金属，尤其是不锈钢，聚硅氧烷，聚丙烯，聚乙烯，聚四氟乙烯，烧结物料或它们的组合，尤其是聚四氟乙烯涂覆的不锈钢。0066在一个实施方案中，如本文报道的色谱柱隔板可以包括单筛板或在另一个实施方案中包括上筛板和下筛板的组合。如果隔板包括一个筛板，则该筛板的孔径小于色谱材料的粒子的尺寸。在一个实施方案中，所述孔径为色谱材料粒子的平均直径的10以下以便防止筛板的孔被粉碎的色谱材料粒子阻塞。如果隔板包括两个筛板，则两个筛板可以具有相同的孔径或两个筛板可以具有不同的孔径。因为色谱材料粉碎成较小的粒子，在一个实施方案中，上筛板的孔径小于下筛板，在一个实施方案中，上筛板的孔径为色

46、谱材料粒子的平均直径的10以下。在一个实施方案中，色谱柱隔板的上筛板和/或下筛板为金属网。在进一步的实施方案中，上筛板的孔径小于下筛板的孔径。在一个实施方案中，色谱柱隔板说明书CN102470286A119/14页12或色谱柱隔板的下筛板的孔径为1M至20M，或1M至10M，或1M至5M。在另一个实施方案中，色谱柱隔板的上筛板的孔径为色谱柱隔板的下筛板孔径的5以下，或色谱柱隔板的上筛板的孔径为色谱柱隔板下筛板孔径的10，或色谱柱隔板上筛板的孔径为色谱柱隔板的下筛板孔径的20以下。在进一步的实施方案中，色谱柱隔板下筛板的孔径为20M或10M或5M，且上筛板的孔径为5M或1M。0067因此，根据本

47、发明的色谱柱隔板的使用允许下色谱柱室中的色谱材料的较长时间使用，以及同时用于减少色谱法的成本。0068在一个实施方案中，上色谱柱室为下色谱柱室体积的5至15，在另一个实施方案中为10。在另一个实施方案中，上色谱柱室为下色谱柱室体积的20至30，在一个实施方案中，为25。还在进一步的实施方案中，上色谱柱室的体积与下色谱柱室的体积相同。0069要指出的是如本文报道的色谱柱隔板不会使存在于色谱柱的入口和出口处的隔板或筛板无法使用。此外，在色谱材料内还放置额外的隔板。由于与流动相的流动方向垂直的柱色谱柱的横截面是环状的，因此筛板且同样隔板也具有环状的外形。隔板的高度小于色谱柱填料的总长度。在一个实施方

48、案中，隔板的高度为01CM至10CM，在另一个实施方案中为025CM至5CM，且在进一步的实施方案中，为05CM至2CM。隔板的高度为连接至上色谱柱室的筛板表面和连接至下色谱柱室的筛板表面之间的距离。如果隔板包括上筛板和下筛板，则两个单个筛板的总高度可以小于隔板的高度。在此实施方案中，隔板内存在的额外空间可以用于，例如，在筛板放置传感器以记录，例如，UV吸收，或压力，或经过隔板的流动相的电导率，或用于提供额外的阀以去除流动相或用于在色谱柱填料内的一个位置处添加流动相。如果隔板包括上筛板和下筛板，则在一个实施方案中两个筛板具有相同的高度。在另一个实施方案中，上筛板和下筛板具有不同的高度。0070

49、在一个实施方案中，色谱柱隔板的直径小于引入其的色谱柱的内径。0071在图1中，显示了示例性的色谱柱隔板。在图1A中，绘制了具有单筛板的隔板，其包括筛板1和配件2。在图1B中，显示了具有上筛板3和下筛板4以及配件2的隔板。在图1C中，显示了隔板的导向环的垂直横截面，其包括两个轴向对称的横截面区域5和6，其中每个轴向对称的横截面区域具有A锥形结构，其中所述锥形从所述导向环的外部向内部逐渐变细，和B用于安装筛板的凹口8，所述凹口8具有指向所述导向环内部的开口。0072如本文报道的色谱柱隔板除了筛板以外还包括配件或导向环两个术语可以交换使用用于当所述隔板置于色谱柱内时密封筛板的外缘和色谱柱壁之间的距离。在一个实施方案中，配件或导向环由柔性材料制成，所述柔性材料诸如橡胶，塑料，聚硅氧烷，聚四氟乙烯，聚乙烯，聚丙烯等。配件或导向环必须是柔性的以便调平一个色谱柱的内径的小差异或相同标称直径的不同色谱柱之间的小差异，以防止液相或色谱材料在筛板外部通过隔板。要指出的是如本文报道的隔板可以仅通过流动相而不通过色谱材料。即筛板的孔径小于色谱材料粒子的尺寸。0073配件或导向环具有环形形状，其横截面可以具有任何形状，只要其具有用于接纳筛板的矩形凹口。例如，在一个实施方案中，配件的横截面具有三角形的形状，在