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RNA 选择性杂交试剂及其应用
    【技术领域】
     本发明涉及以高选择性对 RNA 进行杂交的杂交试剂及其用途。背景技术 关于基因表达产物， 已知各种分析手段。可以列举例如 ： 利用原位杂交、 荧光共振 能量转移、 荧光消偏振等的方法。 在这些各种分析手段中， 使用用于检测特定碱基序列的探 针或引物等， 根据分析目的的不同， 对探针等要求的特性也不同。
     迄今为止， 关于用于检测特定碱基序列的探针等， 已经开发出进行了各种修饰 或改变的核苷衍生物。可以列举例如 ： 肽核酸 (PNA) 或桥式核酸 (Bridge-type Nucleic Acids， BNA)。另外， 也报道了各种开糖环式核苷酸衍生物 ( 非专利文献 1 ～ 7)。另外， 还 尝试了碱基上的扩环修饰 ( 非专利文献 8、 9)。
     非专利文献 1： P.E.Nielsen， M.Egholm， R.H.Berg， O.Buchardt， Science， 254， 497(1991)。
     非专利文献 2 ： S.Obika， D.Nanbu， Y.Hari， J.Andoh， K.Morio， T.Doi， T.Imanishi， Tetrahedron Lett.， 39， 5401(1998)。
     非专利文献 3 ： K.C.Schneider， S.A.Benner， J.Am.Chem.Soc.， 112， 453(1990)。
     非 专 利 文 献 4： K.Augustyns， A.V.Aerschot， A.V.Schepdael， C.Urbanke， P.Herdewijn， Nucleic Acids Res.， 19， 2589(1991)。
     非 专 利 文 献 5： M.Azymah， C.Chavis， M.Lucas， F.Morvan， J.-L.Imbach， Nucleosides & Nucleotides， 11， 1241(1992)。
     非专利文献 6： P.Nielsen， F.Kirpekar， J.Wengel， Nucleic Acids Res.， 22， 703(1994)。
     非专利文献 7 ： L.Zang， A.Peritz， E.Meggers， J.Am.Chem.Soc.， 127， 4174(2005)。
     非 专 利 文 献 8： N.Minakawa， N.Kojima， S.Hikishima， T.Sasaki， A.Kiyosue， N.Atsumi， Y.Ueno， A.Matsuda， J.Am.Chem.Soc.， 125， 9970(2003)。
     非专利文献 9 ： H.Liu， J.Gao， L.Maynard， Y.D.Saito， E.T.Kool， J.Am.Chem.Soc.， 126， 1102(2004)。
     发明内容
     基因表达的最初产物是作为转录产物的 RNA， 因此， 与通过 RT-PCR 检测 DNA 相比， 更优选以高于 DNA 的选择性对 RNA 进行杂交的方法。另外， 还期望通过与 RNA 杂交， 在细胞 内对 RNA 进行实时检测。
     PNA 的目的在于， 通过排除磷酸部位的电荷来减少静电排斥， 从而使 PNA-DNA 双链 形成比 DNA-DNA 双链更强的结合。另外， BNA 通过将核糖环的 2’ 位和 4’ 位交联而预先固 定为 N 型结构， 从而提高对目标 DNA 或 RNA 的结合亲和性。因此， PNA 和 BNA 中的任一种都 提高了对 DNA 和 RNA 两者的稳定性。即， 不仅对 RNA， 对 DNA 也同样显示高亲和性。另外，已知大多数各种开糖环式衍生物与 DNA 和 RNA 中任一种形成的杂交体的热稳定性均显著变 差。另外， 根据本发明人的研究可知， 扩环式核苷酸不与 RNA 形成稳定的杂交体。
     另外， 尚未提供有通过对 RNA 具有碱基特异性， 能够在基因表达水平上检测 SNP 的 程度的高碱基特异性的 RNA 用杂交试剂。
     因此， 本发明的一个目的在于， 提供对 RNA 具有高亲和性的核苷衍生物及其制造 方法。另外， 本发明的另一目的在于， 提供具有碱基识别能力的核苷衍生物及其制造方法。 本发明的另外一个目的在于， 提供这样的核苷衍生物的作为杂交试剂的用途。
     本发明人基于 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链的结构比较， 验证了开糖环对 DNA-RNA 双链稳定性的影响和对碱基特异性的影响， 并在对其结果进行详细研究的基础上， 发现了 使 DNA-RNA 双链稳定化并且具有碱基识别能力的核苷酸结构， 从而完成了本发明。根据本 发明提供以下的手段。
     根据本发明， 提供由下述式 (1) 和式 (2) 中任一个表示的核苷衍生物。
     ( 其中， 式 (1) 和式 (2) 中， Z 表示碳原子或氮原子， R1 表示氢原子或羟基保护基， R2 表示氢原子或磷酸二酯基 )
     所述核苷衍生物优选由式 (1) 表示且所述 Z 为氮原子。
     根据本发明， 提供由下述式 (3) 和式 (4) 表示的核苷衍生物。
     ( 其中， 式 (3) 和式 (4) 中， Z 表示碳原子或氮原子， W1 表示氢原子或羟基保护基， W2 表示羟基保护基、 亚磷酰胺基或者要结合或已结合到固相载体上的连接基团， R3 表示氢 原子或氨基保护基 )
     根据本发明， 提供一种寡核苷酸， 其具有由下述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示的一 种或两种以上的核苷酸衍生物单元。
     ( 其中， 式 (5) 和式 (6) 中， Z 表示碳原子或氮原子， X1 表示 O、 S 或 Se， X2 表示 SH( 或 S-)、 S 或 Se-、 碳原子数为 1 ～ 4 的烷基或吗啉基 )
     根据本发明， 提供一种 RNA 杂交试剂， 其具有由上述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示 的一种或两种以上的核苷酸衍生物单元。
     在本发明的杂交试剂中， 所述核苷酸衍生物单元优选由式 (5) 表示且所述 Z 为氮 原子。另外， 优选在末端具有所述核苷酸衍生物单元。另外， 优选具有能够形成茎 - 环结构 的碱基序列并且在所述环上具有所述核苷酸衍生物单元。
     根据本发明， 提供一种探针组， 用于检测 RNA 上的突变， 其中， 包含 ： 第一探针， 在 与所述突变位点相当的 5’ 末端或 3’ 末端具有由上述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示的一种 或两种以上的核苷酸衍生物单元 ； 和一种或两种以上的第二探针， 在与所述突变位点相当 的 3’ 末端或 5’ 末端具有脱氧核苷酸， 所述脱氧核苷酸具有与所述突变位点上可能存在的 碱基互补的碱基。
     根据本发明， 提供一种检测方法， 用于检测单核苷酸多态性， 其中， 包括以下步骤 ： 准备作为可能包含所述单核苷酸多态性的基因表达产物的 RNA 样品的步骤 ； 使用将选自上 述本发明的探针组中的一种第一探针和一种第二探针组合得到的一种或两种以上的组合， 使所述第一探针和所述第二探针与所述 RNA 样品以能够杂交的方式进行接触的步骤 ； 和对 所述 RNA 样品与所述第一探针和所述第二探针的杂交产物中的所述第一探针的荧光信号 进行检测的步骤。 附图说明
     图 1 是表示 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链的磷酸间距离和以此为基础的核苷改变的图。 图 2 是表示第一次改变后的核苷衍生物的 DNA-DNA 双链的热稳定性和碱基选择性 的评价结果的图。
     图 3 是表示第一次改变后的核苷衍生物的 DNA-RNA 双链的热稳定性和碱基选择性 的评价结果的图。
     图 4 是表示第一次改变后的核苷的 MOE 建模结果的图。
     图 5 是表示有关第二次改变后的核苷衍生物 ( 本发明的核苷衍生物 ) 的制作的 图。
     图 6 是 表 示 含 有 第 二 次 改 变 后 的 核 苷 衍 生 物 的 寡 核 苷 酸 的 DNA-RNA 双 链 和 DNA-DNA 双链的热稳定性 (Tm 值 ) 的图表。
     图 7 是表示 DNA-RNA 双链和 DNA-DNA 双链中的第二次改变后的核苷衍生物的碱基 选择性 (Tm 值 ) 的图表。
     图 8 是表示第二次改变后的核苷衍生物的荧光光谱的图。
     图 9 是表示本发明探针组的一例的图。
     图 10 是表示实施例 3 中的 F-3、 F-4 的热稳定性 ( 与 DNA 形成的双链 ) 的评价结 果的图。
     图 11 是表示实施例 3 中的 F-3、 F-4 的热稳定性 ( 与 RNA 形成的双链 ) 的评价结 果的图。
     图 12 通过测定 50％解链温度 Tm 来比较实施例 4 中呈两条链状态的 F-1 和互补 RNA 的热稳定性， 是表示解链曲线与 Tm 值的图。
     图 13 是表示在实施例 5 中使用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行荧光测定的激 发波长和荧光波长的图。
     图 14 是表示照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲线的 图。
     图 15 是表示在实施例 7 中照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光
     强度的曲线的图。
     图 16 是表示在实施例 8 中照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光 强度的曲线的图。 具体实施方式
     本发明涉及由下述式 (1) 和式 (2) 中任一个表示的新的核苷衍生物及其应用。
     ( 其中， 式 (1) 和式 (2) 中， Z 表示碳原子或氮原子， R1 表示氢原子或羟基保护基， R2 表示氢原子或磷酸二酯基 )
     本发明人为了解决上述问题， 进行了各种研究。首先， 着眼于 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链中相邻的磷酸间距离， 然后， 对能够减少磷酸间距离的核苷衍生物， 研究了双 链的热稳定性及其结构， 结果发现了同时满足热稳定性和碱基选择性这两者的结构。
     本发明人着眼于 RNA-RNA 双链 (A 型双链 ) 的磷酸间距离 ( 碱基间的距离 ) 比 DNA-DNA 双链 (B 型双链 ) 短的事实， 将磷酸骨架的磷酸之间从天然核苷的三个碳原子减少 至两个碳原子。另外， 为了提高碱基选择性， 本发明人将核酸的碱基部位设定为与天然核 苷不同的三环碱基。可知这样得到的核苷类似物对 RNA 具有选择性的高亲和性。并且， 以 400nm 为中心发出强荧光。 还发现通过使用具有这样的亲和性和荧光特性的核苷， 能够对与 耐药性有关的 P- 糖蛋白基因的基因多态性进行检测。
     本发明的核苷衍生物与现有型相比 RNA 选择性高， 因此能够有效用于反义法、 siRNA 法等以 RNA 为标靶的基因治疗或各种研究手法。 另外， 本发明的核苷衍生物其自身具 有荧光性， 因此对基因多态性等的检测极为有利。
     以下， 参照附图对本发明的概要进行说明。图 1 是表示 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链的磷酸间距离和以此为基础的核苷改变的图， 图 2 是表示第一次改变后的核苷衍生物 的 DNA-DNA 双链的热稳定性和碱基选择性的评价结果的图， 图 3 是表示改变后的核苷衍生 物的 DNA-RNA 双链的热稳定性和碱基选择性的评价结果的图， 图 4 是表示改变后的核苷的 MOE 建模结果的图， 图 5 是表示关于第二次改变后的核苷衍生物 ( 本发明的核苷衍生物 ) 的
     制作的图。另外， 图 6 是表示含有第二次改变后的核苷衍生物的寡核苷酸的 DNA-RNA 双链 和 DNA-DNA 双链的热稳定性 (Tm 值 ) 的图表， 图 7 是表示 DNA-RNA 双链和 DNA-DNA 双链中 的第二次改变后的核苷衍生物的碱基选择性 (Tm 值 ) 的图表， 图 8 是表示第二次改变后的 核苷衍生物的荧光光谱的图。
     另外， MOE 为基于分子力学方法的程序， 图 4 的建模结果使用 MMFF94x 力场运行程 序而得到。
     如图 1 所示， 对两种双链结构计算磷酸间的平均距离可知， DNA-DNA 双链为 6.7 埃， DNA-RNA 双链为 5.7 埃。 即可知， DNA-RNA 双链中的磷酸间距离比 DNA-DNA 双链的短。 因此， 本发明人着眼于磷酸间距离的差异， 进行了如下设计 ( 第一次改变的核苷衍生物的设计 ) ： 使用相邻的磷酸间为两个碳原子 ( 通常的核苷为三个碳原子 ) 的丙基腺嘌呤和丁基腺嘌呤 作为碱基类似物以缩小磷酸间的距离， 并合成了含有其的寡核苷酸， 对其 RNA 选择性进行 了验证。 验证通过以下方式进行 ： 通过 Tm 值比较 DNA-DNA 和 DNA-RNA 两种双链的热稳定性， 并且通过 Tm 值比较对 RNA 中四种碱基的碱基选择性。结果如图 2、 图 3 所示。
     如图 2 所示可知， 丁基型衍生物中 DNA-DNA 和 DNA-RNA 两种双链均具有热不稳定 性， 与此相对， 丙基型衍生物中与 DNA 形成的双链具有热不稳定性， 但是与 RNA 形成的双链 热不稳定性稍好。另外， 如图 3 所示可知， 与未修饰的情况 ( 各图上部的四个条 ) 相比， 经 改变得到的类似物 ( 各图中央部的四个条和下部的四个条 ) 的碱基选择性低。 因此， 对引入这两种类似物的 DNA-RNA 双链进行 MOE 建模， 如图 4 所示可知， 丁基 型 ( 图 4 右侧 ) 衍生物中与氢键有关的原子间距离为能够形成氢键的 3 埃以内， 与此相对， 丙基型 ( 图 4 左侧 ) 衍生物中为 3 埃以上， 对于形成氢键是不足够的长度。本发明人推测， 丁基型衍生物中虽然到互补碱基的距离足够， 但是侧链的灵活度高， 从而使双链具有热不 稳定性， 丙基型衍生物中侧链的灵活度更低， 可以保持高于丁基型的热稳定性， 但是到互补 碱基的距离不充分， 因此碱基选择性下降。
     因此， 本发明人为确保到互补碱基的距离， 设计了在丙基型类似物的碱基部位引 入吡啶环的这些衍生物作为二次核苷衍生物， 并合成了 DNA 合成用的 amidite( アミダイ ト ) 化合物和寡核苷酸 ( 参照图 5)。如图 5 所示， 这些衍生物均为三环化合物。
     如图 6 所示可知， 含有第二次改变后的核苷衍生物的寡核苷酸 (DNA) 与 DNA 形成 双链时不稳定， 与此相对， 与 RNA 形成双链时当衍生物数量增加时双链的热稳定性反而上 升。 另外， 如图 7 所示可知， 含有第二次改变后的核苷衍生物的寡核苷酸 (DNA)， 当 DNA 为互 补链时选择性低， 与此相对， 当 RNA 为互补链时， 由于具有三环性， 因此碱基选择性比第一 次改变后的核苷衍生物提高。
     另外， 如图 8 所示可知， 第二次改变后的核苷衍生物具有以 400nm 为中心的强荧 光， 可以直接对杂交产物进行荧光检测。
     从以上可知， 本发明可以提供一种核苷衍生物和包含该核苷衍生物的寡核苷酸， 所述核苷衍生物为减小寡核苷酸中相邻的磷酸间的距离而具有用丙基代替脱氧核糖的开 糖环结构， 为确保在与互补碱基之间能够形成氢键的距离而具有扩环式碱基结构， 因此， 对 RNA 双链具有稳定性和碱基识别性。另外， 已明确这样改变后的核苷衍生物具有荧光， 因此 还能够提供单核苷酸识别性。
     具体实施方式
     以下， 对本发明的各种实施方式进行详细说明。
     以下， 对作为本发明实施方式的核苷衍生物、 寡核苷酸的制造方法和它们使用的 化合物、 它们的用途进行详细说明。另外， 本发明涉及的本领域技术人员的技术范围内的 分子生物学和核酸化学的现有技术已在文献中进行了说明。例如可以参考 Sambrook 等的 《分子克隆 ： 实验室手册》 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual)， 冷泉港实验室， 冷 泉港， 纽约， 1989 年 ； Gait， M.J.， 《寡核苷酸合成》 (OligonucleotideSynthesis)， 1984 年 编著 ； Hames， B.D. 和 Higgins， S.J.， 《核酸杂交》 (Nucleic Acid Hybridization)， 1984 年 编著 ； 和一系列的 《酶学方法》 (Methods in Enzymology)， 学术出版社 (Academic Press， Inc.)。
     ( 核苷衍生物 )
     本发明的核苷衍生物为式 (1) 或式 (2) 表示化合物。这些化合物中， Z 表示碳原 子 (CH) 或氮原子。
     另外， 这些化合物中的环 A 的成环碳原子上键合的氢原子可以是未取代的， 也可 以是经取代的。作为取代基， 优选碳原子数为 1 ～ 4 的链状烷基。即， 可以列举 ： 甲基、 乙 基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基和叔丁基。考虑空间位阻等时， 有时可以优选使用甲基 和乙基。另外， 取代基的数量没有特别限定， 但在存在空间位阻等问题的情况下， 优选为约 1 个或 2 个。 R1 可以为氢原子或羟基保护基。羟基保护基可以利用公知的基团。具体示例可以 列举与后段中说明的同样的基团。另外， R2 可以为氢原子或磷酸二酯基 (PO3)。作为磷酸二 酯基没有特别限定。代替磷原子上以双键键合的一种氧原子， 可以为 O、 S 或 Se， 代替其它 羟基 ( 氧离子 )， 可以为 SH( 或 S )、 S 或 Se 、 碳原子数为 1 ～ 4 的烷基或吗啉基。作为由这 1 2 些 X 和 X 的组合得到的各种磷酸二酯基， 可以举出例如下式 (7) 的各种基团 ( 其中不包括 碳原子上连接的氧原子 )。
     由式 (1) 表示的核苷衍生物可以作为腺苷类似物使用。另外， 由式 (2) 表示的核 苷衍生物可以作为鸟苷类似物使用。另外， R2 上具有磷酸二酯键基团时， 由式 (1) 和式 (2) 表示的核苷衍生物为核苷酸衍生物。
     另外， 本发明的核苷衍生物可以发出荧光。即， 照射约 330nm 的激发波长的光时， 可以发出在 400nm 附近有峰的荧光。因此， 可以容易地检测与特定的 RNA 或特定的碱基等 的杂交。
     根据 P.A.Harris 和 W.Pendergast， 《杂环化学杂志》 (J.HeterocyclicChem.)， 33， 319(1996) 的记载， 本核苷衍生物可以通过在嘌呤碱基上进行扩环来合成。例如， 由式 (1) 表示的化合物可以通过以下的方案 1 合成。
     ( 适于寡核苷酸合成的核苷衍生物 )
     作为适于寡核苷酸合成的核苷衍生物， 可以列举由以下的式 (3) 和式 (4) 表示的 化合物。另外， 式 (3) 和式 (4) 中的 Z 和 A 环与式 (1) 和式 (2) 中的 Z 具有相同含义。
     式 (3) 和式 (4) 中， W1 可以表示氢原子或羟基保护基。作为羟基保护基， 只要是保 护羟基使其避免不必要反应的基团即可。 作为这样的羟基保护基， 没有特别限定， 可以使用 现有公知的各种羟基保护基。 本发明的优选的保护基为芴甲氧羰基 (FMOC 基 )、 二甲氧基三 苯甲基 (DMT 基 )、 叔丁基二甲基硅烷基 (TBDMS 基 )、 单甲氧基三苯甲基、 三氟乙酰基、 乙酰 丙酯 ( レブリニル ) 基或甲硅烷基。优选的保护基为三苯甲基， 例如从二甲氧基三苯甲基 (DMT) 和叔丁基二甲基硅烷基 (TBDMS 基 ) 中选择。
     另外， W2 表示羟基保护基、 亚磷酰胺基或者要结合或已结合到固相载体上的连接 基团。 W2 为亚磷酰胺基的化合物 (amidite 化合物 ) 作为亚磷酰胺法的亚磷酰胺试剂使用， 可以用于合成寡核苷酸。另外， 本发明中， 亚磷酰胺基可以由下式 (8) 表示。
     ( 式 (8) 中， 各 Y1 相互独立， 可以相同也可以不同， 表示支链状或直链状的碳原子 2 数为 1 ～ 5 的烷基， Y 表示支链状或直链状的碳原子数为 1 ～ 5 的烷基或可以进行取代的 烷氧基 )
     上述式 (8) 中， Y1 没有特别限定， 可以优选列举异丙基， 另外， 作为 Y2， 可以列 举： -OCH3、 -OEtCN、 -OCH2CHCH2 等。
     另外， 对于式 (3) 和式 (4) 中 W2 为要结合到固相载体上的连接基团的化合物而言， 通过使该连接基团与氨基等固相载体上的预定官能团结合， 可以保持在固相载体上。 并且， 对于式 (3) 和式 (4) 中 W2 为已结合到固相载体上的连接基团的化合物而言， 通过连接基团 将本发明的核苷衍生物结合在固相载体上， 因此能够作为各种核酸固相合成法的起始材料 使用。通过使用该起始原料， 可以制造具有式 (5) 或式 (6) 表示的单元的寡核苷酸。
     在 此， 固 相 载 体 通 常 使 用 高 分 子 载 体， 可以列举例如： CPG( 可 控 多 孔 玻 璃 (controlled pored glass)) 或 HCP( 高 交 联 聚 苯 乙 烯 (highlycross-linked polystyrene))、 一定种类的凝胶等。另外， 固相载体上可以具有适当的间隔物 (spacer)。 连接基团是连接固相载体和本化合物的连接物。作为这样的连接基团， 可以使用公知的琥 珀酸酯连接物、 草酸酯连接物、 硅烷二基 ( シランジイル ) 连接物、 甲硅烷基连接物等。
     另外， 式 (3) 中的 R3 可以为氢原子或氨基保护基。来自腺嘌呤碱基的伯氨基根据 需要可以用适当的保护基保护。这样的保护方法和保护基是本领域技术人员公知的。作为 氨基保护基， 可以列举例如 ： 苯甲酰基、 乙酰基、 苯氧基乙酰基。
     这样的式 (3) 或式 (4) 表示的核苷衍生物可以从式 (1) 或式 (2) 表示的核苷衍生 物通过已知的方法合成。例如， 式 (3) 表示的各种核苷衍生物可以通过以下的方案 2 合成。
     ( 寡核苷酸 )
     本发明的寡核苷酸可以具有下述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示的、 一种或两种以 上的核苷酸衍生物单元。式 (5) 和式 (6) 中的 Z 与式 (1) 等中的 Z 具有相同的含义， A环
     也与式 (1) 等中的 A 环具有相同的含义。
     式 (5) 和式 (6) 中， X1 可以为 O、 S 或 Se， X2 可以为 SH( 或 S-)、 S 或 Se-、 碳原子数 为 1 ～ 4 的烷基或吗啉基。作为这样的磷酸二酯基， 可以列举式 (7) 所述的各种基团。
     本发明的寡核苷酸中的上述核苷酸衍生物单元可以是一种以上也可以是两种以 上。另外， 可以是一个也可以是多个， 也可以是全部。本发明的寡核苷酸中所含的核苷酸衍 生物单元可以根据寡核苷酸的用途等来确定。
     另外， 寡核苷酸中的核苷酸衍生物单元的位置也没有特别限定。可以在 5’ 末端、 3’ 末端和这些以外的部分的任意一个位置上具有。另外， 本发明的寡核苷酸中， 5’ 末端上 可以结合有羟基， 也可以结合有磷酸基 (PO4)。另外， 同样地， 本寡核苷酸的 3’ 末端上可以 结合有羟基， 也可以结合有磷酸基 (PO4)。其它的 5’ 末端和 3’ 末端可以根据需要分别采用 适当的结构。
     本发明的寡核苷酸， 除本发明的核苷酸单元以外， 可以具有核糖核苷酸和 / 或脱 氧核糖核苷酸。本发明的寡核苷酸， 可以是除本发明的核苷酸单元以外仅包含脱氧核糖核 苷酸的寡核苷酸， 也可以是除本发明的核苷酸单元以外仅包含核糖核苷酸的寡核苷酸， 另 外， 也可以是除本发明的核苷酸单元以外同时包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的寡核苷 酸。由于 RNA-DNA 双链和 RNA-RNA 双链均为 A 型的双链结构， 因此作为 RNA 的本发明的寡 核苷酸也可以与互补的 RNA 链形成稳定的双链。
     寡核苷酸是指以核苷酸为单体单元且具有多个该单体单元的多聚物， 寡核苷酸通 常包括约数个以上到约 100 个以下的核苷酸的多聚物。本发明的寡核苷酸可以设定为与用 途相应的长度， 考虑到寡核苷酸的合成时， 优选为 10 个以上、 35 个以下。另外， 在反义寡核 苷酸的情况下， 可以约为 10 个以上、 30 个以下， 另外， 在 siRNA 的情况下， B 和 C 的总链长优 选为 15 个以上、 35 个以下， 更优选为 30 个以下。在作为引物的情况下， 优选为 10 个以上、
     30 个以下， 在作为探针的情况下， 优选为 10 个以上、 30 个以下， 在作为分子信标的情况下， 优选为 15 个以上、 40 个以下。
     另外， 根据本发明， 当然也提供具有本发明的核苷酸衍生物单元的多核苷酸。
     另外， 也可以具有本发明的核苷酸单元以外的进行了改变的核苷酸。进行了改变 的核苷酸是指核苷酸的各种部分， 即碱基、 糖部分和磷酸酯部分进行了某种化学修饰。
     本发明的寡核苷酸可以通过利用作为所述核苷衍生物的一种的酰胺体的现有公 知的核酸合成法来进行合成。
     本发明的寡核苷酸具有本发明的核苷酸单元， 因此可以与 RNA 选择性地进行稳定 的杂交， 并且具有碱基识别性， 因此可以检测特定序列的 RNA。而且， 其自身具有荧光性， 因 此也可以检测单核苷酸多态性等基因突变。
     另外， 由于高选择性地与 RNA 进行杂交， 因此特别可以优选用于细胞内的 RNA 检 测、 细胞内基因表达的实时检测。 另外， 将这些寡核苷酸保持在芯片或微珠等固相载体等上 而得到的材料， 可以作为检验装置、 诊断装置或这些装置的一部分来使用。
     本发明的寡核苷酸可以采取各种基因表达调控剂的形式。 即， 可以用于反义基因、 反义子、 适配子、 miRNA 和核酶。另外， 本发明的寡核苷酸也可以用于 siRNA、 shRNA、 反义子、 核酶和适配子。
     本发明的寡核苷酸可以用于探针和引物。 探针是指通过设计或选择而具有对靶核 酸特异性的规定的碱基序列， 为了在预定的严格度下与靶核酸杂交而获得的寡核苷酸。从 上述可知， 本发明的寡核苷酸探针可以特别优选用于细胞内的 RNA 检测、 尤其是实时检测。
     本发明的寡核苷酸含有的核苷酸衍生物单元， 其自身会发出荧光， 因此， 可以提供 利用该荧光的用于检测 RNA 上的突变的探针组。该探针组可以由具有本发明的核苷酸衍生 物单元的第一探针和不具有本发明的核苷酸衍生物单元的第二探针构成。 第一探针在与所 述突变位点对应的位置上具有本发明的核苷酸衍生物单元。另外， 这样的核苷酸衍生物单 元位于探针的 3’ 末端或 5’ 末端。例如， 如图 9 所示， 使第一探针杂交到靶链 ( 图 9 所示的 示例中为 RNA) 的 3’ 侧时， 要在 3’ 末端具有本发明的核苷酸衍生物单元。另外， 核苷酸衍 生物单元可以具有与要检测的突变位点上可能存在的碱基对应 ( 互补 ) 的碱基类似物， 也 可以不具有。第一探针可以是一种， 也可以是两种以上。根据与要检测的突变位点对应的 位置上具有的本发明的核苷酸衍生物单元的种类来决定第一探针的种类 ( 数量 )。
     另外， 第二探针具有脱氧核苷酸， 所述脱氧核苷酸具有与所述突变位点上可能存 在的碱基对应 ( 互补 ) 的碱基。另外， 该突变对应核苷酸位于探针的 3’ 末端或 5’ 末端。例 如， 如图 9 所示， 使第二探针杂交到靶链 (RNA) 的 5’ 侧时， 要在 5’ 末端具有合适的脱氧核 苷酸。第二探针可以是一种， 也可以是两种以上。根据与要检测的突变位点对应的位置上 具有的脱氧核苷酸的种类来决定第二探针的种类 ( 数量 )。
     如以上所述， 通过制作在与要检测的突变位点对应的位置上具有本发明的核苷酸 衍生物单元的探针、 和具有与在同一突变位点上可能存在的碱基互补的普通的脱氧核苷 酸单元的探针， 可以从第一探针对突变位点的匹配 / 错配和第二探针对突变位点的匹配 / 错配来识别突变位点的碱基。例如， 第一探针和第二探针都与突变位点匹配时， 第一探针 和第二探针在突变位点上发生竞争， 因此第一探针的核苷酸单元的至少一部分发生翻转 (flip-out)， 从而可以发出荧光。另外， 第一探针错配而第二探针匹配时， 第一探针的核苷酸单元从双链上发生更大的翻转， 从而可以发出强度更高的荧光。
     为使与突变位点对应的末端上具有所有可能存在的碱基， 准备多个第二探针， 由 此， 即使第一探针为一种， 也可以检测到全部的碱基突变。 这样的探针组可以特别优选用于 检测单核苷酸多态性。
     另外， 根据本发明， 还提供使用这样的探针组的单核苷酸多态性的检测方法。即， 该方法可以包括以下步骤 ： 准备作为可能包含单核苷酸多态性的基因表达产物的 RNA 样品 的步骤 ； 使用将选自所述探针组中的一种第一探针和一种第二探针组合得到的全部组合， 使第一探针和第二探针与 RNA 样品以能够杂交的方式进行接触的步骤 ； 和对所述 RNA 样品 与所述第一探针和所述第二探针的杂交产物中的所述第一探针的荧光信号进行检测的步 骤。
     RNA 样品可以通过公知的方法从各种被测物进行制备。 作为被测物， 可以是包括血 液在内的各种体液或组织等， 没有特别限定。
     RNA 样品与第一探针和第二探针的接触方式 ( 顺序 ) 没有特别限定。可以是同时 使第一探针和第二探针与 RNA 样品接触的方式， 也可以使第一探针接触后再使第二探针接 触。另外， 也可以使第二探针接触后再使第一探针接触。
     杂交的条件根据 RNA 样品和探针的种类进行适当确定。另外， 该检测方法中， 也可 以使用将第一探针和第二探针中的至少一部分固定在固相载体上的阵列。
     本发明的寡核苷酸也可以是具有茎 - 环结构的分子信标式的探针。即， 也可以是 以能够形成茎和环的方式设计碱基序列的探针。通过在该环中具有本发明的核苷酸单元， 碱基类似物部分从环中翻转， 容易发出荧光， 从而可以构建在非杂交时发出荧光、 在杂交时 荧光消失的探针。通过这样的探针， 可以容易地对杂交进行检测。
     从上述可知， 本发明的寡核苷酸通过以作为 siRNA 或反义子等发挥作用的方式进 行构建， 可以用作基因表达抑制剂。 另外， 本发明的寡核苷酸可以用作人类和非人类动物的 疾病的预防、 治疗用医药组合物的有效成分。例如， 对于伴随基因表达而产生的疾病， 作为 基因表达抑制剂而构建的本发明的寡核苷酸衍生物对预防和治疗这样的疾病有效。
     另外， 本发明的寡核苷酸， 利用其对 RNA 杂交的功能， 可以用作探针、 引物等杂交 试剂 ( 典型地为检验试剂或诊断试剂等 )。 由于以高选择性与 RNA 进行杂交， 因此可以特别 优选用于细胞内的 RNA 检测、 细胞内基因表达的实时检测。另外， 将这些寡核苷酸保持在芯 片或微珠等固相载体等上而得到的材料， 可以作为检验装置、 诊断装置或这些装置的一部 分使用。 另外， 这样的检验试剂或诊断试剂可以作为与其它试剂、 诊断试剂或装置等组合而 成的检验用或诊断用试剂盒来使用。
     本发明的寡核苷酸还可以以基因表达调控剂的形式用于人类和非人类动物细胞 中的基因表达抑制方法。另外， 本发明的寡核苷酸还可以以杂交试剂的形式用于从人类和 非人类动物取得的核酸样品中的特定基因或特定突变的检测方法。 实施例
     以下列举实施例具体地说明本发明， 但是本发明不限于这些实施例。 实施例 1 本实施例中通过以下的方案 3 合成三环性核苷类似物。另外， 用于取得上述方案 3 中的各个生成物 (1) ～ (10) 的试验条件如下所述。
     试剂与条件 ： (1) 丙二腈、 2- 丙醇、 90℃、 78％ ； (2) 对甲苯磺酰氯、 DMAP、 CH2Cl、 室 温、 83 ％ ； (3)K2CO3、 DMF、 60 ℃、 51 ％ ； (4)(i) 原甲酸三乙酯、 100 ℃ ； (ii)NH3/MeOH、 110 ℃、 65％ ； (5)80％的 CH3COOH、 60℃ ； (6)TBDMS、 咪唑、 DMF、 78％ ； (7) 苯甲酰氯、 吡啶、 87％ ； (8)
     TBAF、 THF、 77％ ； (9)4-4’ - 二甲氧基三苯甲基氯、 吡啶、 44％ ； (10)2- 氰基乙基二异丙基氯 代亚磷酰胺 (i-Pr2NP(Cl)OCE)、 Huning 碱、 CH2Cl2、 室温、 47％。
     (1)5- 氨基咪唑并 [4， 5-b] 嘧啶 -6- 甲腈的合成
     将 1.0g(8.3mmol) 嘌呤溶解在 60mL 2- 丙醇中， 加入 2.6g(39mmol， 4.7 当量 ) 丙 二腈， 在氩气气氛下、 在油浴中保持 90℃， 同时进行搅拌。( 黄色透明 ) 搅拌 99 小时后， 通 过 TLC 确认原料消失， 并冷却至室温。 ( 红葡萄酒色 ) 冷却至室温后， 溶液中出现结晶物， 因 此用冰水冷却的 2- 丙醇冲洗该结晶， 同时进行抽滤， 从而得到结晶物 (1)( 亮绿色 )。将得 到的结晶用真空泵干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 1.5g、 9.75mmol， 收率 58％ )。 1
     H NMR(400MHz， DMSO)δ ； 6.58(2H， s， 6-CH 和 8-CH)、 8.17(3H， s， 2-NH2， 9-NH)(2)2， 2- 二甲基 -4-( 对甲苯磺酰氢甲基 )-1， 3- 二氧戊环的合成
     向 1.3g、 1.2ml(10mmol) 的二甲基 -1， 3- 二氧戊环 -4- 甲醇中加入 3.7g(3.0mmol， 3.0 当 量 ) 干 燥 过 1 小 时 的 4- 二 甲 基 氨 基 吡 啶， 并 用 100mLCH2Cl2 溶 解。 之 后， 加入 2.3g(12mmol， 1.2 当量 ) 对甲苯磺酰氯后， 在初始的 30 分钟内浸于冷水中， 同时在室温、 氩 气气氛下进行搅拌 ( 无色透明 )。搅拌 18 小时后， 通过 TLC 确认原料消失， 用分液漏斗 ( 有 机溶剂 ： CDCl3) 分液， 并将油层用无水硫酸钠脱水。1 小时后， 进行棉塞过滤， 并用蒸发器浓 缩， 将所得物质通过硅胶柱层析 (CHCl3 → CHCl3 ∶ MeOH ＝ 100 ～ 10 ∶ 1) 分离出目标物， 得到油状液体 (2)( 浅黄色透明至无色透明 )。将得到的液体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产 量 1.85g、 8.3mmol， 收率 83％ )。 1
     H NMR(400MHz ， CDCl 3) δ ； 1.31(3H ， s， 2-CH 3) ， 1.34(3H ， d， 2-CH 3) ， 2.46(3H ， s， 4- 苯 甲 基 )， 3.72-3.82(1H， q， 4- 磺 酰 甲 基 )， 3.95-4.06(3H， m， 4 磺 酰 甲 基 )， 4.22-4.31(1H， m， 4-CH)， 7.27-7.37(2H， d， 5-CH2)， 7.76-7.84(2H， d， 4-1’ -CH2)
     (3)9-(4’ -4’ - 二甲基 -3’ ， 5’ - 二氧戊环 - 甲基 )-1- 甲腈 -2- 氨基嘌呤的合成
     向 0.7g(4.4mmol)5- 氨基咪唑并 [4， 5-b] 嘧啶 -6- 甲腈中加入 0.73g(5.3mmol， 1.2 当量 )K2CO3， 再干燥 1 小时。干燥后， 将 1.17g(5.3mmol， 1.2 当量 )2， 2- 二甲基 -4-( 对 甲苯磺酰氧甲基 )-1， 3- 二氧戊环溶解在 40ml DMF 中， 并将该溶液加入到之前的 5- 氨基咪 唑并 [4， 5-b] 嘧啶 -6- 甲腈和 K2CO3 的烧瓶中， 在氩气气氛下、 在油浴中保持 60℃， 同时进 行搅拌。( 浅红色 ) 搅拌 70 小时后， 确认原料消失， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： 乙酸乙酯 ) 分 液， 将油层用无水硫酸钠脱水。1 小时后， 进行棉塞过滤， 并用蒸发器浓缩， 将所得物质通过 硅胶柱层析 (CHCl3 → CHCl3 ∶ MeOH ＝ 100 ∶ 1) 分离出目标物， 得到白色固体 (3)( 产量 0.25g、 0.92mmol， 收率 21％ )。 1
     HNMR(400MHz， DMSO)δ ； 1.33(3H， s， 9-4’ -CH3)、 1.38(3H， s， 9-4’ -CH3)1.61(1H， s， 9-NH)、 3.69-3.73(2H， q， 9-6’ -CH2)、 4.08-4.12(2H， q， 9-6’ -CH2)、 4.16-4.21(2H， q， 9-1’ -CH2)、 4.29-4.34(2H， q， 9-1’ -CH2)、 4.43-4.49(1H， m， 9-2’ -CH)、 5.11(2H， s， 2-NH2)、 7.97(1H， s， 6-CH)、 8.07(1H， s， 8-CH)
     C13H15N5O2(MH+) 的 HRMS(FAB) 计算值 ： 273.12258， 测定值 ： 273.12291
     (4)13-(4’ -4’ - 二甲基 -3’ ， 5’ - 二氧戊环 - 甲基 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉的合成
     向 0.27g(1.0mmol)13-(4’ -4’ - 二甲基 -3’ ， 5’ - 二氧戊环 - 甲基 )-6- 氨基咪唑 并喹唑啉中加入 8mL 原甲酸三乙酯， 在油浴中保持 100℃， 同时进行搅拌 ( 无色透明 )。搅 拌 52 小时后， 通过 TLC 确认原料消失时物质开始发生破坏， 因此立即停止搅拌， 用蒸发器 减压除去溶剂进行浓缩 ( 深黄色 )。将浓缩物溶解于氨甲醇溶液 (NH3/MeOH) 中， 并转移至 100mL 的钢容器内， 在油浴中保持 110℃的同时进行搅拌。搅拌 121 小时后， 通过 TLC 确认 原料消失， 并用水流式蒸发器进行浓缩。将浓缩后的物质溶解于 (CHCl3 ∶ MeOH ＝ 5 ∶ 1) 中， 并加入二氧化硅， 通过用蒸发器浓缩使物质吸附在二氧化硅上。吸附后， 通过硅胶柱层 析 (CHCl3 ∶ MeOH ＝ 15 ∶ 1 → 10 ∶ 1) 分离出目标物， 得到深黄色固体 (4)。将得到的固 体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 0.15g、 0.499mmol， 收率 65.0％ )。 1
     HNMR(400MHz ， DMSO) δ ； 1.22(3H ， s， 12-4’ -CH 3) 、 1.27(3H ， s， 12-4’ -CH 3) 、 3.80-3.83(2H， q， 12-1’ -CH2)、 4.36-4.49(2H， q， 12-6’ -CH2)、 4.55-4.58(1H， m， 12-2’ -CH)、 7.98(2H， s， 2-NH2)、 8.47(1H， s， 2-CH)、 8.63(1H， s， 7-CH)、 9.03(1H， s， 11-CH)(5)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉的合成
     向 0.3g(1.0mmol)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉中加入 5mL80％稀释 乙酸， 在油浴中保持 60℃， 同时进行搅拌。 搅拌开始 9 小时后， 通过 TLC 确认反应进行后， 用 水流式蒸发器减压除去乙酸， 由此得到黄色固体 (5)。将得到的固体干燥过夜， 进行 NMR 测 定。 1
     HNMR(400MHz， DMSO)δ ； 1.22(1H， s， 13-2’ -1” -OH)、 1.27(1H， s， 13-3’ -1” -OH)、 3.93(2H， s， 13-1’ -CH2)、 4.11-4.17(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.45-4.50(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.88(2H， t， 12-3’ -CH2)、 5.13-5.15(1H， s， 13-2’ -CH)、 7.97(2H， s， 6-NH2)、 8.47(1H， s， 2-CH)、 8.59(1H， s， 7-CH)、 9.01(1H， s， 12-CH)
     C11H12N6O2·1/5H2O 元素分析计算值 ： C， 50.29 ； H， 4.74 ； N， 30.87.
     测定值 ： C， 50.37 ； H， 4.87 ； N， 30.89.
     (6)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉的合成
     向 260mg(1.0mmol)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉中 加入 10ml DMF、 544mg(8.0mmol， 8.0 当量 ) 咪唑、 600mg(4.0mmol， 4.0 当量 ) 叔丁基二甲基 氯硅烷， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌 ( 深黄色透明 )。 搅拌开始 18 小时后， 通过 TLC 确认 目标物消失， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： 乙酸乙酯 ) 分液 (NaHCO3×3 →饱和食盐水 ×1) 后， 用 无水硫酸钠脱水 1 小时。 脱水后， 用蒸发器浓缩， 通过硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 20 ∶ 1 ～ 10 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到白色固体 (6)。用真 空泵将得到的固体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 380mg、 0.78mmol， 收率 77.7％ )。 1
     HNMR(400MHz ，DMSO) δ ； -0.71(3H ，s ， 13-3’-2”-CH 3 ) 、-0.23(3H ，s ， 13-2’ -2” -CH3)、 -0.01(6H， s， 13-2’ -2” ， 3’ -2” -2CH3)、 0.57(9H， s， 13-3’ -3” -3CH3)、 0.82(9H， s， 13-2’ -3’ ‘-3CH3)、 3.57(2H， s， 13-1’ -CH2)、 3.58(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.16(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.19(2H， t， 12-3’ -CH2)、 4.38-4.40(1H， w， 13-2’ -CH)、 7.92(2H， s， 6-NH2)、 8.39(1H， s， 2-CH)、 8.50(1H， s， 7-CH)8.93(1H， s， 12-CH) +
     C23H40N6O2Si2(MH ) 的 HRMS(FAB) 计算值 ： 488.27514， 测定值 ： 488.27596
     (7)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉 的合成
     向 530mg(1.1mmol)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并 [1’ -苯 甲酰基 ] 喹唑啉中， 加入 20ml 吡啶、 0.11ml、 0.15mg(1.1mmol， 1.0 当量 ) 苯甲酰氯， 在氩 气气氛下、 在室温进行搅拌 ( 黄绿色透明 )。搅拌开始 2 小时后， 由 TLC 的结果可知苯甲 酰氯有不足的倾向， 因此追加 0.11ml、 0.15mg(1.1mmol， 1.0 当量 )。搅拌开始 7 小时后， 通过 TLC 确认目标物消失， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： CHCl3) 分液 (NaHCO3×2 →饱和食盐 水 ×1) 后， 用无水硫酸钠脱水 1 小时。脱水后， 用蒸发器浓缩， 通过硅胶柱层析 ( 展开溶 剂： CHCl3 → CHCl3 ∶ MeOH ＝ 10 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到淡 绿色固体 (7)。用真空泵将得到的固体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 557mg、 0.94mmol， 收 率 87.0％ )。 1
     HNMR(400MHz ，DMSO) δ ； -0.46(3H ，s ， 13-3’-2”-CH 3 ) 、-0.07(3H ，s ， 13-2’ -2” -CH 3) 、 0.09(6H ， s， 13-2’ -2” ， 3’ -2” -2CH 3) 、 0.79(9H ， s， 13-3’ -3” -3CH 3) 、 0.93(9H， s， 13-2’ -3’ ‘-3CH3)、 3.60-3.64(2H， s， 13-1’ -CH2)、 3.71-3.74(2H， q， 13-1’ -CH2)、4.24-4.25(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.67-4.72(2H， t， 12-3’ -CH2)、 4.38-4.40(1H， w， 13-2’ -CH)、 8.39-8.49(3H， q， 6-1’ -C6H5)、 7.51(1H， s， 2-CH)、 7.55(1H， s， 7-CH)、 7.60(1H， s， 12-CH)、 9.60(1H， s， 6-NH)
     (8)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ]- 喹唑啉的合成
     向 557mg(0.94mmol)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ]- 喹唑 啉中， 加入 20ml THF、 3.4g 3.76ml 1.0M 四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液 (3.76mmol， 4.0 当 量 )， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌 ( 黄绿色透明 )。搅拌开始 2 小时后， 通过 TLC 确认 目标物消失， 用蒸发器进行浓缩， 通过硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 20 ∶ 1 ～ 7 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到淡绿色固体 (8)。用真空泵将得到 的固体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 265mg、 0.73mmol， 收率 77.3％ )。 1
     HNMR(400MHz， DMSO)δ ； 1.25(1H， s， 13-2’ -1” -OH)、 1.26(1H， s， 13-3’ -1” -OH)、 3.91(2H， s， 13-1’ -CH2)、 4.21-4.27(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.60-4.69(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.85-4.90(2H， t， 12-3’ -CH2)、 5.20-5.25(1H， s， 13-2’ -CH)、 7.60-7.79(3H， q， 6-1’ -C6H5)、 8.12(1H， s， 2-CH)、 8.60(1H， s， 7-CH)、 8.79(1H， s， 12-CH)、 9.42(1H， s， 6-NH)
     (9)13-[2’ - 羟基 -4’ -(4， 4’ - 二甲氧基三苯甲基 )]-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰 基 ] 喹唑啉的合成 向 260mg(0.71mmol)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉 中， 加入 240mg(0.71mmol， 1.0 当量 )4-4’ - 二甲氧基三苯甲基氯、 20mL 吡啶， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌。搅拌开始 2 小时后， 由 TLC 的结果可知 4-4’ - 二甲氧基三苯甲基氯有不 足的倾向， 因此追加 240mg(0.71mmol， 1.0 当量 )。搅拌开始 7 小时后， 根据 TLC 感觉反应不 再进行， 因此用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： CHCl3) 分液 ( 饱和 NaHCO3×2 →饱和食盐水 ×1) 后， 用无水硫酸钠脱水 1 小时。脱水后， 用蒸发器进行浓缩， 通过中性硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： CHCl3 ～ CHCl3 ∶ MeOH ＝ 50 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到淡黄色 固体 (9)( 产量 210mg、 0.314mmol， 收率 44.0％ )。 1
     HNMR(400MHz ，CDCl 3 ，D 2 O) δ ； 1.25(1H ，s ， 13-2’-1”-OH) 、 1.26(1H ，s ， 13-3’ -1” -OH)、 3.91(2H， s， 13-1’ -CH2)、 4.21-4.27(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.60-4.69(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.85-4.90(2H， t， 12-3’ -CH2)、 5.20-5.25(1H， s， 13-2’ -CH)、 7.60-7.79(3H， q， 6-1’ -C6H5)、 8.12(1H， s， 2-CH)、 8.60(1H， s， 7-CH)、 8.79(1H， s， 12-CH)、 9.42(1H， s， 6-NH)
     (10)13-[2’ -[(N， N- 二 异 丙 基 氨 基 ) 氧 膦 基 ]-4’ -(4， 4’ - 二甲氧基三苯甲 基 )]-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉的合成
     用 2ml CH2Cl2 溶解 135mg(0.20mmol)13-[2’ - 羟基 -4’ -(4， 4’ - 二甲氧基三苯甲 基 )]-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉后， 加入 68μl(0.40mmol， 2.0 当量 )Huning 碱、 67μl(0.30mmol， 1.5 当量 )i-Pr2NP(Cl)OCE， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌。30 分钟 后， 通过 TLC 确认反应进行后， 停止搅拌。之后， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： CHCl3) 分液 ( 饱和 NaHCO3×2 →饱和食盐水 ×1) 后， 用无水硫酸钠进行数分钟脱水处理。脱水后， 用蒸发器浓 缩， 通过中性硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： 乙酸乙酯 ) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由 31 此得到淡黄色化合物 (9)。 另外， 干燥后， 通过 P NMR 确认到目标峰 (149.1， 150.2ppm)( 产 量 122.1mg、 0.314mmol， 收率 47.0％ )。
     实施例 2
     在本实施例中， 使用实施例 1 中合成的酰胺体来合成寡核苷酸。
     使用 DNA 合成仪合成并纯化四种寡核苷酸， 在所述四种寡核苷酸的下述序列的 X 部分中引入有已合成的化合物 10 的酰胺体。另外， 以下的序列中， F-1 和 F-2 是志在形成 如分子信标那样的茎 - 环结构的序列， 序列的下划线部分为茎部分， 无下划线的部分为环 部分。
     F-15’ -d(TTC TGA CTT X TTT TCA GAA)-3’ (19 聚体 )
     F-25’ -d(TTC TGA CTA X ATT TCA GAA)-3’ (19 聚体 )
     F-35’ -d(AAG GAA AX GAG GAA AGA)-3’ (17 聚体 )
     F-45’ -d(AAG GAA XX GAG GAA AGA)-3’ (17 聚体 )
     另外， 通过合成仪进行偶联后， 将 CPG 悬浮于 1.2ml 28％的 NH4OH 中， 在恒温箱中 保持于 55℃的同时温育 12 小时。 将 CPG 悬浮液转移至微量离心管中， 再用 1ml 的 H2O ∶ MeOH ＝ 3 ∶ 1 溶液清洗两次， 用 SpeedVac 离心减压除去上清液的溶剂。减压后， 将其用 200μl 的上样溶液回收并进行电泳， 通过将目的条带与凝胶洗脱液共同搅拌， 将目标寡核苷酸洗 脱。用 Sep-pak C18 反相柱粗纯化洗脱液， 通过 SpeedVac 离心减压除去该洗脱液。
     使用 MALDI-TOF/MS 对寡核苷酸进行定量。 结果示于下表中。 根据 TOF/MS 的结果， 判断出 F-1、 F-3、 F-4 为目标寡核苷酸。没有记录 F-2 的测定值是因为其 OD 值极其微量， 不 能进行检测。
     表1
     通过 MALDI-TOF/MS 得到的寡核苷酸的定量结果
     编号 F-1 F-2 F-3 F-4
     序列 5′ -d(TTC TGA CTT X TTT TCA GAA)-3′ 5′ -d(TTC TGA CTA X ATT TCA GAA)-3′ 5′ -d(AAG GAA AX GAG GAA AGA)-3′ 5′ -d(AAG GAA XX GAG GAA AGA)-3′观察值 5779.9 5365.3 5380.6计算值 5774.01 5792.02 5365.01 5373.99实施例 3F-3、 F-4 的热稳定性评价 ： 测定 Tm
     在本实施例中， 用 Tm 值评价 F-3、 F-4 与各自互补的 DNA 和 RNA 形成的双链的热稳 定性。另外， 将 Tm 测定中的各链溶解在 200μL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使其浓度为 3μM， 在 95℃下退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟 的脱气。从该样品中取 150μL 放入专用区域 ( セル ) 内进行测定。F-3、 F-4 和互补 DNA、 RNA 的序列记录在下表中。
     表2
     寡核苷酸序列F-3 F-4 互补 DNA 互补 RNA
     5’ -d(AAG-GAA-AQ-GAG-GAA-AGA)-3’ 5’ -d(AAG-GAA-QQ-GAG-GAA-AGA)-3’ 3’ -d(TTC-CTT-XX-CTC-CTT-TCT)-5′ 3’ -r(UUC-CUU-XX-CUC-CUU-UCU)-5’※ 表中的 Q 表示三环性类似物， 互补 DNA 的 XX 表示 TA、 TT、 TG、 TC， 互补 RNA 的 XX 表示 UA、 UU、 UG、 UC。
     如图 10 和图 11 所示可知， 任何一种探针与 DNA 形成的双链都很不稳定， 与此相 对， 与 RNA 互补的情况下， 类似物的数量增加时双链的热稳定性反而上升。
     实施例 4
     F-1 的热稳定性评价 ： 测定 Tm
     在本实施例中， 用 Tm 值评价 F-1 与各自互补的 RNA 形成的双链的热稳定性。 将 F-1 的 Tm 测定中的各链溶解在 200μL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使 其浓度为 3μM， 在 95℃下退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟的脱气。
     F-1 及其互补 RNA 的序列记录于下表中。
     表3
     寡核苷酸 F-1 互补链
     序列 5’ -d(TTC-TGA-CTT-Q-TTT-TCA-GAA)-3’ 5’ -r(UUC-UGA-AAA-X-AAG-UCA-GAA)-3’碱基数 19 聚体 19 聚体※ 表中的 Q 表示三环性类似物， 互补 RNA 的 X 表示 A、 U、 G、 C。另外， F-1 序列中的 下划线部分的序列表示茎部位， 中央的 5 聚体表示环部分。
     通过测定 50％解链温度 Tm， 来比较呈两条链状态的 F-1 与互补 RNA 的热稳定性。 解链曲线和 Tm 值如图 12 所示。
     如图 12 所示可知， 与探针内形成双链时相比， F-1 在与互补 RNA 形成双链时呈现 出极其良好的热稳定性。
     实施例 5
     三环性类似物的荧光特性和极性依存度的测定
     在本实施例中， 使用实施例 1 中合成的化合物 5 来评价三环性类似物的荧光特性。 取 1mg 量的化合物 5 溶解于 500μl DMSO 中。充分溶解后， 取 10μl 转移至新的微量离心 管中， 加入 990μl 蒸馏水。之后， 用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行荧光测定。激发波 长、 荧光波长示于图 13 中。另外， 取 1mg 量的化合物 (5)， 充分溶解于 500μl DMSO 后， 向 三个新的微量离心管中各转移 10μl， 并分别加入 990μl 的 H2O( 蒸馏水 )、 干燥 MeOH、 干燥 CHCl3， 制成三种样品。将各样品分别转移至荧光比色皿中， 用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行荧光测定。照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲线如图 14所示。 如图 13 所示可知， 化合物 5 在约 338nm 处吸收光， 并发出约 400nm 的荧光。另外， 如图 14 所示可知， 在蒸馏水中发出的荧光最强， 在甲醇中也发出荧光， 在氯仿中不发出荧 光。
     实施例 6
     结合有三环性类似物的 CPG 的合成
     在本实施例中， 制作结合有三环类似物的 CPG 单元 (11)。即， 将 143mg(0.21mmol) 化合物 (9) 溶解于吡啶 (2mL) 中， 加入 0.5μg(4.2μmol， 0.02 当量 )DMAP、 63mg(0.63mmol， 3.0 当量 ) 无水琥珀酸， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌。110 小时后， 通过 TLC 确认反应 不再进行， 用乙酸乙酯稀释， 用水 (×2)、 NaHCO3(×1)、 饱和 NaCl 水溶液 (×1) 进行萃取、 洗涤， 并用乙酸钠干燥， 除去溶剂。然后， 溶解于 DMF(4mL) 中， 并将 0.62g(0.047mmol， 1.0 当量 )CPG 溶于反应液中， 加入 36mg(0.188mmol， 4 当量 )WSC。在室温下振荡两天， 之后， 用 吡啶洗涤， 干燥后加入 1.5mL 无水乙酸、 13.5mL 吡啶、 0.183g DMAP[ 吡啶∶ Ac2O(9 ∶ 1) 中 DMAP 为 0.1M]， 在室温下振荡 15 小时。按照吡啶、 MeOH 和丙酮的顺序依次更换洗涤液进行 洗涤， 并干燥。结果， 以 31.2μmol/g 的活性得到生成物。另外， 活性通过以下方式计算 ： 将 6mg 干燥后的 CPG 树脂装载到玻璃过滤器上， 使 HClO4 ∶ EtOH ＝ 3 ∶ 2 的溶液流过， 求出该 滤液在波长为 UV498nm 处 (DMTr 基团的波长 ) 的吸光度， 并代入下式中。
     实施例 7
     末端插入有三环性类似物的寡核苷酸 (FK-1、 FK-3 的合成 )
     在本实施例中， 使用 DNA 合成仪合成并纯化一种寡核苷酸 (FK-1)， 其中， 在下述碱 基序列的 X 部分 (3’ 末端 ) 引入有合成的 CPG 单元 (11)( 荧光性类似物 Q)。另外， 合成并 纯化了包含以下靶序列的 RNA 和 DNA( 代替尿嘧啶以胸腺嘧啶为碱基 )。另外， 还合成并纯 化了在 FK-2 序列的 5’ 末端的 N 上分别插入有 dA、 dT、 dG、 dC 的四种寡核苷酸。另外， 本实 施例中使用的以下靶序列 (RNA) 含有作为药物转运蛋白 MDR1(P- 糖蛋白 ) 的基因多态性的 一种的 2677G/A/T(2677 位与 Y 相当 )
     靶 RNA ： 5’ -r(GAC-UCA-CCU-UCC-CAG-X
     -ACC-UUC-UAG-UUC-UUU)-3’ (31 聚体 )
     FK-1 ： 5’ -d(AAA-GAA-CTA-GAA-GGT-Q)-3’ (16 聚体 )
     FK-2 ： 5’ -d(Y-CTG-GGA-AGG-TGA-GTC)-3’ (16 聚体 )
     另外， 使用 DNA 合成仪时， 进行与实施例 2 同样的操作， 从而获得纯化的寡核苷酸。
     实施例 8
     两种探针与靶链的杂交和荧光测定之一
     将实施例 6 中合成的 FK-1、 FK-2(Y:dA、 dT、 dG、 dC 四种 ) 和靶 RNA 链 (X:rU) 这三 种寡核苷酸溶解在 1mL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使各链的浓度 为 3μM， 在 95℃退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟的脱气。将总计四种 杂交样品以及仅有 FK-1 的样品转移到荧光比色皿中， 用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行
     荧光测定。照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲线图如图 15 所 示。
     如 图 15 所 示， 在 与 靶 链 的 X(rU) 分 别 互 补 的 FK-1 和 FK-2(Y:dA) 的 杂 交 样 品 中， 显示出最强的荧光， 其它杂交样品与仅有 FK-1 的样品基本同等。即， 认为将 FK-1 和 FK-2(Y:dA) 作为针对靶链的探针使用时， 通过 FK-1 和 FK-2 的竞争， 如图 9 所示， 作为荧光 性类似物碱基的 Q 从双链上翻转， 发出荧光。另外， 在其它杂交样品中， 各 FK-2 探针不是与 FK-1 竞争的探针， 因此荧光性碱基 Q 不从双链上翻转， 因而不呈现荧光。
     实施例 9
     两种探针与靶链的杂交和荧光测定之二
     将实施例 6 中合成的 FK-1、 FK-2(Y:dA、 dT、 dC 三种 ) 和靶 RNA 链 (X:rU、 rG、 rA) 以预定的组合溶解在 1mL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使三种寡核 苷酸的链浓度分别为 3μM， 在 95℃退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟的脱 气。将总计四种杂交样品以及仅有 FK-1 的样品转移到荧光比色皿中， 用荧光分光装置 ( 日 立 -F4500) 进行荧光测定。照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲 线如图 16 所示。
     如图 16 所示， 使 FK-1 和 FK-2(Y:dC) 与靶链 (X:rG) 杂交时， 靶链与 FK-2 进行强 杂交 (GC 碱基对 )， 结果， FK-1 的荧光性碱基 Q 剧烈地翻转， 发出最强的荧光。其次， 使 FK-1 和 FK-2(Y:dT) 与靶链 (X:rA) 杂交时， 靶链与 FK-2 进行杂交， 结果， FK-1 的荧光性碱基 Q 发 生翻转， 发出强荧光。另外， 在与靶链的 X(rU) 分别互补的 FK-1 和 FK-2(Y:dA) 的杂交样品 中， 发出次于上述的荧光。
     从以上可知， 通过在与靶 RNA 中的 X 对应的位置 (5’ 末端 ) 上， 使具有与作为 X 可 能存在的碱基互补的普通碱基的探针 (FK-2)、 和在与 X 对应的位置 (3’ 末端 ) 上具有荧光 性碱基 Q 的探针 (FK-1) 进行杂交， 根据荧光性碱基 Q 翻转的程度， 荧光强度会不同， 因此， 利用这一点， 可以检测靶 RNA 中的 X 碱基。
     序列表自由文本
     本发明涉及以高选择性对 RNA 进行杂交的杂交试剂及其用途。背景技术 关于基因表达产物， 已知各种分析手段。可以列举例如 ： 利用原位杂交、 荧光共振 能量转移、 荧光消偏振等的方法。 在这些各种分析手段中， 使用用于检测特定碱基序列的探 针或引物等， 根据分析目的的不同， 对探针等要求的特性也不同。
     迄今为止， 关于用于检测特定碱基序列的探针等， 已经开发出进行了各种修饰 或改变的核苷衍生物。可以列举例如 ： 肽核酸 (PNA) 或桥式核酸 (Bridge-type Nucleic Acids， BNA)。另外， 也报道了各种开糖环式核苷酸衍生物 ( 非专利文献 1 ～ 7)。另外， 还 尝试了碱基上的扩环修饰 ( 非专利文献 8、 9)。
     非专利文献 1： P.E.Nielsen， M.Egholm， R.H.Berg， O.Buchardt， Science， 254， 497(1991)。
     迄今为止， 关于用于检测特定碱基序列的探针等， 已经开发出进行了各种修饰 或改变的核苷衍生物。可以列举例如 ： 肽核酸 (PNA) 或桥式核酸 (Bridge-type Nucleic Acids， BNA)。另外， 也报道了各种开糖环式核苷酸衍生物 ( 非专利文献 1 ～ 7)。另外， 还 尝试了碱基上的扩环修饰 ( 非专利文献 8、 9)。
     非专利文献 1： P.E.Nielsen， M.Egholm， R.H.Berg， O.Buchardt， Science， 254， 497(1991)。
    非专利文献 2 ： S.Obika， D.Nanbu， Y.Hari， J.Andoh， K.Morio， T.Doi， T.Imanishi， Tetrahedron Lett.， 39， 5401(1998)。
     非专利文献 3 ： K.C.Schneider， S.A.Benner， J.Am.Chem.Soc.， 112， 453(1990)。
     非 专 利 文 献 4： K.Augustyns， A.V.Aerschot， A.V.Schepdael， C.Urbanke， P.Herdewijn， Nucleic Acids Res.， 19， 2589(1991)。
     非 专 利 文 献 5： M.Azymah， C.Chavis， M.Lucas， F.Morvan， J.-L.Imbach， Nucleosides & Nucleotides， 11， 1241(1992)。
     非专利文献 6： P.Nielsen， F.Kirpekar， J.Wengel， Nucleic Acids Res.， 22， 703(1994)。
     非专利文献 7 ： L.Zang， A.Peritz， E.Meggers， J.Am.Chem.Soc.， 127， 4174(2005)。
     非 专 利 文 献 8： N.Minakawa， N.Kojima， S.Hikishima， T.Sasaki， A.Kiyosue， N.Atsumi， Y.Ueno， A.Matsuda， J.Am.Chem.Soc.， 125， 9970(2003)。
     非专利文献 9 ： H.Liu， J.Gao， L.Maynard， Y.D.Saito， E.T.Kool， J.Am.Chem.Soc.， 126， 1102(2004)。
    发明内容
     基因表达的最初产物是作为转录产物的 RNA， 因此， 与通过 RT-PCR 检测 DNA 相比， 更优选以高于 DNA 的选择性对 RNA 进行杂交的方法。另外， 还期望通过与 RNA 杂交， 在细胞 内对 RNA 进行实时检测。
     PNA 的目的在于， 通过排除磷酸部位的电荷来减少静电排斥， 从而使 PNA-DNA 双链 形成比 DNA-DNA 双链更强的结合。另外， BNA 通过将核糖环的 2’ 位和 4’ 位交联而预先固 定为 N 型结构， 从而提高对目标 DNA 或 RNA 的结合亲和性。因此， PNA 和 BNA 中的任一种都 提高了对 DNA 和 RNA 两者的稳定性。即， 不仅对 RNA， 对 DNA 也同样显示高亲和性。另外，已知大多数各种开糖环式衍生物与 DNA 和 RNA 中任一种形成的杂交体的热稳定性均显著变 差。另外， 根据本发明人的研究可知， 扩环式核苷酸不与 RNA 形成稳定的杂交体。
     另外， 尚未提供有通过对 RNA 具有碱基特异性， 能够在基因表达水平上检测 SNP 的 程度的高碱基特异性的 RNA 用杂交试剂。
     因此， 本发明的一个目的在于， 提供对 RNA 具有高亲和性的核苷衍生物及其制造 方法。另外， 本发明的另一目的在于， 提供具有碱基识别能力的核苷衍生物及其制造方法。 本发明的另外一个目的在于， 提供这样的核苷衍生物的作为杂交试剂的用途。
     本发明人基于 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链的结构比较， 验证了开糖环对 DNA-RNA 双链稳定性的影响和对碱基特异性的影响， 并在对其结果进行详细研究的基础上， 发现了 使 DNA-RNA 双链稳定化并且具有碱基识别能力的核苷酸结构， 从而完成了本发明。根据本 发明提供以下的手段。
     根据本发明， 提供由下述式 (1) 和式 (2) 中任一个表示的核苷衍生物。
    ( 其中， 式 (1) 和式 (2) 中， Z 表示碳原子或氮原子， R1 表示氢原子或羟基保护基， R2 表示氢原子或磷酸二酯基 )
     所述核苷衍生物优选由式 (1) 表示且所述 Z 为氮原子。
     根据本发明， 提供由下述式 (3) 和式 (4) 表示的核苷衍生物。
    
    ( 其中， 式 (3) 和式 (4) 中， Z 表示碳原子或氮原子， W1 表示氢原子或羟基保护基， W2 表示羟基保护基、 亚磷酰胺基或者要结合或已结合到固相载体上的连接基团， R3 表示氢 原子或氨基保护基 )
     根据本发明， 提供一种寡核苷酸， 其具有由下述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示的一 种或两种以上的核苷酸衍生物单元。
    
    ( 其中， 式 (5) 和式 (6) 中， Z 表示碳原子或氮原子， X1 表示 O、 S 或 Se， X2 表示 SH( 或 S-)、 S 或 Se-、 碳原子数为 1 ～ 4 的烷基或吗啉基 )
     根据本发明， 提供一种 RNA 杂交试剂， 其具有由上述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示 的一种或两种以上的核苷酸衍生物单元。
     在本发明的杂交试剂中， 所述核苷酸衍生物单元优选由式 (5) 表示且所述 Z 为氮 原子。另外， 优选在末端具有所述核苷酸衍生物单元。另外， 优选具有能够形成茎 - 环结构 的碱基序列并且在所述环上具有所述核苷酸衍生物单元。
     根据本发明， 提供一种探针组， 用于检测 RNA 上的突变， 其中， 包含 ： 第一探针， 在 与所述突变位点相当的 5’ 末端或 3’ 末端具有由上述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示的一种 或两种以上的核苷酸衍生物单元 ； 和一种或两种以上的第二探针， 在与所述突变位点相当 的 3’ 末端或 5’ 末端具有脱氧核苷酸， 所述脱氧核苷酸具有与所述突变位点上可能存在的 碱基互补的碱基。
     根据本发明， 提供一种检测方法， 用于检测单核苷酸多态性， 其中， 包括以下步骤 ： 准备作为可能包含所述单核苷酸多态性的基因表达产物的 RNA 样品的步骤 ； 使用将选自上 述本发明的探针组中的一种第一探针和一种第二探针组合得到的一种或两种以上的组合， 使所述第一探针和所述第二探针与所述 RNA 样品以能够杂交的方式进行接触的步骤 ； 和对 所述 RNA 样品与所述第一探针和所述第二探针的杂交产物中的所述第一探针的荧光信号 进行检测的步骤。 附图说明
    图 1 是表示 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链的磷酸间距离和以此为基础的核苷改变的图。 图 2 是表示第一次改变后的核苷衍生物的 DNA-DNA 双链的热稳定性和碱基选择性 的评价结果的图。
     图 3 是表示第一次改变后的核苷衍生物的 DNA-RNA 双链的热稳定性和碱基选择性 的评价结果的图。
     图 4 是表示第一次改变后的核苷的 MOE 建模结果的图。
     图 5 是表示有关第二次改变后的核苷衍生物 ( 本发明的核苷衍生物 ) 的制作的 图。
     图 6 是 表 示 含 有 第 二 次 改 变 后 的 核 苷 衍 生 物 的 寡 核 苷 酸 的 DNA-RNA 双 链 和 DNA-DNA 双链的热稳定性 (Tm 值 ) 的图表。
     图 7 是表示 DNA-RNA 双链和 DNA-DNA 双链中的第二次改变后的核苷衍生物的碱基 选择性 (Tm 值 ) 的图表。
     图 8 是表示第二次改变后的核苷衍生物的荧光光谱的图。
     图 9 是表示本发明探针组的一例的图。
     图 10 是表示实施例 3 中的 F-3、 F-4 的热稳定性 ( 与 DNA 形成的双链 ) 的评价结 果的图。
     图 11 是表示实施例 3 中的 F-3、 F-4 的热稳定性 ( 与 RNA 形成的双链 ) 的评价结 果的图。
     图 12 通过测定 50％解链温度 Tm 来比较实施例 4 中呈两条链状态的 F-1 和互补 RNA 的热稳定性， 是表示解链曲线与 Tm 值的图。
     图 13 是表示在实施例 5 中使用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行荧光测定的激 发波长和荧光波长的图。
     图 14 是表示照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲线的 图。
     图 15 是表示在实施例 7 中照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光
     强度的曲线的图。
     图 16 是表示在实施例 8 中照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光 强度的曲线的图。 具体实施方式
     本发明涉及由下述式 (1) 和式 (2) 中任一个表示的新的核苷衍生物及其应用。
    ( 其中， 式 (1) 和式 (2) 中， Z 表示碳原子或氮原子， R1 表示氢原子或羟基保护基， R2 表示氢原子或磷酸二酯基 )
     本发明人为了解决上述问题， 进行了各种研究。首先， 着眼于 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链中相邻的磷酸间距离， 然后， 对能够减少磷酸间距离的核苷衍生物， 研究了双 链的热稳定性及其结构， 结果发现了同时满足热稳定性和碱基选择性这两者的结构。
     本发明人着眼于 RNA-RNA 双链 (A 型双链 ) 的磷酸间距离 ( 碱基间的距离 ) 比 DNA-DNA 双链 (B 型双链 ) 短的事实， 将磷酸骨架的磷酸之间从天然核苷的三个碳原子减少 至两个碳原子。另外， 为了提高碱基选择性， 本发明人将核酸的碱基部位设定为与天然核 苷不同的三环碱基。可知这样得到的核苷类似物对 RNA 具有选择性的高亲和性。并且， 以 400nm 为中心发出强荧光。 还发现通过使用具有这样的亲和性和荧光特性的核苷， 能够对与 耐药性有关的 P- 糖蛋白基因的基因多态性进行检测。
     本发明的核苷衍生物与现有型相比 RNA 选择性高， 因此能够有效用于反义法、 siRNA 法等以 RNA 为标靶的基因治疗或各种研究手法。 另外， 本发明的核苷衍生物其自身具 有荧光性， 因此对基因多态性等的检测极为有利。
     以下， 参照附图对本发明的概要进行说明。图 1 是表示 DNA-DNA 双链和 DNA-RNA 双链的磷酸间距离和以此为基础的核苷改变的图， 图 2 是表示第一次改变后的核苷衍生物 的 DNA-DNA 双链的热稳定性和碱基选择性的评价结果的图， 图 3 是表示改变后的核苷衍生 物的 DNA-RNA 双链的热稳定性和碱基选择性的评价结果的图， 图 4 是表示改变后的核苷的 MOE 建模结果的图， 图 5 是表示关于第二次改变后的核苷衍生物 ( 本发明的核苷衍生物 ) 的
     制作的图。另外， 图 6 是表示含有第二次改变后的核苷衍生物的寡核苷酸的 DNA-RNA 双链 和 DNA-DNA 双链的热稳定性 (Tm 值 ) 的图表， 图 7 是表示 DNA-RNA 双链和 DNA-DNA 双链中 的第二次改变后的核苷衍生物的碱基选择性 (Tm 值 ) 的图表， 图 8 是表示第二次改变后的 核苷衍生物的荧光光谱的图。
     另外， MOE 为基于分子力学方法的程序， 图 4 的建模结果使用 MMFF94x 力场运行程 序而得到。
     如图 1 所示， 对两种双链结构计算磷酸间的平均距离可知， DNA-DNA 双链为 6.7 埃， DNA-RNA 双链为 5.7 埃。 即可知， DNA-RNA 双链中的磷酸间距离比 DNA-DNA 双链的短。 因此， 本发明人着眼于磷酸间距离的差异， 进行了如下设计 ( 第一次改变的核苷衍生物的设计 ) ： 使用相邻的磷酸间为两个碳原子 ( 通常的核苷为三个碳原子 ) 的丙基腺嘌呤和丁基腺嘌呤 作为碱基类似物以缩小磷酸间的距离， 并合成了含有其的寡核苷酸， 对其 RNA 选择性进行 了验证。 验证通过以下方式进行 ： 通过 Tm 值比较 DNA-DNA 和 DNA-RNA 两种双链的热稳定性， 并且通过 Tm 值比较对 RNA 中四种碱基的碱基选择性。结果如图 2、 图 3 所示。
     如图 2 所示可知， 丁基型衍生物中 DNA-DNA 和 DNA-RNA 两种双链均具有热不稳定 性， 与此相对， 丙基型衍生物中与 DNA 形成的双链具有热不稳定性， 但是与 RNA 形成的双链 热不稳定性稍好。另外， 如图 3 所示可知， 与未修饰的情况 ( 各图上部的四个条 ) 相比， 经 改变得到的类似物 ( 各图中央部的四个条和下部的四个条 ) 的碱基选择性低。 因此， 对引入这两种类似物的 DNA-RNA 双链进行 MOE 建模， 如图 4 所示可知， 丁基 型 ( 图 4 右侧 ) 衍生物中与氢键有关的原子间距离为能够形成氢键的 3 埃以内， 与此相对， 丙基型 ( 图 4 左侧 ) 衍生物中为 3 埃以上， 对于形成氢键是不足够的长度。本发明人推测， 丁基型衍生物中虽然到互补碱基的距离足够， 但是侧链的灵活度高， 从而使双链具有热不 稳定性， 丙基型衍生物中侧链的灵活度更低， 可以保持高于丁基型的热稳定性， 但是到互补 碱基的距离不充分， 因此碱基选择性下降。
     因此， 本发明人为确保到互补碱基的距离， 设计了在丙基型类似物的碱基部位引 入吡啶环的这些衍生物作为二次核苷衍生物， 并合成了 DNA 合成用的 amidite( アミダイ ト ) 化合物和寡核苷酸 ( 参照图 5)。如图 5 所示， 这些衍生物均为三环化合物。
     如图 6 所示可知， 含有第二次改变后的核苷衍生物的寡核苷酸 (DNA) 与 DNA 形成 双链时不稳定， 与此相对， 与 RNA 形成双链时当衍生物数量增加时双链的热稳定性反而上 升。 另外， 如图 7 所示可知， 含有第二次改变后的核苷衍生物的寡核苷酸 (DNA)， 当 DNA 为互 补链时选择性低， 与此相对， 当 RNA 为互补链时， 由于具有三环性， 因此碱基选择性比第一 次改变后的核苷衍生物提高。
     另外， 如图 8 所示可知， 第二次改变后的核苷衍生物具有以 400nm 为中心的强荧 光， 可以直接对杂交产物进行荧光检测。
     从以上可知， 本发明可以提供一种核苷衍生物和包含该核苷衍生物的寡核苷酸， 所述核苷衍生物为减小寡核苷酸中相邻的磷酸间的距离而具有用丙基代替脱氧核糖的开 糖环结构， 为确保在与互补碱基之间能够形成氢键的距离而具有扩环式碱基结构， 因此， 对 RNA 双链具有稳定性和碱基识别性。另外， 已明确这样改变后的核苷衍生物具有荧光， 因此 还能够提供单核苷酸识别性。
    具体实施方式
     以下， 对本发明的各种实施方式进行详细说明。
     以下， 对作为本发明实施方式的核苷衍生物、 寡核苷酸的制造方法和它们使用的 化合物、 它们的用途进行详细说明。另外， 本发明涉及的本领域技术人员的技术范围内的 分子生物学和核酸化学的现有技术已在文献中进行了说明。例如可以参考 Sambrook 等的 《分子克隆 ： 实验室手册》 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual)， 冷泉港实验室， 冷 泉港， 纽约， 1989 年 ； Gait， M.J.， 《寡核苷酸合成》 (OligonucleotideSynthesis)， 1984 年 编著 ； Hames， B.D. 和 Higgins， S.J.， 《核酸杂交》 (Nucleic Acid Hybridization)， 1984 年 编著 ； 和一系列的 《酶学方法》 (Methods in Enzymology)， 学术出版社 (Academic Press， Inc.)。
     ( 核苷衍生物 )
     本发明的核苷衍生物为式 (1) 或式 (2) 表示化合物。这些化合物中， Z 表示碳原 子 (CH) 或氮原子。
     另外， 这些化合物中的环 A 的成环碳原子上键合的氢原子可以是未取代的， 也可 以是经取代的。作为取代基， 优选碳原子数为 1 ～ 4 的链状烷基。即， 可以列举 ： 甲基、 乙 基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基和叔丁基。考虑空间位阻等时， 有时可以优选使用甲基 和乙基。另外， 取代基的数量没有特别限定， 但在存在空间位阻等问题的情况下， 优选为约 1 个或 2 个。 R1 可以为氢原子或羟基保护基。羟基保护基可以利用公知的基团。具体示例可以 列举与后段中说明的同样的基团。另外， R2 可以为氢原子或磷酸二酯基 (PO3)。作为磷酸二 酯基没有特别限定。代替磷原子上以双键键合的一种氧原子， 可以为 O、 S 或 Se， 代替其它 羟基 ( 氧离子 )， 可以为 SH( 或 S )、 S 或 Se 、 碳原子数为 1 ～ 4 的烷基或吗啉基。作为由这 1 2 些 X 和 X 的组合得到的各种磷酸二酯基， 可以举出例如下式 (7) 的各种基团 ( 其中不包括 碳原子上连接的氧原子 )。
    
    由式 (1) 表示的核苷衍生物可以作为腺苷类似物使用。另外， 由式 (2) 表示的核 苷衍生物可以作为鸟苷类似物使用。另外， R2 上具有磷酸二酯键基团时， 由式 (1) 和式 (2) 表示的核苷衍生物为核苷酸衍生物。
     另外， 本发明的核苷衍生物可以发出荧光。即， 照射约 330nm 的激发波长的光时， 可以发出在 400nm 附近有峰的荧光。因此， 可以容易地检测与特定的 RNA 或特定的碱基等 的杂交。
     根据 P.A.Harris 和 W.Pendergast， 《杂环化学杂志》 (J.HeterocyclicChem.)， 33， 319(1996) 的记载， 本核苷衍生物可以通过在嘌呤碱基上进行扩环来合成。例如， 由式 (1) 表示的化合物可以通过以下的方案 1 合成。
    
    ( 适于寡核苷酸合成的核苷衍生物 )
     作为适于寡核苷酸合成的核苷衍生物， 可以列举由以下的式 (3) 和式 (4) 表示的 化合物。另外， 式 (3) 和式 (4) 中的 Z 和 A 环与式 (1) 和式 (2) 中的 Z 具有相同含义。
    
    式 (3) 和式 (4) 中， W1 可以表示氢原子或羟基保护基。作为羟基保护基， 只要是保 护羟基使其避免不必要反应的基团即可。 作为这样的羟基保护基， 没有特别限定， 可以使用 现有公知的各种羟基保护基。 本发明的优选的保护基为芴甲氧羰基 (FMOC 基 )、 二甲氧基三 苯甲基 (DMT 基 )、 叔丁基二甲基硅烷基 (TBDMS 基 )、 单甲氧基三苯甲基、 三氟乙酰基、 乙酰 丙酯 ( レブリニル ) 基或甲硅烷基。优选的保护基为三苯甲基， 例如从二甲氧基三苯甲基 (DMT) 和叔丁基二甲基硅烷基 (TBDMS 基 ) 中选择。
     另外， W2 表示羟基保护基、 亚磷酰胺基或者要结合或已结合到固相载体上的连接 基团。 W2 为亚磷酰胺基的化合物 (amidite 化合物 ) 作为亚磷酰胺法的亚磷酰胺试剂使用， 可以用于合成寡核苷酸。另外， 本发明中， 亚磷酰胺基可以由下式 (8) 表示。
    
    ( 式 (8) 中， 各 Y1 相互独立， 可以相同也可以不同， 表示支链状或直链状的碳原子 2 数为 1 ～ 5 的烷基， Y 表示支链状或直链状的碳原子数为 1 ～ 5 的烷基或可以进行取代的 烷氧基 )
     上述式 (8) 中， Y1 没有特别限定， 可以优选列举异丙基， 另外， 作为 Y2， 可以列 举： -OCH3、 -OEtCN、 -OCH2CHCH2 等。
     另外， 对于式 (3) 和式 (4) 中 W2 为要结合到固相载体上的连接基团的化合物而言， 通过使该连接基团与氨基等固相载体上的预定官能团结合， 可以保持在固相载体上。 并且， 对于式 (3) 和式 (4) 中 W2 为已结合到固相载体上的连接基团的化合物而言， 通过连接基团 将本发明的核苷衍生物结合在固相载体上， 因此能够作为各种核酸固相合成法的起始材料 使用。通过使用该起始原料， 可以制造具有式 (5) 或式 (6) 表示的单元的寡核苷酸。
     在 此， 固 相 载 体 通 常 使 用 高 分 子 载 体， 可以列举例如： CPG( 可 控 多 孔 玻 璃 (controlled pored glass)) 或 HCP( 高 交 联 聚 苯 乙 烯 (highlycross-linked polystyrene))、 一定种类的凝胶等。另外， 固相载体上可以具有适当的间隔物 (spacer)。 连接基团是连接固相载体和本化合物的连接物。作为这样的连接基团， 可以使用公知的琥 珀酸酯连接物、 草酸酯连接物、 硅烷二基 ( シランジイル ) 连接物、 甲硅烷基连接物等。
    另外， 式 (3) 中的 R3 可以为氢原子或氨基保护基。来自腺嘌呤碱基的伯氨基根据 需要可以用适当的保护基保护。这样的保护方法和保护基是本领域技术人员公知的。作为 氨基保护基， 可以列举例如 ： 苯甲酰基、 乙酰基、 苯氧基乙酰基。
     这样的式 (3) 或式 (4) 表示的核苷衍生物可以从式 (1) 或式 (2) 表示的核苷衍生 物通过已知的方法合成。例如， 式 (3) 表示的各种核苷衍生物可以通过以下的方案 2 合成。
    
    ( 寡核苷酸 )
     本发明的寡核苷酸可以具有下述式 (5) 和式 (6) 中任一个表示的、 一种或两种以 上的核苷酸衍生物单元。式 (5) 和式 (6) 中的 Z 与式 (1) 等中的 Z 具有相同的含义， A环
     也与式 (1) 等中的 A 环具有相同的含义。
    式 (5) 和式 (6) 中， X1 可以为 O、 S 或 Se， X2 可以为 SH( 或 S-)、 S 或 Se-、 碳原子数 为 1 ～ 4 的烷基或吗啉基。作为这样的磷酸二酯基， 可以列举式 (7) 所述的各种基团。
     本发明的寡核苷酸中的上述核苷酸衍生物单元可以是一种以上也可以是两种以 上。另外， 可以是一个也可以是多个， 也可以是全部。本发明的寡核苷酸中所含的核苷酸衍 生物单元可以根据寡核苷酸的用途等来确定。
     另外， 寡核苷酸中的核苷酸衍生物单元的位置也没有特别限定。可以在 5’ 末端、 3’ 末端和这些以外的部分的任意一个位置上具有。另外， 本发明的寡核苷酸中， 5’ 末端上 可以结合有羟基， 也可以结合有磷酸基 (PO4)。另外， 同样地， 本寡核苷酸的 3’ 末端上可以 结合有羟基， 也可以结合有磷酸基 (PO4)。其它的 5’ 末端和 3’ 末端可以根据需要分别采用 适当的结构。
     本发明的寡核苷酸， 除本发明的核苷酸单元以外， 可以具有核糖核苷酸和 / 或脱 氧核糖核苷酸。本发明的寡核苷酸， 可以是除本发明的核苷酸单元以外仅包含脱氧核糖核 苷酸的寡核苷酸， 也可以是除本发明的核苷酸单元以外仅包含核糖核苷酸的寡核苷酸， 另 外， 也可以是除本发明的核苷酸单元以外同时包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的寡核苷 酸。由于 RNA-DNA 双链和 RNA-RNA 双链均为 A 型的双链结构， 因此作为 RNA 的本发明的寡 核苷酸也可以与互补的 RNA 链形成稳定的双链。
    寡核苷酸是指以核苷酸为单体单元且具有多个该单体单元的多聚物， 寡核苷酸通 常包括约数个以上到约 100 个以下的核苷酸的多聚物。本发明的寡核苷酸可以设定为与用 途相应的长度， 考虑到寡核苷酸的合成时， 优选为 10 个以上、 35 个以下。另外， 在反义寡核 苷酸的情况下， 可以约为 10 个以上、 30 个以下， 另外， 在 siRNA 的情况下， B 和 C 的总链长优 选为 15 个以上、 35 个以下， 更优选为 30 个以下。在作为引物的情况下， 优选为 10 个以上、
     30 个以下， 在作为探针的情况下， 优选为 10 个以上、 30 个以下， 在作为分子信标的情况下， 优选为 15 个以上、 40 个以下。
     另外， 根据本发明， 当然也提供具有本发明的核苷酸衍生物单元的多核苷酸。
     另外， 也可以具有本发明的核苷酸单元以外的进行了改变的核苷酸。进行了改变 的核苷酸是指核苷酸的各种部分， 即碱基、 糖部分和磷酸酯部分进行了某种化学修饰。
     本发明的寡核苷酸可以通过利用作为所述核苷衍生物的一种的酰胺体的现有公 知的核酸合成法来进行合成。
     本发明的寡核苷酸具有本发明的核苷酸单元， 因此可以与 RNA 选择性地进行稳定 的杂交， 并且具有碱基识别性， 因此可以检测特定序列的 RNA。而且， 其自身具有荧光性， 因 此也可以检测单核苷酸多态性等基因突变。
     另外， 由于高选择性地与 RNA 进行杂交， 因此特别可以优选用于细胞内的 RNA 检 测、 细胞内基因表达的实时检测。 另外， 将这些寡核苷酸保持在芯片或微珠等固相载体等上 而得到的材料， 可以作为检验装置、 诊断装置或这些装置的一部分来使用。
     本发明的寡核苷酸可以采取各种基因表达调控剂的形式。 即， 可以用于反义基因、 反义子、 适配子、 miRNA 和核酶。另外， 本发明的寡核苷酸也可以用于 siRNA、 shRNA、 反义子、 核酶和适配子。
     本发明的寡核苷酸可以用于探针和引物。 探针是指通过设计或选择而具有对靶核 酸特异性的规定的碱基序列， 为了在预定的严格度下与靶核酸杂交而获得的寡核苷酸。从 上述可知， 本发明的寡核苷酸探针可以特别优选用于细胞内的 RNA 检测、 尤其是实时检测。
     本发明的寡核苷酸含有的核苷酸衍生物单元， 其自身会发出荧光， 因此， 可以提供 利用该荧光的用于检测 RNA 上的突变的探针组。该探针组可以由具有本发明的核苷酸衍生 物单元的第一探针和不具有本发明的核苷酸衍生物单元的第二探针构成。 第一探针在与所 述突变位点对应的位置上具有本发明的核苷酸衍生物单元。另外， 这样的核苷酸衍生物单 元位于探针的 3’ 末端或 5’ 末端。例如， 如图 9 所示， 使第一探针杂交到靶链 ( 图 9 所示的 示例中为 RNA) 的 3’ 侧时， 要在 3’ 末端具有本发明的核苷酸衍生物单元。另外， 核苷酸衍 生物单元可以具有与要检测的突变位点上可能存在的碱基对应 ( 互补 ) 的碱基类似物， 也 可以不具有。第一探针可以是一种， 也可以是两种以上。根据与要检测的突变位点对应的 位置上具有的本发明的核苷酸衍生物单元的种类来决定第一探针的种类 ( 数量 )。
     另外， 第二探针具有脱氧核苷酸， 所述脱氧核苷酸具有与所述突变位点上可能存 在的碱基对应 ( 互补 ) 的碱基。另外， 该突变对应核苷酸位于探针的 3’ 末端或 5’ 末端。例 如， 如图 9 所示， 使第二探针杂交到靶链 (RNA) 的 5’ 侧时， 要在 5’ 末端具有合适的脱氧核 苷酸。第二探针可以是一种， 也可以是两种以上。根据与要检测的突变位点对应的位置上 具有的脱氧核苷酸的种类来决定第二探针的种类 ( 数量 )。
     如以上所述， 通过制作在与要检测的突变位点对应的位置上具有本发明的核苷酸 衍生物单元的探针、 和具有与在同一突变位点上可能存在的碱基互补的普通的脱氧核苷 酸单元的探针， 可以从第一探针对突变位点的匹配 / 错配和第二探针对突变位点的匹配 / 错配来识别突变位点的碱基。例如， 第一探针和第二探针都与突变位点匹配时， 第一探针 和第二探针在突变位点上发生竞争， 因此第一探针的核苷酸单元的至少一部分发生翻转 (flip-out)， 从而可以发出荧光。另外， 第一探针错配而第二探针匹配时， 第一探针的核苷酸单元从双链上发生更大的翻转， 从而可以发出强度更高的荧光。
     为使与突变位点对应的末端上具有所有可能存在的碱基， 准备多个第二探针， 由 此， 即使第一探针为一种， 也可以检测到全部的碱基突变。 这样的探针组可以特别优选用于 检测单核苷酸多态性。
     另外， 根据本发明， 还提供使用这样的探针组的单核苷酸多态性的检测方法。即， 该方法可以包括以下步骤 ： 准备作为可能包含单核苷酸多态性的基因表达产物的 RNA 样品 的步骤 ； 使用将选自所述探针组中的一种第一探针和一种第二探针组合得到的全部组合， 使第一探针和第二探针与 RNA 样品以能够杂交的方式进行接触的步骤 ； 和对所述 RNA 样品 与所述第一探针和所述第二探针的杂交产物中的所述第一探针的荧光信号进行检测的步 骤。
     RNA 样品可以通过公知的方法从各种被测物进行制备。 作为被测物， 可以是包括血 液在内的各种体液或组织等， 没有特别限定。
     RNA 样品与第一探针和第二探针的接触方式 ( 顺序 ) 没有特别限定。可以是同时 使第一探针和第二探针与 RNA 样品接触的方式， 也可以使第一探针接触后再使第二探针接 触。另外， 也可以使第二探针接触后再使第一探针接触。
     杂交的条件根据 RNA 样品和探针的种类进行适当确定。另外， 该检测方法中， 也可 以使用将第一探针和第二探针中的至少一部分固定在固相载体上的阵列。
     本发明的寡核苷酸也可以是具有茎 - 环结构的分子信标式的探针。即， 也可以是 以能够形成茎和环的方式设计碱基序列的探针。通过在该环中具有本发明的核苷酸单元， 碱基类似物部分从环中翻转， 容易发出荧光， 从而可以构建在非杂交时发出荧光、 在杂交时 荧光消失的探针。通过这样的探针， 可以容易地对杂交进行检测。
     从上述可知， 本发明的寡核苷酸通过以作为 siRNA 或反义子等发挥作用的方式进 行构建， 可以用作基因表达抑制剂。 另外， 本发明的寡核苷酸可以用作人类和非人类动物的 疾病的预防、 治疗用医药组合物的有效成分。例如， 对于伴随基因表达而产生的疾病， 作为 基因表达抑制剂而构建的本发明的寡核苷酸衍生物对预防和治疗这样的疾病有效。
     另外， 本发明的寡核苷酸， 利用其对 RNA 杂交的功能， 可以用作探针、 引物等杂交 试剂 ( 典型地为检验试剂或诊断试剂等 )。 由于以高选择性与 RNA 进行杂交， 因此可以特别 优选用于细胞内的 RNA 检测、 细胞内基因表达的实时检测。另外， 将这些寡核苷酸保持在芯 片或微珠等固相载体等上而得到的材料， 可以作为检验装置、 诊断装置或这些装置的一部 分使用。 另外， 这样的检验试剂或诊断试剂可以作为与其它试剂、 诊断试剂或装置等组合而 成的检验用或诊断用试剂盒来使用。
     本发明的寡核苷酸还可以以基因表达调控剂的形式用于人类和非人类动物细胞 中的基因表达抑制方法。另外， 本发明的寡核苷酸还可以以杂交试剂的形式用于从人类和 非人类动物取得的核酸样品中的特定基因或特定突变的检测方法。 实施例
    
    
    以下列举实施例具体地说明本发明， 但是本发明不限于这些实施例。 实施例 1 本实施例中通过以下的方案 3 合成三环性核苷类似物。另外， 用于取得上述方案 3 中的各个生成物 (1) ～ (10) 的试验条件如下所述。
     试剂与条件 ： (1) 丙二腈、 2- 丙醇、 90℃、 78％ ； (2) 对甲苯磺酰氯、 DMAP、 CH2Cl、 室 温、 83 ％ ； (3)K2CO3、 DMF、 60 ℃、 51 ％ ； (4)(i) 原甲酸三乙酯、 100 ℃ ； (ii)NH3/MeOH、 110 ℃、 65％ ； (5)80％的 CH3COOH、 60℃ ； (6)TBDMS、 咪唑、 DMF、 78％ ； (7) 苯甲酰氯、 吡啶、 87％ ； (8)
    TBAF、 THF、 77％ ； (9)4-4’ - 二甲氧基三苯甲基氯、 吡啶、 44％ ； (10)2- 氰基乙基二异丙基氯 代亚磷酰胺 (i-Pr2NP(Cl)OCE)、 Huning 碱、 CH2Cl2、 室温、 47％。
     (1)5- 氨基咪唑并 [4， 5-b] 嘧啶 -6- 甲腈的合成
     将 1.0g(8.3mmol) 嘌呤溶解在 60mL 2- 丙醇中， 加入 2.6g(39mmol， 4.7 当量 ) 丙 二腈， 在氩气气氛下、 在油浴中保持 90℃， 同时进行搅拌。( 黄色透明 ) 搅拌 99 小时后， 通 过 TLC 确认原料消失， 并冷却至室温。 ( 红葡萄酒色 ) 冷却至室温后， 溶液中出现结晶物， 因 此用冰水冷却的 2- 丙醇冲洗该结晶， 同时进行抽滤， 从而得到结晶物 (1)( 亮绿色 )。将得 到的结晶用真空泵干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 1.5g、 9.75mmol， 收率 58％ )。 1
     H NMR(400MHz， DMSO)δ ； 6.58(2H， s， 6-CH 和 8-CH)、 8.17(3H， s， 2-NH2， 9-NH)(2)2， 2- 二甲基 -4-( 对甲苯磺酰氢甲基 )-1， 3- 二氧戊环的合成
     向 1.3g、 1.2ml(10mmol) 的二甲基 -1， 3- 二氧戊环 -4- 甲醇中加入 3.7g(3.0mmol， 3.0 当 量 ) 干 燥 过 1 小 时 的 4- 二 甲 基 氨 基 吡 啶， 并 用 100mLCH2Cl2 溶 解。 之 后， 加入 2.3g(12mmol， 1.2 当量 ) 对甲苯磺酰氯后， 在初始的 30 分钟内浸于冷水中， 同时在室温、 氩 气气氛下进行搅拌 ( 无色透明 )。搅拌 18 小时后， 通过 TLC 确认原料消失， 用分液漏斗 ( 有 机溶剂 ： CDCl3) 分液， 并将油层用无水硫酸钠脱水。1 小时后， 进行棉塞过滤， 并用蒸发器浓 缩， 将所得物质通过硅胶柱层析 (CHCl3 → CHCl3 ∶ MeOH ＝ 100 ～ 10 ∶ 1) 分离出目标物， 得到油状液体 (2)( 浅黄色透明至无色透明 )。将得到的液体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产 量 1.85g、 8.3mmol， 收率 83％ )。 1
     H NMR(400MHz ， CDCl 3) δ ； 1.31(3H ， s， 2-CH 3) ， 1.34(3H ， d， 2-CH 3) ， 2.46(3H ， s， 4- 苯 甲 基 )， 3.72-3.82(1H， q， 4- 磺 酰 甲 基 )， 3.95-4.06(3H， m， 4 磺 酰 甲 基 )， 4.22-4.31(1H， m， 4-CH)， 7.27-7.37(2H， d， 5-CH2)， 7.76-7.84(2H， d， 4-1’ -CH2)
     (3)9-(4’ -4’ - 二甲基 -3’ ， 5’ - 二氧戊环 - 甲基 )-1- 甲腈 -2- 氨基嘌呤的合成
     向 0.7g(4.4mmol)5- 氨基咪唑并 [4， 5-b] 嘧啶 -6- 甲腈中加入 0.73g(5.3mmol， 1.2 当量 )K2CO3， 再干燥 1 小时。干燥后， 将 1.17g(5.3mmol， 1.2 当量 )2， 2- 二甲基 -4-( 对 甲苯磺酰氧甲基 )-1， 3- 二氧戊环溶解在 40ml DMF 中， 并将该溶液加入到之前的 5- 氨基咪 唑并 [4， 5-b] 嘧啶 -6- 甲腈和 K2CO3 的烧瓶中， 在氩气气氛下、 在油浴中保持 60℃， 同时进 行搅拌。( 浅红色 ) 搅拌 70 小时后， 确认原料消失， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： 乙酸乙酯 ) 分 液， 将油层用无水硫酸钠脱水。1 小时后， 进行棉塞过滤， 并用蒸发器浓缩， 将所得物质通过 硅胶柱层析 (CHCl3 → CHCl3 ∶ MeOH ＝ 100 ∶ 1) 分离出目标物， 得到白色固体 (3)( 产量 0.25g、 0.92mmol， 收率 21％ )。 1
     HNMR(400MHz， DMSO)δ ； 1.33(3H， s， 9-4’ -CH3)、 1.38(3H， s， 9-4’ -CH3)1.61(1H， s， 9-NH)、 3.69-3.73(2H， q， 9-6’ -CH2)、 4.08-4.12(2H， q， 9-6’ -CH2)、 4.16-4.21(2H， q， 9-1’ -CH2)、 4.29-4.34(2H， q， 9-1’ -CH2)、 4.43-4.49(1H， m， 9-2’ -CH)、 5.11(2H， s， 2-NH2)、 7.97(1H， s， 6-CH)、 8.07(1H， s， 8-CH)
     C13H15N5O2(MH+) 的 HRMS(FAB) 计算值 ： 273.12258， 测定值 ： 273.12291
     (4)13-(4’ -4’ - 二甲基 -3’ ， 5’ - 二氧戊环 - 甲基 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉的合成
     向 0.27g(1.0mmol)13-(4’ -4’ - 二甲基 -3’ ， 5’ - 二氧戊环 - 甲基 )-6- 氨基咪唑 并喹唑啉中加入 8mL 原甲酸三乙酯， 在油浴中保持 100℃， 同时进行搅拌 ( 无色透明 )。搅 拌 52 小时后， 通过 TLC 确认原料消失时物质开始发生破坏， 因此立即停止搅拌， 用蒸发器 减压除去溶剂进行浓缩 ( 深黄色 )。将浓缩物溶解于氨甲醇溶液 (NH3/MeOH) 中， 并转移至 100mL 的钢容器内， 在油浴中保持 110℃的同时进行搅拌。搅拌 121 小时后， 通过 TLC 确认 原料消失， 并用水流式蒸发器进行浓缩。将浓缩后的物质溶解于 (CHCl3 ∶ MeOH ＝ 5 ∶ 1) 中， 并加入二氧化硅， 通过用蒸发器浓缩使物质吸附在二氧化硅上。吸附后， 通过硅胶柱层 析 (CHCl3 ∶ MeOH ＝ 15 ∶ 1 → 10 ∶ 1) 分离出目标物， 得到深黄色固体 (4)。将得到的固 体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 0.15g、 0.499mmol， 收率 65.0％ )。 1
     HNMR(400MHz ， DMSO) δ ； 1.22(3H ， s， 12-4’ -CH 3) 、 1.27(3H ， s， 12-4’ -CH 3) 、 3.80-3.83(2H， q， 12-1’ -CH2)、 4.36-4.49(2H， q， 12-6’ -CH2)、 4.55-4.58(1H， m， 12-2’ -CH)、 7.98(2H， s， 2-NH2)、 8.47(1H， s， 2-CH)、 8.63(1H， s， 7-CH)、 9.03(1H， s， 11-CH)(5)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉的合成
     向 0.3g(1.0mmol)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉中加入 5mL80％稀释 乙酸， 在油浴中保持 60℃， 同时进行搅拌。 搅拌开始 9 小时后， 通过 TLC 确认反应进行后， 用 水流式蒸发器减压除去乙酸， 由此得到黄色固体 (5)。将得到的固体干燥过夜， 进行 NMR 测 定。 1
     HNMR(400MHz， DMSO)δ ； 1.22(1H， s， 13-2’ -1” -OH)、 1.27(1H， s， 13-3’ -1” -OH)、 3.93(2H， s， 13-1’ -CH2)、 4.11-4.17(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.45-4.50(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.88(2H， t， 12-3’ -CH2)、 5.13-5.15(1H， s， 13-2’ -CH)、 7.97(2H， s， 6-NH2)、 8.47(1H， s， 2-CH)、 8.59(1H， s， 7-CH)、 9.01(1H， s， 12-CH)
     C11H12N6O2·1/5H2O 元素分析计算值 ： C， 50.29 ； H， 4.74 ； N， 30.87.
     测定值 ： C， 50.37 ； H， 4.87 ； N， 30.89.
     (6)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉的合成
     向 260mg(1.0mmol)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并喹唑啉中 加入 10ml DMF、 544mg(8.0mmol， 8.0 当量 ) 咪唑、 600mg(4.0mmol， 4.0 当量 ) 叔丁基二甲基 氯硅烷， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌 ( 深黄色透明 )。 搅拌开始 18 小时后， 通过 TLC 确认 目标物消失， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： 乙酸乙酯 ) 分液 (NaHCO3×3 →饱和食盐水 ×1) 后， 用 无水硫酸钠脱水 1 小时。 脱水后， 用蒸发器浓缩， 通过硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 20 ∶ 1 ～ 10 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到白色固体 (6)。用真 空泵将得到的固体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 380mg、 0.78mmol， 收率 77.7％ )。 1
     HNMR(400MHz ，DMSO) δ ； -0.71(3H ，s ， 13-3’-2”-CH 3 ) 、-0.23(3H ，s ， 13-2’ -2” -CH3)、 -0.01(6H， s， 13-2’ -2” ， 3’ -2” -2CH3)、 0.57(9H， s， 13-3’ -3” -3CH3)、 0.82(9H， s， 13-2’ -3’ ‘-3CH3)、 3.57(2H， s， 13-1’ -CH2)、 3.58(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.16(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.19(2H， t， 12-3’ -CH2)、 4.38-4.40(1H， w， 13-2’ -CH)、 7.92(2H， s， 6-NH2)、 8.39(1H， s， 2-CH)、 8.50(1H， s， 7-CH)8.93(1H， s， 12-CH) +
     C23H40N6O2Si2(MH ) 的 HRMS(FAB) 计算值 ： 488.27514， 测定值 ： 488.27596
     (7)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉 的合成
     向 530mg(1.1mmol)13-(2’ -1” ， 4’ - 叔丁基二甲基硅烷 )-6- 氨基咪唑并 [1’ -苯 甲酰基 ] 喹唑啉中， 加入 20ml 吡啶、 0.11ml、 0.15mg(1.1mmol， 1.0 当量 ) 苯甲酰氯， 在氩 气气氛下、 在室温进行搅拌 ( 黄绿色透明 )。搅拌开始 2 小时后， 由 TLC 的结果可知苯甲 酰氯有不足的倾向， 因此追加 0.11ml、 0.15mg(1.1mmol， 1.0 当量 )。搅拌开始 7 小时后， 通过 TLC 确认目标物消失， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： CHCl3) 分液 (NaHCO3×2 →饱和食盐 水 ×1) 后， 用无水硫酸钠脱水 1 小时。脱水后， 用蒸发器浓缩， 通过硅胶柱层析 ( 展开溶 剂： CHCl3 → CHCl3 ∶ MeOH ＝ 10 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到淡 绿色固体 (7)。用真空泵将得到的固体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 557mg、 0.94mmol， 收 率 87.0％ )。 1
     HNMR(400MHz ，DMSO) δ ； -0.46(3H ，s ， 13-3’-2”-CH 3 ) 、-0.07(3H ，s ， 13-2’ -2” -CH 3) 、 0.09(6H ， s， 13-2’ -2” ， 3’ -2” -2CH 3) 、 0.79(9H ， s， 13-3’ -3” -3CH 3) 、 0.93(9H， s， 13-2’ -3’ ‘-3CH3)、 3.60-3.64(2H， s， 13-1’ -CH2)、 3.71-3.74(2H， q， 13-1’ -CH2)、4.24-4.25(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.67-4.72(2H， t， 12-3’ -CH2)、 4.38-4.40(1H， w， 13-2’ -CH)、 8.39-8.49(3H， q， 6-1’ -C6H5)、 7.51(1H， s， 2-CH)、 7.55(1H， s， 7-CH)、 7.60(1H， s， 12-CH)、 9.60(1H， s， 6-NH)
     (8)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ]- 喹唑啉的合成
     向 557mg(0.94mmol)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ]- 喹唑 啉中， 加入 20ml THF、 3.4g 3.76ml 1.0M 四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液 (3.76mmol， 4.0 当 量 )， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌 ( 黄绿色透明 )。搅拌开始 2 小时后， 通过 TLC 确认 目标物消失， 用蒸发器进行浓缩， 通过硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： CHCl3 ∶ MeOH ＝ 20 ∶ 1 ～ 7 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到淡绿色固体 (8)。用真空泵将得到 的固体干燥过夜， 进行 NMR 测定 ( 产量 265mg、 0.73mmol， 收率 77.3％ )。 1
     HNMR(400MHz， DMSO)δ ； 1.25(1H， s， 13-2’ -1” -OH)、 1.26(1H， s， 13-3’ -1” -OH)、 3.91(2H， s， 13-1’ -CH2)、 4.21-4.27(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.60-4.69(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.85-4.90(2H， t， 12-3’ -CH2)、 5.20-5.25(1H， s， 13-2’ -CH)、 7.60-7.79(3H， q， 6-1’ -C6H5)、 8.12(1H， s， 2-CH)、 8.60(1H， s， 7-CH)、 8.79(1H， s， 12-CH)、 9.42(1H， s， 6-NH)
     (9)13-[2’ - 羟基 -4’ -(4， 4’ - 二甲氧基三苯甲基 )]-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰 基 ] 喹唑啉的合成 向 260mg(0.71mmol)13-(2’ -4’ - 羟基 )-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉 中， 加入 240mg(0.71mmol， 1.0 当量 )4-4’ - 二甲氧基三苯甲基氯、 20mL 吡啶， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌。搅拌开始 2 小时后， 由 TLC 的结果可知 4-4’ - 二甲氧基三苯甲基氯有不 足的倾向， 因此追加 240mg(0.71mmol， 1.0 当量 )。搅拌开始 7 小时后， 根据 TLC 感觉反应不 再进行， 因此用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： CHCl3) 分液 ( 饱和 NaHCO3×2 →饱和食盐水 ×1) 后， 用无水硫酸钠脱水 1 小时。脱水后， 用蒸发器进行浓缩， 通过中性硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： CHCl3 ～ CHCl3 ∶ MeOH ＝ 50 ∶ 1) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由此得到淡黄色 固体 (9)( 产量 210mg、 0.314mmol， 收率 44.0％ )。 1
     HNMR(400MHz ，CDCl 3 ，D 2 O) δ ； 1.25(1H ，s ， 13-2’-1”-OH) 、 1.26(1H ，s ， 13-3’ -1” -OH)、 3.91(2H， s， 13-1’ -CH2)、 4.21-4.27(2H， q， 13-1’ -CH2)、 4.60-4.69(2H， q， 12-3’ -CH2)、 4.85-4.90(2H， t， 12-3’ -CH2)、 5.20-5.25(1H， s， 13-2’ -CH)、 7.60-7.79(3H， q， 6-1’ -C6H5)、 8.12(1H， s， 2-CH)、 8.60(1H， s， 7-CH)、 8.79(1H， s， 12-CH)、 9.42(1H， s， 6-NH)
     (10)13-[2’ -[(N， N- 二 异 丙 基 氨 基 ) 氧 膦 基 ]-4’ -(4， 4’ - 二甲氧基三苯甲 基 )]-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉的合成
     用 2ml CH2Cl2 溶解 135mg(0.20mmol)13-[2’ - 羟基 -4’ -(4， 4’ - 二甲氧基三苯甲 基 )]-6- 氨基咪唑并 [1’ - 苯甲酰基 ] 喹唑啉后， 加入 68μl(0.40mmol， 2.0 当量 )Huning 碱、 67μl(0.30mmol， 1.5 当量 )i-Pr2NP(Cl)OCE， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌。30 分钟 后， 通过 TLC 确认反应进行后， 停止搅拌。之后， 用分液漏斗 ( 有机溶剂 ： CHCl3) 分液 ( 饱和 NaHCO3×2 →饱和食盐水 ×1) 后， 用无水硫酸钠进行数分钟脱水处理。脱水后， 用蒸发器浓 缩， 通过中性硅胶柱层析 ( 展开溶剂 ： 乙酸乙酯 ) 分离出目标物， 用蒸发器减压除去溶剂， 由 31 此得到淡黄色化合物 (9)。 另外， 干燥后， 通过 P NMR 确认到目标峰 (149.1， 150.2ppm)( 产 量 122.1mg、 0.314mmol， 收率 47.0％ )。
     实施例 2
     在本实施例中， 使用实施例 1 中合成的酰胺体来合成寡核苷酸。
     使用 DNA 合成仪合成并纯化四种寡核苷酸， 在所述四种寡核苷酸的下述序列的 X 部分中引入有已合成的化合物 10 的酰胺体。另外， 以下的序列中， F-1 和 F-2 是志在形成 如分子信标那样的茎 - 环结构的序列， 序列的下划线部分为茎部分， 无下划线的部分为环 部分。
     F-15’ -d(TTC TGA CTT X TTT TCA GAA)-3’ (19 聚体 )
     F-25’ -d(TTC TGA CTA X ATT TCA GAA)-3’ (19 聚体 )
     F-35’ -d(AAG GAA AX GAG GAA AGA)-3’ (17 聚体 )
     F-45’ -d(AAG GAA XX GAG GAA AGA)-3’ (17 聚体 )
     另外， 通过合成仪进行偶联后， 将 CPG 悬浮于 1.2ml 28％的 NH4OH 中， 在恒温箱中 保持于 55℃的同时温育 12 小时。 将 CPG 悬浮液转移至微量离心管中， 再用 1ml 的 H2O ∶ MeOH ＝ 3 ∶ 1 溶液清洗两次， 用 SpeedVac 离心减压除去上清液的溶剂。减压后， 将其用 200μl 的上样溶液回收并进行电泳， 通过将目的条带与凝胶洗脱液共同搅拌， 将目标寡核苷酸洗 脱。用 Sep-pak C18 反相柱粗纯化洗脱液， 通过 SpeedVac 离心减压除去该洗脱液。
     使用 MALDI-TOF/MS 对寡核苷酸进行定量。 结果示于下表中。 根据 TOF/MS 的结果， 判断出 F-1、 F-3、 F-4 为目标寡核苷酸。没有记录 F-2 的测定值是因为其 OD 值极其微量， 不 能进行检测。
     表1
     通过 MALDI-TOF/MS 得到的寡核苷酸的定量结果
    编号 F-1 F-2 F-3 F-4
    
    序列 5′ -d(TTC TGA CTT X TTT TCA GAA)-3′ 5′ -d(TTC TGA CTA X ATT TCA GAA)-3′ 5′ -d(AAG GAA AX GAG GAA AGA)-3′ 5′ -d(AAG GAA XX GAG GAA AGA)-3′观察值 5779.9 5365.3 5380.6计算值 5774.01 5792.02 5365.01 5373.99实施例 3F-3、 F-4 的热稳定性评价 ： 测定 Tm
     在本实施例中， 用 Tm 值评价 F-3、 F-4 与各自互补的 DNA 和 RNA 形成的双链的热稳 定性。另外， 将 Tm 测定中的各链溶解在 200μL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使其浓度为 3μM， 在 95℃下退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟 的脱气。从该样品中取 150μL 放入专用区域 ( セル ) 内进行测定。F-3、 F-4 和互补 DNA、 RNA 的序列记录在下表中。
     表2
    寡核苷酸序列F-3 F-4 互补 DNA 互补 RNA
    5’ -d(AAG-GAA-AQ-GAG-GAA-AGA)-3’ 5’ -d(AAG-GAA-QQ-GAG-GAA-AGA)-3’ 3’ -d(TTC-CTT-XX-CTC-CTT-TCT)-5′ 3’ -r(UUC-CUU-XX-CUC-CUU-UCU)-5’※ 表中的 Q 表示三环性类似物， 互补 DNA 的 XX 表示 TA、 TT、 TG、 TC， 互补 RNA 的 XX 表示 UA、 UU、 UG、 UC。
     如图 10 和图 11 所示可知， 任何一种探针与 DNA 形成的双链都很不稳定， 与此相 对， 与 RNA 互补的情况下， 类似物的数量增加时双链的热稳定性反而上升。
     实施例 4
     F-1 的热稳定性评价 ： 测定 Tm
     在本实施例中， 用 Tm 值评价 F-1 与各自互补的 RNA 形成的双链的热稳定性。 将 F-1 的 Tm 测定中的各链溶解在 200μL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使 其浓度为 3μM， 在 95℃下退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟的脱气。
     F-1 及其互补 RNA 的序列记录于下表中。
     表3
    寡核苷酸 F-1 互补链
    序列 5’ -d(TTC-TGA-CTT-Q-TTT-TCA-GAA)-3’ 5’ -r(UUC-UGA-AAA-X-AAG-UCA-GAA)-3’碱基数 19 聚体 19 聚体※ 表中的 Q 表示三环性类似物， 互补 RNA 的 X 表示 A、 U、 G、 C。另外， F-1 序列中的 下划线部分的序列表示茎部位， 中央的 5 聚体表示环部分。
     通过测定 50％解链温度 Tm， 来比较呈两条链状态的 F-1 与互补 RNA 的热稳定性。 解链曲线和 Tm 值如图 12 所示。
     如图 12 所示可知， 与探针内形成双链时相比， F-1 在与互补 RNA 形成双链时呈现 出极其良好的热稳定性。
     实施例 5
     三环性类似物的荧光特性和极性依存度的测定
     在本实施例中， 使用实施例 1 中合成的化合物 5 来评价三环性类似物的荧光特性。 取 1mg 量的化合物 5 溶解于 500μl DMSO 中。充分溶解后， 取 10μl 转移至新的微量离心 管中， 加入 990μl 蒸馏水。之后， 用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行荧光测定。激发波 长、 荧光波长示于图 13 中。另外， 取 1mg 量的化合物 (5)， 充分溶解于 500μl DMSO 后， 向 三个新的微量离心管中各转移 10μl， 并分别加入 990μl 的 H2O( 蒸馏水 )、 干燥 MeOH、 干燥 CHCl3， 制成三种样品。将各样品分别转移至荧光比色皿中， 用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行荧光测定。照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲线如图 14所示。 如图 13 所示可知， 化合物 5 在约 338nm 处吸收光， 并发出约 400nm 的荧光。另外， 如图 14 所示可知， 在蒸馏水中发出的荧光最强， 在甲醇中也发出荧光， 在氯仿中不发出荧 光。
     实施例 6
     结合有三环性类似物的 CPG 的合成
     在本实施例中， 制作结合有三环类似物的 CPG 单元 (11)。即， 将 143mg(0.21mmol) 化合物 (9) 溶解于吡啶 (2mL) 中， 加入 0.5μg(4.2μmol， 0.02 当量 )DMAP、 63mg(0.63mmol， 3.0 当量 ) 无水琥珀酸， 在氩气气氛下、 在室温进行搅拌。110 小时后， 通过 TLC 确认反应 不再进行， 用乙酸乙酯稀释， 用水 (×2)、 NaHCO3(×1)、 饱和 NaCl 水溶液 (×1) 进行萃取、 洗涤， 并用乙酸钠干燥， 除去溶剂。然后， 溶解于 DMF(4mL) 中， 并将 0.62g(0.047mmol， 1.0 当量 )CPG 溶于反应液中， 加入 36mg(0.188mmol， 4 当量 )WSC。在室温下振荡两天， 之后， 用 吡啶洗涤， 干燥后加入 1.5mL 无水乙酸、 13.5mL 吡啶、 0.183g DMAP[ 吡啶∶ Ac2O(9 ∶ 1) 中 DMAP 为 0.1M]， 在室温下振荡 15 小时。按照吡啶、 MeOH 和丙酮的顺序依次更换洗涤液进行 洗涤， 并干燥。结果， 以 31.2μmol/g 的活性得到生成物。另外， 活性通过以下方式计算 ： 将 6mg 干燥后的 CPG 树脂装载到玻璃过滤器上， 使 HClO4 ∶ EtOH ＝ 3 ∶ 2 的溶液流过， 求出该 滤液在波长为 UV498nm 处 (DMTr 基团的波长 ) 的吸光度， 并代入下式中。
    
    实施例 7
     末端插入有三环性类似物的寡核苷酸 (FK-1、 FK-3 的合成 )
     在本实施例中， 使用 DNA 合成仪合成并纯化一种寡核苷酸 (FK-1)， 其中， 在下述碱 基序列的 X 部分 (3’ 末端 ) 引入有合成的 CPG 单元 (11)( 荧光性类似物 Q)。另外， 合成并 纯化了包含以下靶序列的 RNA 和 DNA( 代替尿嘧啶以胸腺嘧啶为碱基 )。另外， 还合成并纯 化了在 FK-2 序列的 5’ 末端的 N 上分别插入有 dA、 dT、 dG、 dC 的四种寡核苷酸。另外， 本实 施例中使用的以下靶序列 (RNA) 含有作为药物转运蛋白 MDR1(P- 糖蛋白 ) 的基因多态性的 一种的 2677G/A/T(2677 位与 Y 相当 )
     靶 RNA ： 5’ -r(GAC-UCA-CCU-UCC-CAG-X
     -ACC-UUC-UAG-UUC-UUU)-3’ (31 聚体 )
     FK-1 ： 5’ -d(AAA-GAA-CTA-GAA-GGT-Q)-3’ (16 聚体 )
     FK-2 ： 5’ -d(Y-CTG-GGA-AGG-TGA-GTC)-3’ (16 聚体 )
     另外， 使用 DNA 合成仪时， 进行与实施例 2 同样的操作， 从而获得纯化的寡核苷酸。
     实施例 8
     两种探针与靶链的杂交和荧光测定之一
     将实施例 6 中合成的 FK-1、 FK-2(Y:dA、 dT、 dG、 dC 四种 ) 和靶 RNA 链 (X:rU) 这三 种寡核苷酸溶解在 1mL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使各链的浓度 为 3μM， 在 95℃退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟的脱气。将总计四种 杂交样品以及仅有 FK-1 的样品转移到荧光比色皿中， 用荧光分光装置 ( 日立 -F4500) 进行
     荧光测定。照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲线图如图 15 所 示。
     如 图 15 所 示， 在 与 靶 链 的 X(rU) 分 别 互 补 的 FK-1 和 FK-2(Y:dA) 的 杂 交 样 品 中， 显示出最强的荧光， 其它杂交样品与仅有 FK-1 的样品基本同等。即， 认为将 FK-1 和 FK-2(Y:dA) 作为针对靶链的探针使用时， 通过 FK-1 和 FK-2 的竞争， 如图 9 所示， 作为荧光 性类似物碱基的 Q 从双链上翻转， 发出荧光。另外， 在其它杂交样品中， 各 FK-2 探针不是与 FK-1 竞争的探针， 因此荧光性碱基 Q 不从双链上翻转， 因而不呈现荧光。
     实施例 9
     两种探针与靶链的杂交和荧光测定之二
     将实施例 6 中合成的 FK-1、 FK-2(Y:dA、 dT、 dC 三种 ) 和靶 RNA 链 (X:rU、 rG、 rA) 以预定的组合溶解在 1mL 测定用缓冲液 (10mM 磷酸钠 (pH7.0)-100mM NaCl) 中使三种寡核 苷酸的链浓度分别为 3μM， 在 95℃退火 3 分钟后， 放置 1 小时回到常温， 并进行 15 分钟的脱 气。将总计四种杂交样品以及仅有 FK-1 的样品转移到荧光比色皿中， 用荧光分光装置 ( 日 立 -F4500) 进行荧光测定。照射激发光 (λex ＝ 338nm) 时各自的荧光波长和荧光强度的曲 线如图 16 所示。
     如图 16 所示， 使 FK-1 和 FK-2(Y:dC) 与靶链 (X:rG) 杂交时， 靶链与 FK-2 进行强 杂交 (GC 碱基对 )， 结果， FK-1 的荧光性碱基 Q 剧烈地翻转， 发出最强的荧光。其次， 使 FK-1 和 FK-2(Y:dT) 与靶链 (X:rA) 杂交时， 靶链与 FK-2 进行杂交， 结果， FK-1 的荧光性碱基 Q 发 生翻转， 发出强荧光。另外， 在与靶链的 X(rU) 分别互补的 FK-1 和 FK-2(Y:dA) 的杂交样品 中， 发出次于上述的荧光。
     从以上可知， 通过在与靶 RNA 中的 X 对应的位置 (5’ 末端 ) 上， 使具有与作为 X 可 能存在的碱基互补的普通碱基的探针 (FK-2)、 和在与 X 对应的位置 (3’ 末端 ) 上具有荧光 性碱基 Q 的探针 (FK-1) 进行杂交， 根据荧光性碱基 Q 翻转的程度， 荧光强度会不同， 因此， 利用这一点， 可以检测靶 RNA 中的 X 碱基。
     序列表自由文本
     序列编号 1 ～ 7、 9、 10 ： 合成寡核苷酸26CN 101970443 A
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