采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械及采集方法.pdf

本发明涉及一种用于采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械及采集方法，器械包括冲卵器和集卵管。冲卵器是长200-300mm、外径1.0-1.1mm、管壁0.08-0.1mm的胶质软管，软管的一端为9-12号针头，另一端与注射器连接。集卵管长130-140mm、壁厚0.8-1.1mm、内径3-4mm，中间弯成120°-140°角。进行采集猪早期胚胎或卵母细胞时，首先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后将吸有15-20ml冲卵液、5-10ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头从宫管结合部子宫角端插入输卵管5-8mm，再实施冲卵。本发明显著提高了采集的成功率和效率。

1.  采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械，其特征在于：包括冲卵器和集卵管；冲卵器是长200-300mm、外径1.0-1.1mm、管壁0.08-0.1mm的胶质软管，软管的一端为9-12号针头，软管的另一端为与普通注射器连接的接口；
集卵管是长130-140mm、壁厚0.8-1.1mm、内径3-4mm的管，中间弯成120°-140°角。

2.  根据权利要求1所述的采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械，其特征在于：集卵管是玻璃管、塑料管或胶管，两端烧制、研磨平滑。

3.  采集猪早期胚胎或卵母细胞的方法，母猪麻醉保定后手术切口，将输卵管和卵巢引出切口之外；其特征在于：首先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后将吸有15-20ml冲卵液、5-10ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头从宫管结合部子宫角端插入输卵管5-8mm；再实施冲卵。

采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械及采集方法
技术领域
本发明涉及一种用于采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械及采集方法，属于动物胚胎工程领域。
背景技术
猪早期胚胎的采集和移植最早于1951年由Kvashickii报道。到20世纪60年代，已经基本建立了外科手术方法采集和移植胚胎的技术。到70年代以后，北美和欧洲开始将采集和移植胚胎的技术应用于向闭锁猪群引进外血和国际间的引种。80年代转基因动物技术的出现，使这项技术的应用得到扩展。1985年Hammer等人，首先用手术的方法采集猪的受精卵，然后将人生长激素基因应用显微注射技术注入猪的受精卵原核，再将其移入母猪的输卵管，得到转基因猪。这之后，向受精卵内注射外源基因，便成为制备转基因猪的主要方法之一。此外，用病毒感染法制备转基因猪，也需要首先采集猪的早期胚胎，然后将连接有外源基因的病毒载体注入早期胚胎，生产转基因猪。
猪卵母细胞的采集主要应用于通过体外受精技术制备“试管猪”，通过核移植技术制备“克隆猪”，通过核移植技术和转基因技术相结合制备“转基因克隆猪”和其它遗传修饰的猪。
应用体外受精技术生产出“试管猪”最早由Cheng和Polge于1983年报道，由此建立的猪胚胎体外生产技术被世界上其它研究和生产机构所应用，并得以发展。实施猪体外受精，首先要获得猪的卵母细胞。其卵母细胞的来源有二：一是体外成熟的卵母细胞，从卵巢上采集未成熟的卵母细胞，经体外培养成熟后，用于体外受精；二是体内成熟的卵母细胞。本发明用于猪体内成熟卵母细胞的采集。成熟的卵母细胞在体外的适宜环境下与获能的猪精子结合，即为体外受精卵；再于体外的适宜环境下培养成早期胚胎，移植给受体母猪，怀孕后产仔，即为“试管猪”。
应用胚胎细胞作为核供体获得“克隆猪”最早由Polejaeva和Onishi于1989年报道，应用体细胞作为核供体获得“克隆猪”则最早由Prather和Onishi于2000年报道。“克隆猪”的制备，首先对成熟的卵母细胞进行去核，然后将分离的胚胎细胞或体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合(或其它方法的融合)处理，体外培养，再移入母猪的生殖道内，生产出来的仔猪即为“克隆猪”。转基因克隆猪的制备，需首先对体细胞进行基因转化，然后用转基因的细胞做为核供体，获得转基因克隆猪。Park等人(2001，2002)用转染绿色荧光蛋白基因的成纤维细胞和耳上皮细胞做核供体，分别得到转基因克隆猪。克隆技术和转基因克隆技术是猪遗传改良最具前景的手段。制备“克隆猪”和“转基因克隆猪”，其卵母细胞的来源与体外受精一样，有体内成熟和体外成熟两种。实验表明，用体内成熟的猪卵母细胞做核受体，比体外成熟的卵母细胞有较高的成功率。
我国最早建立猪早期胚胎和卵母细胞采集技术的是湖北省农科院魏庆信等人，1989年他们将采集的猪早期胚胎移入受体母猪的输卵管内，得到胚胎移植的后代；这之后，将十余种外源基因导入猪的受精卵，得到了相应整合并表达的转基因猪；赵浩斌等人1997年将早期胚胎的卵裂球移入去核卵母细胞，得到核移植后代。中国农科院畜牧研究所冯书堂等人，于1990年建立了猪早期胚胎的采集和移植技术，并得到胚胎移植的仔猪。进入21世纪以来，中国农业大学、东北农业大学、上海农科院畜牧兽医研究所等单位，应用核移植和转基因技术，获得克隆猪或转基因克隆猪。
国内外采集猪早期胚胎和体内成熟卵母细胞已有技术的特征是：从输卵管冲卵时，注射器与针头直接相连(中间没有软管连接)，针头从宫管结合部的输卵管端插入输卵管；集卵管一般是直的、没有弯曲。该技术的缺陷主要有三点：
1、在冲卵过程中，推动注射器时，由于注射器与针头是硬性连接，操作者稍有抖动或猪稍有骚动，针头容易划破、划穿或脱出输卵管，从而造成输卵管出血或冲卵失败。
2、由于针头从宫管结合部的输卵管端插入输卵管，一是容易出血；二是容易刺穿输卵管；三是如果第一次冲卵失败，不能再从相同的位置第二次插入针头，需重新选择一个部位插针，从而增加输卵管的伤口，也不容易找到合适的部位。
3、由于集卵管是直的，集卵皿摆放的位置受到术部狭小的局限，接卵时稍有不慎，或猪稍有骚动，冲卵液容易流到集卵皿之外，或集卵皿内的冲卵液泼洒，造成冲卵率降低或冲卵失败。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械及采集方法，能有效地克服已有技术的缺陷，大大提高采集的成功率，获卵率可达95％以上，且操作方便、安全。
本发明的技术方案是：采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械，其特征在于：包括冲卵器和集卵管；冲卵器是长200-300mm、外径1.0-1.1mm、管壁0.08-0.1mm的胶质软管，软管的一端为9-12号针头，软管的另一端为与普通注射器连接的接口；
集卵管是长130-140mm、壁厚0.8-1.1mm、内径3-4mm的管，中间弯成120°-140°角(软管可以不用弯曲)，两端烧制、研磨平滑。
如上所述的采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械，其特征在于：集卵管是玻璃管或其它质地的管(如塑料管、胶管等)，两端烧制、研磨平滑。
采集猪早期胚胎或卵母细胞的方法，母猪麻醉保定后手术切口，将输卵管和卵巢引出切口之外；其特征在于：首先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后将吸有15-20ml冲卵液、5-10ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头从宫管结合部子宫角端插入输卵管5-8mm；再实施冲卵。
本发明的有益效果是：本发明有效地克服了已有采集猪早期胚胎及体内成熟卵母细胞技术的缺陷：
(1)由于冲卵器为胶质软管，向输卵管插入针头时，克服了与注射器直接连接的局限，操作自如，能将针头确实插入输卵管的内腔；在冲卵过程中，即使操作者稍有抖动或猪稍有骚动，由于软管的缓冲作用，也不会出现针头划破、划穿或脱出输卵管的现象，从而大大提高冲卵的成功率。
(2)由于冲卵器的针头从宫管结合部子宫角端插入输卵管，可有效地避开血管，不引起输卵管出血；也不会刺穿输卵管；如果第一次冲卵失败，由于子宫角端面积较大，很容易重新选择插针的部位，不造成输卵管的创口。
(3)由于集卵管有弯曲，集卵皿可摆放的位置增大，局限性小，即使有时接卵不慎或猪稍有骚动，集卵皿可随之移动，不会造成冲卵液流到集卵皿之外，或集卵皿内的冲卵液泼洒的现象。
附图说明
图1为本发明实施例冲卵器示意图。
图2为本发明实施例集卵管示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
图1中标记的说明：1-针头，2-软管，3-接口。
如图1和图2所示，本发明实施例用于采集猪早期胚胎或卵母细胞的器械，包括冲卵器和集卵管；冲卵器是长200-300mm、外径1.0-1.1mm、管壁0.08-0.1mm的胶质软管2，软管2的一端为9-12号针头1，软管2的另一端为与普通注射器连接的接口3。集卵管是长130-140mm、壁厚0.8-1.1mm、内径3-4mm的玻璃管(或其它质地的管，如塑料管，胶管等)中间弯成120°-140°角，两端烧制、研磨平滑。冲卵器冲洗干净后自然干燥，用前在紫外灯下灭菌。集卵管冲洗干净后在高压灭菌锅内消毒。
本发明实施例用于采集猪早期胚胎或卵母细胞时，首先将本发明实施例的集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后将吸有15-20ml冲卵液、5-10ml空气的注射器与本发明实施例的冲卵器连接，冲卵器的针头1从宫管结合部子宫角端插入输卵管5-8mm；再实施冲卵。
具体步骤如下：
(1)采集猪早期胚胎的方法：母猪配种后的24-48小时之内，麻醉保定后手术切口，将输卵管和卵巢引出切口之外；先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后将吸有15-20ml冲卵液、5-10ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头1从宫管结合部子宫角端插入输卵管5-8mm；推动注射器，输卵管内的胚胎与冲卵液一起流经输卵管，从集卵管流入集卵皿。冲卵完毕，小心将冲卵器和集卵管退出，复原输卵管伞，按常规缝合创口。
(2)采集猪卵母细胞的方法：母猪发情后不配种，待发情结束的12小时之内，麻醉保定后手术切口，将输卵管和卵巢引出切口之外；先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后将吸有15-20ml冲卵液、5-10ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头1从宫管结合部子宫角端插入输卵管5-8mm；推动注射器，输卵管内的卵母细胞与冲卵液一起流经输卵管，从集卵管流入集卵皿。冲卵完毕，小心将冲卵器和集卵管退出，复原输卵管伞，按常规缝合创口。
实施例1优良种猪的胚胎采集和移植
以优良纯种母猪做供体，以不能做种用的杂交母猪做受体，将供体母猪的胚胎移植给杂交母猪受体，目的在于用杂交母猪生产优良纯种猪。其操作步骤如下：
1、供体母猪的超数排卵和配种
在供体母猪发情周期的第15-18天，肌肉注射孕马血清促性腺激素PMSG1000IU，72小时后注射绒毛膜促性腺激素HCG 800IU，做超数排卵处理。发情后用本品种公猪配种。
2、受体母猪的同期发情
在受体母猪发情周期的第15-18天，在供体母猪超数排卵处理的同时，肌肉注射PMSG 800IU，72小时后注射HCG 600IU。
或者在大群内选择与供体母猪同一天发情的母猪做受体。
3、供体母猪胚胎的采集
在供体母猪配种后的24-48小时之内，采集胚胎。
(1)供体猪的麻醉和保定
供体猪上腭牵拉，限制活动，按20-30mg/kg(每公斤体重毫克)戊巴比妥钠(2.5％)耳静脉注射，进行全身麻醉。麻醉到位后仰放在手术保定架上，四肢固定。为防止手术过程中，猪的挣扎、弹动，要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠。为使腹腔内脏向前倾斜，方便手术，手术台要前低(头低)后高(尾高)。手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
(2)手术部位及其消毒
用肥皂水和毛刷洗刷腹部和大腿内侧部，水洗后用毛巾揩干净。手术部位一般选择在倒数第2、3个乳头之间，先用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，用清水洗净术部，然后涂以2-4％的碘酒，待干后再用70％-75％的酒精棉脱碘，消毒程序是：碘酊棉球→酒精棉球，由内向外；盖创巾于术部，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
(3)手术方法
沿腹中线，尽量避开血管，切开皮肤5-8cm左右，沿着切口左右钝性分离脂肪和肌肉层，使腹膜露出后，用钝头剪刀剪开腹膜。切开腹膜应避免损伤腹内脏器，先用镊子提起腹膜，在提起部位作一切口，然后用另一只手的食指深入腹膜引导手术刀(向外切口)或用外科剪把腹膜切开或剪开。术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫角，摸到后用二指夹持，将输卵管和卵巢引出切口之外。
(4)采集胚胎
先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管15mm，另一端接集卵皿；然后将吸有15ml冲卵液、5ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头1从宫管结合部子宫角端插入输卵管5mm；推动注射器，输卵管内的胚胎与冲卵液一起流经输卵管，从集卵管流入集卵皿。冲卵完毕，小心将冲卵器和集卵管退出，复原输卵管伞，送回腹腔。再将另一侧输卵管和卵巢引出切口之外，用同样的方法冲取胚胎。脏器整理复位，清理切口，按常规缝合创口。
冲卵器长250mm、外径1.0mm、管壁0.1mm；集卵管是长135mm、壁厚1mm、内径3mm的玻璃管，中间弯成135°角，两端烧制、研磨平滑。
4、胚胎的收集及质量检查
将集卵皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎。猪胚胎直径为150μm左右，肉眼观察只有针尖大小，为一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带，它在冲卵液内的折光性比其他不规则组织碎片折光性强，色调为灰色。拣卵管先吸入少许磷酸缓冲液PBS再吸入卵，在集卵皿的不同位置冲洗卵3-5次。依次在第二个集卵皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个集卵皿，一只供体的卵放在一个皿内。操作室温为20-25℃。
将体视镜的放大倍数调至80-100倍，观察胚胎的形态、卵裂球大小与均匀度、色泽、细胞密度、与透明带间隙以及细胞变性等情况。正常发育的胚胎，其卵裂球一般外形整齐清晰，大小一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚胎日龄相一致。对发育正常的胚胎供移植，淘汰未受精卵及发育异常的胚胎。
5、胚胎移植
按照与供体母猪同样的方法，对同步发情的受体母猪进行麻醉、保定、实施手术，并将输卵管和卵巢引出创口之外。先将用于输卵管移植的外套管斜面端，从输卵管伞部插入输卵管的壶腹部；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管1公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入输卵管内。移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原输卵管和卵巢，送入腹腔，按常规缝合创口。
6、受体母猪的管理
移植后的受体母猪，最初几天，要注意每天两次注射抗菌素，防止创口感染。同时，要单栏饲养，以防止猪只之间打架，弄破伤口或流产。受体母猪的营养水平，按育种场怀孕母猪的日粮配合即可。怀孕中后期，注意补充青饲料，做好观察，待产。
实施例2转人血清白蛋白基因猪的制备
1、人血清白蛋白基因的准备
将构建好的人血清白蛋白基因质粒酶切成线性，用TE稀释液稀释为5μg/ml的基因溶液备用。
2、胚胎的采集
用实施例1同样的方法，对母猪进行超数排卵处理，发情后配种；在最后一次配种之后的24小时，进行手术，麻醉、保定、腹部开口，其过程同实施例1。术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面，循一侧子宫角导出输卵管，在输卵管末端转弯处找到该侧卵巢。先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管12mm，另一端接集卵皿；然后将吸有18ml冲卵液、6ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头1从宫管结合部子宫角端插入输卵管6mm；推动注射器，输卵管内的胚胎与冲卵液一起流经输卵管，从集卵管流入集卵皿。冲卵完毕，小心将冲卵器和集卵管退出，复原输卵管伞，送回腹腔。再将另一侧子宫角引出切口之外，用同样的方法冲取胚胎。
冲卵器长200mm、外径1.0mm、管壁0.08mm；集卵管是长130mm、壁厚0.8mm、内径3.5mm的玻璃管，中间弯成130°角，两端烧制、研磨平滑。
3、胚胎的收集及质量检查
方法同实施例1。收集1细胞期的原核胚。
4、基因的显微注射
原核胚以10000-15000r/min离心3-5min，能清楚地辨认原核。离心后的原核胚和准备好的人血清白蛋白基因溶液置于显微操作仪下，将吸有基因的注射针快速刺入原核中，注射2pl基因溶液，迅速退出注射针。每次注射15-20枚卵，培养，待移植。
5、注射基因胚胎的移植
采用自体移植的方式。该头母猪采集胚胎之后，仍置于手术台上，耳静脉点滴戊巴比妥钠(2.5％)或盐酸氯氨酮维持其麻醉状态。移植时，将输卵管和卵巢引出切口之外。先将用于输卵管移植的外套管斜面端，从输卵管伞部插入输卵管的壶腹部；然后将吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感觉到移卵管已穿过外套管1公分；最后将移卵管内的胚胎和培养液移入输卵管内。移植完毕，小心将移卵管和外套管退出，复原输卵管和卵巢，送入腹腔，按常规缝合创口。
6、移植后母猪的管理
移植后的母猪，最初几天，要注意每天两次注射抗菌素，防止创口感染。同时，要单栏饲养，以防止猪只之间打架，弄破伤口或流产。受体母猪的营养水平，按育种场怀孕母猪的日粮配合即可。怀孕中后期，注意补充青饲料，做好观察，待产。
7、转基因猪的整合检测
新生仔猪剪耳号取样，用酚氯仿法提取DNA，PCR检测，三次有与阳性对照一致大小的带者，初步确定为转基因仔猪。进一步用Southern杂交确认。
实施例3转EGFP基因克隆猪的构建
1、供细胞的准备
将转EGFP基因猪胎儿成纤维细胞冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴中小心震荡，使其迅速解冻；离心去除冻存液，用移液器加入2mL培养液，轻轻悬浮细胞。调整细胞密度到10⁶个/mL左右，在含0.5％胎牛血清的DMEM中进行48-72 h的血清饥饿培养。之后用胰蛋白酶消化并收集，在用于核供体之前放人改良的NCSU-23磷酸盐培养液中38.5℃悬浮贮存20-120min。
2、卵母细胞的准备
母猪发情后不配种，待发情结束的12小时之内，麻醉保定后手术切口，将输卵管和卵巢引出切口之外；先将集卵管的一端从输卵管伞口插入输卵管10mm，另一端接集卵皿；然后将吸有20ml冲卵液、8ml空气的注射器与冲卵器连接，冲卵器的针头1从宫管结合部子宫角端插入输卵管6mm；推动注射器，输卵管内的卵母细胞与冲卵液一起流经输卵管，从集卵管流入集卵皿。冲卵完毕，小心将冲卵器和集卵管退出，复原输卵管伞，按常规缝合创口。将集卵皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到卵母细胞。拣卵管先吸入少许磷酸缓冲液PBS再吸人卵，在集卵皿的不同位置冲洗卵3-5次。依次在第二个集卵皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个集卵皿，一只供体的卵放在一个皿内。操作室温为20-25℃。
冲卵器长300mm、外径1.0mm、管壁0.09mm；集卵管是长140mm、壁厚1.1mm、内径4mm的玻璃管，中间弯成140°角，两端烧制、研磨平滑。
3、卵母细胞的去核、移核和激活
收集到的卵母细胞用含有4g/L BSA的PBS(38℃)洗几遍，然后移人38℃不含钙的NCSU-23磷酸缓冲液中培养。在倒置显微镜下，在1点半或4点半位置，用激光破膜仪打孔，吸取核连同极体在内的三分之一胞质(盲吸去核)。
转EGFP基因的猪胎儿成纤维细胞，分离之后，在显微操作仪下，移入去核的卵母细胞。将移核细胞置于细胞融合仪内，用1.5KV/cm脉冲强度进行2次脉冲，置于NCSU-23磷酸缓冲液中，再放入39℃、5％CO₂、100％湿度培养箱中培养，得到发育的重构胚胎。
4、重构胚的移植
将重构胚移入同步发情的受体母猪输卵管内。移植方法及移植后母猪的管理同实施例1。
5、仔猪的检测
母猪产仔后，仔猪的耳、尾等部位在紫外灯下发出绿色荧光者，即为转EGFP基因克隆猪。进一步用PCR或Southern杂交确认。