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新的抗微生物化合物、其合成及其用于治疗哺乳动物感染的应用
    【技术领域】

    本发明涉及新的苯并噻嗪衍生物及其作为抗菌剂在由细菌引起的哺乳动物(人和动物)的感染性疾病特别是如由分枝杆菌(mycobacteria)引起的结核病(TB)和麻风病的疾病中的应用。

    背景技术

    噻嗪酮、其衍生物以及其作为抗菌剂(特别是针对分枝杆菌(TB))的应用，已经在例如AR 242567A1、AU 3704400A1、CA 1322551C1或EP 0245901B1中公开。

    众所周知，在全世界范围内，由对现有的治疗产生了抵抗性的分枝杆菌引起的结核病感染迅速增加(B.R.Bloom，J.L.Murray，Tuberculosis：commentary on areemergent killer.Science 1992，257，1055‑1064)。非常危险的情况是产生了具有多重耐药性(MDR)的分枝杆菌。其是对至少两种最具活性的结核病药物异烟肼和利福平，并且对链霉素、吡嗪酰胺和乙胺丁醇具有耐药性的分枝杆菌。在一些国家，MDR‑TB的比例已经高于20％。自从去年在南非诊断出首例XDR‑TB(极高度耐药性TB)以来，情况日趋严峻。现在XDR‑TB已经遍布全球。引起XDR‑TB的分枝杆菌对一线TB药物利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇具有耐药性，并且还对二线药物氟喹诺酮和氨基糖苷类具有耐药性(Nature Med.2007，13，295‑298)。随着TB疾病数量的广泛增加，其在世界范围内每年引起约2,000,000人死亡。

    为了治疗如(TB)或麻风病的疾病，迫切需要具有新的作用机制的新药物，特别是用于克服耐药性以及用于克服现有的药物的巨大副作用。

    【发明内容】

    本发明旨在产生具有抗分枝杆菌活性的新化合物，其作为潜在的结核病药物，用于克服与耐药性及药物不耐性(drug intolerance)有关的问题。

    【具体实施方式】

    通过提供式I化合物实现了本发明的目的

    

    其中，R¹和R²各自独立地为NO₂、NR⁷R⁸、NHOR⁹、COOR⁹、CN、CONR¹⁰R¹¹、CHO、F、Cl、Br、SO₂NR¹²R¹³、低级烷氧基、OCF₃、单‑、双‑或三氟甲基；

    R²和R⁴各自独立地为H、饱和的或不饱和的、直链的或支链的具有1‑3个链成员的脂肪烃基、F、Cl、Br、低级烷氧基；

    R⁵为H、饱和的或不饱和的、卤代的或非卤代的、直链的或支链的具有1‑7个链成员的脂肪烃基；

    R⁶为基团：

    

    其中，X为饱和的或不饱和、卤代的或非卤代的、直链的或支链的具有1‑5个链成员的脂肪烃基，或

    R⁵和R⁶一起表示以下二价基团，其中n为1‑4：

    

    R⁷‑R¹³各自独立地为H、或者饱和的或不饱和的、卤代的或非卤代的、直链的或支链的具有1‑5个链成员的脂肪烃基、苯基、苄基、或R⁷和R⁸一起、R¹⁰和R¹¹一起、R¹²和R¹³一起表示直链的或支链的具有1‑7个链成员的二价脂肪烃基；

    R¹⁴和R¹⁵各自独立地为H、直链的或支链的具有1‑5个链成员的脂肪烃基、F、Cl、Br、NO₂、NH₂、CF₃。

    在优选的实施方案中，本发明涉及选自由以下化合物所组成的组中的式(I)的化合物：

    2‑[4‑(2‑R¹⁴，5‑R¹⁵‑苯基)哌嗪‑1‑基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[4‑(2‑R¹⁴，6‑R¹⁵‑苯基)哌嗪‑1‑基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[4‑(3‑R¹⁴，5‑R¹⁵‑苯基)哌嗪‑1‑基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(甲基)氨基]‑8‑硝基‑6‑R²‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(R⁵)氨基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(R⁵)氨基]‑8‑硝基‑6‑R²‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(R⁵)氨基]‑8‑硝基‑6‑氯‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(R⁵)氨基]‑8‑硝基‑6‑氟‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(R⁵)氨基]‑8‑R¹‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，

    其中R¹、R⁵、R¹⁴和R¹⁵具有上述定义。本发明特别涉及选自由以下化合物组成的组中的至少一种化合物：

    2‑[4‑(4‑氯苯基)哌嗪‑1‑基]‑6，8‑二硝基‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[4‑(5‑氯‑2‑甲基苯基)哌嗪‑1‑基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑2‑{4‑[3‑(三氟甲基)苯基]哌嗪‑1‑基}‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(乙基)氨基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(甲基)氨基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[4‑(2‑氟苯基)哌嗪‑1‑基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑(4‑苄基哌嗪‑1‑基)‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑(苄基氨基)‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑{甲基[(1R)‑1‑苯基乙基]氨基}‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮、

    2‑[苄基(甲基)氨基]‑6‑氯‑8‑硝基‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮。

    使用四种不同的方法合成新的1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮衍生物。方法A、B和C采用已知的多取代2‑氯(溴)‑苯甲酰胺(benzcarboxamide)作为起始原料，其中许多已在文献中描述或可以通过类似方法容易地制备(Isaew S.G.Farm.Zh.(Kiev)，2000，52；Makosza M.，Nizamov S.Org.Prep.and Proced.Int.，1997，29，707；Nerin C.，TornesA.R.，Domento C.，Cacho J.J.Agr.and Food Chem.，1996，44，4009；Thiel W.，MayerR.，Jauer，E.‑A.，Modrow H.，Dost H.J.Prakt.Chem.，1986，328，497；Yokoyama M.，Yoshida S.，Imamoto T.Synthesis，1982，591；Romanowski J.，Eckstein Z.Pol.J.Chem.，1984，58，263；Nisato D.，Sacilotto R.，Frigerio M.，Boveri S.，Palmisano G.，Lesma G.Org.Prep.Proced，Int.，1985，17，75；Oikawa N.，Nakagawa Y.，Nishimura K.，Ueno T.，Fujita T.，Pestic.Sci.，1994，41，139；Welch D.E.，Baron R.R，J.Med.Chem.，1969，12，299；Fuller R.W.，Molloy B.B.，Day W.A.，Roush B.W.，March M.M.，J.Med.Chem.，1973，16，101以及许多其他文献)

    

    方法A

    于0‑50℃下，在醇、丙酮或它们的混合物中使起始原料2‑氯苯甲酰胺与1.0‑1.2等摩尔量的二硫代氨基甲酸的金属盐反应约四分之一小时至约24小时。优选地，该反应于室温条件下在醇中进行。反应混合物用水稀释并过滤出固体2‑二硫代氨基甲酰基苯甲酰胺。在下一步中可以使用粗产物或可以将其自合适的有机溶剂中重结晶。于50‑100℃下，在水、醇或水/醇混合物中用轻碱(light alkaly)(例如Na₂HPO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃等)处理2‑二硫代氨基甲酰基苯甲酰胺2‑36小时。优选地，本反应于50‑75℃下在醇/水混合物中进行约24小时。当反应完成时，通过常规的回收步骤如用乙酸乙酯研磨或用水稀释、过滤以及从合适的有机溶剂中重结晶从而获得2‑取代‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮。

    方法B

    本方法建议在苯并噻嗪酮的环化中使用过量的二硫代氨基甲酸金属盐作为轻碱，并且不分离2‑二硫代氨基甲酰基苯甲酰胺。因此，可以在20‑80℃下，在醇、丙酮或它们的混合物中用1.2‑2.5等摩尔量的二硫代氨基甲酸的金属盐处理起始原料2‑氯苯甲酰胺约3‑36小时。优选地，本反应于50‑75℃下，在醇或醇/水混合物中进行约24小时。通过方法A中的纯化步骤获得目标产物2‑取代‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮。

    方法C

    

    方法C

    本方法使用2‑氯苯甲酰胺作为起始原料。在20‑100℃的温度下，在不同的醇、丙酮、乙腈或其他合适的有机溶剂中，用1.1‑2.0倍过量的烷基黄原酸(alkylxantogenate)的金属盐例如可商购的乙基黄原酸钾处理这些化合物约半小时至约24小时。优选地，该反应于室温下在醇中进行约24小时。在乙酸、醇、乙酸乙酯、DMF、丙酮或乙腈中用相应的胺HNR⁵R⁶将分离得到的2‑烷氧基‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮处理多至48小时，使烷氧基完全转变为相应的胺。在反应完成后，可以将反应混合物蒸干并用水稀释或可以直接将其用水稀释。通过常规的分离步骤如过滤和从合适的有机溶剂中重结晶，可回收得到目标产物2‑NR⁵R⁶‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮。

    方法D

    也可以使用合成1，3‑苯并噻嗪‑4酮的典型方法：使硫氰酸盐与2‑氯芳基氯酸酐反应，随后使用相应的胺处理反应物料。该方法在科学文献中有描述，例如：J.Imrich，P.Kristian，Coll.Czech.Chem.Commun.，1982，47，3268‑3282；D.Koscik，P.Kristian，J.Gonda，E.Dandarova，Coll.Czech.Chem.Commun.，1983，48，3315‑3328；D.Koscik，P.Kristian，O.Forgac，Coll.Czech.Chem.Commun.，1983，48，3427‑3432；T.H.Cronin，H.‑J.E.Hess，Pat.US 3522247。

    出人意料的是，本发明的化合物显示出很强的抗菌活性，特别是抗分枝杆菌活性，通过典型方法测定，其对快速生长的分枝杆菌的最小抑菌浓度(MIC)在＜0.000012‑0.78μg/ml的范围内，对结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(包括多重耐药的菌株)的最小抑菌浓度在0.39‑3.12μg/ml的范围内，并且通过Alamar Blue法测定，对结核分枝杆菌H37Rv的最小抑菌浓度在2.0‑50.0ng/ml的范围内。出人意料的是，本发明的化合物仅对于分枝杆菌显示出高水平的选择性，可以显著地降低潜在的不良副作用。

    在SOS呈色测验(SOS chromotest)中，本发明的化合物在5mg/ml下是非致突变的(non‑mutagenic)(M.Isidori，M.Lavorgna，A.Nardelli，L.Pascarella，A.Parella，Sci.Total Environ.，2005，346，87‑98；M.Bombardier，N.Bermingham，R.Legault，A.Fouquet，Chemosphere，2001，42，93144；D.A.Widdick，D.I.Edwards，Mutat.Res.，1991，259，89‑93)。

    因此，本发明的化合物可用于治疗人和动物中的结核病感染以及其他分枝杆菌感染。

    因此，本发明涉及包含式I化合物的药物组合物。

    本发明还涉及式I化合物，其用于治疗哺乳动物中的细菌感染的方法中。

    用于所述方法中的优选的式I化合物是上文中具体列出的那些。

    本发明的化合物可以通过以下方法配制使用：在药学上可接受的水性、有机或水性‑有机介质中配制稀释溶液剂或混悬剂，用于通过静脉、皮下或肌肉注射进行局部或非胃肠道给药，或用于鼻内应用；或者使用常规的赋形剂制备成片剂、胶囊剂或水混悬剂形式，用于口服给药或作为栓剂。

    所述化合物可以以0.001‑1000mg/kg体重的剂量使用。

    以下实验部分中的实施例用于阐述本发明，但是不应理解为限制本发明。

    本发明化合物的结构通过合成方法和元素分析，以及核磁共振和质谱而确定。

    实施例

     起始原料

    化学试剂和溶剂购自Alfa‑Aesar(GB)或Aldrich Co.(Sigma‑Aldrich Company，St‑Louis，US)，未经进一步纯化即用于合成。熔点通过BP法测定，未经校正(Electrothermal 9001，GB)。如果分析仅通过元素符号表示，则分析结果在理论值的±0.3％范围内(Carlo‑Erba 5500，Italy)。NMR谱使用Varian Unity Plus 400(USA)测定。¹H NMR的化学位移以自TMS(δ)的低磁场位移ppm的形式记录。质谱使用Finnigan SSQ‑700(USA)设备通过直接注入获得。反应以及化合物的纯度通过使用Silicagel 60F₂₅₄铝板(Merck Co，Germany)的TLC进行控制。

     实施例1

    2‑[4‑(4‑氯苯基)哌嗪‑1‑基]‑6，8‑二硝基‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物1)

    将0.5g 2‑氯‑3，5‑二硝基苯甲酰胺溶于25ml乙醇中。用0.39g 4‑(4‑氯苯基)‑哌嗪二硫代氨基甲酸钠盐的二水合物处理反应混合物，并在室温下储存6小时。将反应混合物倒入50ml冷水中，并过滤所得黄色沉淀。自乙醇中重结晶后得到纯的最终产物。2‑甲酰氨基‑4，6‑二硝基苯基‑4‑(4‑氯苯基)哌嗪‑1‑二硫代羧酸酯是淡黄色结晶固体。产率68％。mp 178‑180℃。MS m/z 481(M⁺)。

    C₁₈H₁₆ClN₅O₅S₂的分析计算值：C，44.86：H，3.35；N，14.53；S，13.31

    实测值：C，44.71；H，3.36；N，14.62；S，13.35

    将0.5g 2‑甲酰氨基‑4，6‑二硝基苯基‑4‑(4‑氯苯基)哌嗪‑1‑二硫代羧酸酯溶于25ml乙醇中。用0.2g Na₂HPO₄×12H₂O处理反应混合物并回流6小时。在冰箱中冷却反应混合物，过滤淡黄色沉淀，并用50ml水和30ml甲醇洗涤。自乙醇中重结晶两次后得到纯的最终产物。2‑(1，4‑2‑[4‑(4‑氯苯基)哌嗪‑1‑基])‑6，8‑二硝基‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮为淡黄色结晶固体。产率38％。mp 279‑281℃(乙醇)。

    MS m/z447(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ9.08和8.95(2个1H，2个s，2CH)，6.88和6.71(2个2H，d，C₆H₄Cl)，3.68和3.30(两个4H，m，N(CH₂CH₂)₂N)ppm。

    C₁₈H₁₄ClN₅O₅S的分析计算值：C，48.27；H，3.15；N，15.04；S，7.16

    实测值：C，48.34；H，3.22；N，14.97；S，7.23

     实施例2

    2‑[4‑(5‑氯‑2‑甲基苯基)哌嗪‑1‑基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物2)

    使用2‑氯‑3‑硝基‑5‑三氟甲基苯甲酰胺作为起始原料，参照实施例1的步骤。淡黄色结晶固体。产率44％。mp 158‑161℃(DMF/水)。

    MS m/z 484(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.80和8.77(2个1H，2个s，2CH)，7.32(1H，s，CH)，9.95和6.73(2个1H，d，2个CH)，3.65和329(2个4H，m，N(CH₂CH₂)₂N)，2.29(3H，s，CH₃)ppm。

    C₂₀H₁₆ClF₃N₄O₃S的分析计算值：C，49.54；H，3.33；N，11.55；S，6.61

    实测值：C，49.45；H，3.40；N，11.47；S，6.83

     实施例3

    8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑2‑{4‑[3‑(三氟甲基)苯基]哌嗪‑1‑基}‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物3)

    使用2‑氯‑3‑硝基‑5‑三氟甲基苯甲酰胺作为起始原料，参照实施例1的步骤。淡黄色结晶固体。产率33％。mp 201‑203℃(乙醇)。

    MS m/z504(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.80和8.77(2个1H，2个s，2CH)，7.61(1H，s，CH)，7.39和7.03(2个1H，d，2个CH)，3.66和3.31(2个4H，m，N(CH₂CH₂)₂N)ppm。

    C₂₀H₁₄F₆N₄O₃S的分析计算值：C，47.62；H，2.80；N，11.11；S，6.36

    实测值：C，47.74；H，2.91；N，11.29；S，6.53

     实施例4

    2‑[苄基(乙基)氨基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物4)

    用2.0g苄基(乙基)二硫代氨基甲酸钠盐的二水合物处理1.2g 2‑氯‑3‑氨基‑5‑三氟甲基苯甲酰胺在45ml乙醇中的悬浮液，回流14小时。将暗红色反应混合物用70ml水稀释，在冰箱中冷却6小时，过滤淡黄色沉淀，并用50ml酯洗涤。经过柱色谱(己烷/丙酮3∶1)得到纯的最终产物。2‑[苄基(乙基)氨基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮为淡黄色结晶固体。产率40％。mp 94‑97℃。

    MS m/z 409(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.80和8.77(2个1H，2个s，2CH)，7.41‑7.25(5H，m，C₆H₅)，4.62(2H，s，CH₂)，3.43(2H，q，CH₂)，1.01(3H，t，CH₃)ppm.

    C₁₈H₁₄F₃N₃O₃S的分析计算值：C，52.81；H，3.45；N，10.26；S，7.83

    实测值：C，52.73；H，3.38；N，10.44；S，7.89

     实施例5

    2‑[苄基(甲基)氨基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物5)

    参照实施例4的步骤。淡黄色结晶固体。产率47％。mp 120‑124℃(乙醇/水)。

    MS m/z 395(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.81和8.77(2个1H，2个s，2CH)，7.40‑7.25(5H，m，C₆H₅)，4.64(2H，s，CH₂)，2.87(3H，q，CH₃)ppm.

    C₁₇H₁₂F₃N₃O₃S的分析计算值：C，51.64；H，3.06；N，10.63；S，8.11

    实测值：C，51.76；H，3.13；N，10.41；S，8.34

     实施例6

    2‑[4‑(2‑氟苯基)哌嗪‑1‑基]‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物6)

    参照实施例1的步骤。淡黄色结晶固体。产率37％。mp 164‑168℃(异丙醇)。

    MS m/z 454(M⁺)。

     ¹HNMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.81和8.77(2个1H，2个s，2CH)，6.76(3H，m，3CH)，6.11(1H，m，CH)，3.68和3.30(2个4H，m，N(CH₂CH₂)₂N)ppm.

    C₁₉H₁₄F₄N₄O₃S的分析计算值：C，50.22；H，3.11；N，12.33；S，7.06

    实测值：C，50.08；H，3.21；N，12.46；S，7.09

     实施例7

    2‑(4‑苄基哌嗪‑1‑基)‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物7)

    参照实施例4的步骤。黄色结晶固体。产率51％。mp 161‑163℃(乙醇/DMF)。

    MS m/z450(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.80和8.76(2个1H，2个s，2CH)，7.19‑7.28(5H，m，Ph)，3.48(2H，s，CH₂)，3.38和3.09(2个4H，m，N(CH₂CH₂)₂N)ppm.

    C₁₇H₁₈N₄O₇S的分析计算值：C，53.33；H，3.80；N，12.44；S，7.12

    实测值：C，53.29；H，4.01；N，12.48；S，7.06

     实施例8

    2‑(苄基氨基)‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物8)

    用1.75g乙基黄原酸钠处理2.5g 2‑氯‑3‑硝基‑5‑三氟甲基苯甲酰胺在25ml乙醇中的悬浮液，在室温下储存24小时。将反应混合物倒入50ml冷水中，并过滤所得黄色沉淀。自乙醇/水中重结晶后得到纯的2‑乙氧基‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，为白色结晶固体。产率58％。mp 146‑148℃。

    MS m/z320(M⁺)。

    C₁₁H₇F₃N₂O₄S的分析计算值：C，41.26；H，2.20；N，8.75；S，10.01

    实测值：C，41.34；H，2.22；N，8.87；S，10.27

    用0.4ml苄胺处理0.7g2‑乙氧基‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮在15ml乙酸中的溶液，并回流14小时。蒸干反应混合物，残留物用10ml水处理，过滤黄色沉淀并用50ml水洗涤。自乙醇/DMF中重结晶两次后得到纯的最终产物。2‑(苄基氨基)‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮为淡黄色结晶固体。产率73％。mp 192‑194℃。

    MS m/z 381(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ9.27(1H，宽s，NH)，8.80和8.75(2个1H，2个s，2CH)，7.74‑7.79(5H，m，Ph)，4.49(2H，s，CH₂)ppm.

    C₁₆H₁₀F₃N₃O₃S的分析计算值：C，50.39；H，2.64；N，11.02；S，8.41

    实测值：C，50.42；H，2.61；N，10.89；S，8.64

     实施例9

    2‑{甲基[(1R)‑1‑苯基乙基]氨基}‑8‑硝基‑6‑(三氟甲基)‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物9)

    参照实施例1的步骤。淡黄色结晶固体。产率54％。mp 110‑113℃(通过柱色谱纯化，丙酮/己烷5∶1)。

    MS m/z 409(M⁺)。

     ¹HNMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.82和8.76(2个1H，2个s，2CH)，7.84，7.43，7.15(5H，3m，Ph)，4.84(H，m，CH)，3.07(3H，s，NCH₃)，1.39(3H，d，CH₃)ppm.

    C₁₈H₁₄F₃N₃O₃S的分析计算值：C，52.81；H，3.45；N，10.26；S，7.83

    实测值：C，52.73；H，3.46；N，10.19；S，7.92

     实施例10

    2‑[苄基(甲基)氨基]‑6‑氯‑8‑硝基‑4H‑1，3‑苯并噻嗪‑4‑酮，(化合物10)

    参照实施例8的步骤。淡黄色结晶固体。产率64％。mp 138‑141℃(通过柱层析纯化，丙酮/己烷4∶1)。

    MS m/z 361(M⁺)。

     ¹H NMR(DMSO‑d₆/CDCl₃)δ8.37和8.23(2个1H，2个s，2CH)，7.45‑7.35(5H，m，Ph)，4.62(2H，2，CH₂)，2.87(3H，s，CH₃)ppm.

    C₁₆H₁₂ClN₃O₃S的分析计算值：C，53.11；H，3.34；N，11.61；S，8.86

    实测值：C，53.19；H，3.30；N，11.52；S，8.89

     实施例11

    本发明的化合物对分枝杆菌的体外抑制活性的测定。

    按照NCCLS指南[National Committee for Clinical Laboratory Standards：Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically；5^th Ed.；Villanova，Ed.；Approved standard Document M7‑A5.NCCLS，(2000)]，通过在Mueller‑Hinton肉汤(Difco)中进行肉汤微稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，从而测试化合物对耻垢分枝杆菌SG 987(Mycobacterium smegmatis SG 987)、金色分枝杆菌SB66(M.aurum SB66)、母牛分枝杆菌IMET 10670(M.vaccae IMET 10670)和偶发分枝杆菌B(N.fortuitum B)的抗菌活性。结果列于表1中。

    表1：通过最小抑菌浓度MIC[μg/ml]确定的式I化合物的抗微生物活性

       化合物  耻垢分枝杆菌  MIC[μg/ml]  母牛分枝杆菌  MIC[μg/ml]  偶发分枝杆菌  MIC[μg/ml]  1  0,78  0,0062  0,78  2  0,05  0,008  0,031  3  0,04  0,0031  0,0031  4  0,0062  0,0008  0,0062  5  0,0156  0,0005  0,0156  6  0,005  0,005  0,005  7  0,05  0,05  0,05  8  0,00078  ＜0,0000121  0,00078  9  ＜0,0000121  ＜0,0000121  ＜0,0000121  10  0,0062  0,00031  0,00156

     实施例12

    通过下述方法测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，以测试抗结核分枝杆菌H37Rv的活性：

    将菌株接种在固体Lowenstein‑Jensen培养基上。21天后，将生长的培养物按照5×10⁸微生物细胞/ml制备成接种物悬浮液。用0.2ml上述悬浮液对包含相应浓度(100.0至0.195μg/ml)的所研究的化合物的2ml液体Shkolnikova培养基的试管进行接种。在37℃下温育14天后，将包含液体培养基的试管在3000RPM的条件下离心15min。弃去上层清液，将沉淀在0.8ml无菌0.9％NaCl中再悬浮。使用0.1ml悬浮液制备涂片，随后通过Ziehl‑Neelsen法染色。将剩余的沉淀以0.2ml的体积接种到3个包含固体不含药物的Lowenstein‑Jensen培养基的试管中，以测定最小杀菌浓度(MBC)。在37℃下培育21‑28天后读取结果。对照组为使用未经所研究的试剂处理的测试菌株培养的试管。

    药物的最小杀菌浓度(MBC)被认为是完全抑制分枝杆菌在固体培养基上生长的药物浓度。细菌抑制作用(MIC)的特征在于，与对照组相比，涂片上仅存在个别分枝杆菌，以及生长在固体培养基上的菌落的数量大幅下降。结果列于表2中。

    表2：通过最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)确定的式I化合物对结核分枝杆菌H37Rv以及临床分离菌HSRE耐药菌株和XTB菌株的抗微生物活性

    

    HSRE：多重耐药性菌株

    XTB：极高耐药性菌株

     实施例13

    还通过刃天青还原分析法(MIC₉₆)测定抗结核分枝杆菌H37Rv活性。本方法在下文中详细描述：P.Quillardet，O.Huisman，R.D′Ari，M.Hofnung，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1982，79，5971‑5；J.C.Palomino，A.Martin，M.Camacho，H.Guerra，J.Swings，F.Portaels，Antimicrob.Agents Chemother.，2002，46，2720‑2。结果列于表3中。

    表3：通过最小抑菌浓度(MIC)[ng/ml]确定的式I化合物的抗分枝杆菌活性。

       化合物  结核分枝杆菌H37Rv(ng/ml)  4  2  5  3  8  50  9  0.4  10  25  INH  125