异戊二烯基转移酶抑制剂 【发明背景】
蛋白质的Ras家族在调节细胞生长的信号转导途径中是很重要的。蛋白质在核糖体中产生，释放到胞质溶胶中，并翻译后修饰。在翻译后修饰系列的第一步是Cys168用法尼基或香叶基香叶基焦磷酸酯在由诸如法尼基转移酶和香叶基香叶基转移酶的异戊二烯基转移酶(prenyltransferase)催化的反应中烷基化(Hancock,JF等，细胞57:1167-1177(1989))。随后，三个C-端氨基酸被裂解(Gutierrez,L等，EMBO J.8:1093-1098(1989))，而末端Cys被转化为甲基酯(Clark,S等，Proc.Nat’lAcad.Sci.(USA)85:4643-4647(1988))。某些形式的Ras也在半胱氨酸残基上紧邻Cys168的N-端可逆地棕榈酰化(Buss,JE等，分子细胞生物学，6:116-122(1986))。人们相信，这些修饰增加了Ras C-端的疏水性，导致其在细胞膜的表面定位。Ras在细胞膜表面的定位对于信号转导是必需的(Willumsen,BM等，科学，310:583-586(1984))。
Ras的致癌形式在相当大量的癌，包括超过50％结肠癌和超过90％的胰腺癌中观察到(Bos,JL，癌症研究，49:4682-4689(1989))。这些观察使人联想到，在介导信号转导的Ras的功能方面的干扰可能在治疗癌症方面有用。
以前，已经显示，Ras的C-端四肽是“CAAX”基序(其中C是半胱氨酸，A是脂族氨基酸，而X是任何氨基酸)。具有此结构的四肽已经显示出是异戊二烯基转移酶的抑制剂(Reiss等，细胞，62:81-88(1990))。这些早期的法尼基转移酶抑制剂较弱的效力促进了具有更理想的药物动力学行为的新抑制剂地研究(James,GL等，科学，260:1937-1942(1993)；Kohl,NE等，Proc.Nat’l Acad.SCi.USA 91:9141-9145(1994)；desolms,SJ等，药物化学杂志，38:3967-3971(1995)；Lerner,EC等，生物化学杂志，270:26802-26806(1995)；Lerner,EC等，生物化学杂志，270:26770(1995)；和James等，Proc.Nat’l Acad.SCi.USA 93:4454(1996))。
最近，已经显示，异戊二烯基转移酶的抑制剂可以在裸鼠体内阻断Ras-依赖的肿瘤的生长(Kohl,NE等，Proc.Nat’l Acad.SCi.USA 91:9141-9145(1994))。另外，已经显示，超过70％的大量取样的肿瘤细胞系被异戊二烯基转移酶的抑制剂以超过非-转化的表皮细胞的选择性抑制(Sepp-Lorenzino,I等，癌症研究，55:5302-5309(1995))。
发明提要
一方面，本发明涉及式Ⅰ或式Ⅱ化合物
其中
R1是H或N(R10)(R11)；
R2是硫代低级烷基；
各个R3和R5独立地是CH2或C(O)；
R4是取代或未取代的硫代低级烷基，其中所说的取代基是CH2NHC(O)R13，且所说的取代基连接在所说的硫基上；
R6是天然或合成的α-氨基酸的残基；
R7是天然或合成的α-氨基酸的残基；
R8是OH或低级烷氧基，或者，与R7一起形成高丝氨酸内酯；
各个R9,R10和R11独立地是H或低级烷基；
R12是取代或未取代的环烷基，环烷基低级烷基，芳基，芳基低级烷基，杂环，或杂环低级烷基，其中所说的取代基是低级烷基，芳基，卤素，低级烷氧基，或C(O)-R7-R8；
R13是低级烷基，芳基，或芳基低级烷基；R18是H或，与R9一起形成CH2CH2；条件是如果R4是未取代的硫代低级烷基，R2的游离的硫基和R4的游离的硫基可以形成二硫键；或其药用盐。
在一个方案中，该化合物是式Ⅰ的，其中R6是-N(R14)CH(R15)C(O)-其中R14是H或低级烷基，而R15是取代或未取代的低级烷基，芳基，芳基低级烷基，杂环，或杂环低级烷基，其中所说的取代基是低级烷基，卤素，或低级烷氧基，或其中R15与其所连接的NR14C一起形成杂环；和R7是-N(R16)CH(R17)C(O)-其中R16是H或低级烷基，而R17是(CH2)mS(O)nCH3或取代或未取代的低级烷基，硫代低级烷基，其中所说的取代基是C(O)N(R10)(R11),m是1-6,n是0-2，而R8是OH或低级烷氧基。在此方案中，R2可以是CH2SH；R4可以是C(CH3)2SH或CH2SH其中R2的游离的硫基和R4的游离的硫基可以形成二硫键；R15与其所连接的NR14C一起可以形成杂环；R16可以是H；而R17可以是(CH2)2S(O)nCH3；而且，R1可以是NH2；R3可以是CH2；R5可以是CO；R8可以是OH或OCH3。在同样的方案中，R2可以是(CH2)SH；R4可以是C(CH2)2SCH2NHCOCH3或CH2SCH2NHCOCH3；R15与其所连接的NR14C一起可以形成杂环；R16可以是H，而R17可以是(CH2)2S(O)nCH3；而且，R1是NH2；R3是CH2；R5是C(O)；R8是OH或OCH3。
在另一方案中，该化合物是式Ⅱ的，其中R2是是CH2SH；R4是C(CH3)2SH或CH2SH其中R2的游离的硫基和R4的游离的硫基可以形成二硫键；R12是取代或未取代的芳基或芳基低级烷基，而R18是H。在此方案中，R1可以是NH2；R3可以是CH2；R5可以是C(O)；R9可以是H；R12可以是取代或未取代的苯基或苄基，其中所说的取代基是低级烷基或卤素。
在另一方案中，R2是CH2SH；R4是C(CH2)2SCH2NHCOCH3或CH2SCH2NHCOCH3；R12是取代或未取代的芳基或低级烷基。在此方案中，R1可以是NH2；R3可以是CH2；R5可以是C(O)；R9可以是H；R12可以是取代或未取代的苯基或苄基，其中所说的取代基是低级烷基或卤素。
本发明的例子包括如下:
原文P5-13结构式化合物1；化合物2；化合物3；化合物4；化合物5；化合物6；化合物7；化合物8；化合物9；化合物10；化合物11；化合物12；化合物13；化合物14；化合物15；化合物16；化合物17；化合物18；化合物19；化合物20；化合物21；化合物22；化合物23；和化合物24.
本发明的化合物可以具有不对称中心，并以外消旋体，外消旋混合物，和单个非对映体存在，所有可能的异构体，包括光学异构体，都包括在本发明中。简单地说，其中在结构式中没有描述特定的构型，被理解为表示所有的对映体形式和其混合物。
本文所用的“低级烷基”包括具有1-6个碳原子的饱和脂肪烃基。低级烷基的例子包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，等等。“低级烷氧基”包括具有1-6个碳原子的基团。低级烷氧基的例子包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，等等。所有烷基，烯基和烷氧基都可以是支链或直链的，但是非环状的。术语“环烷基”意指3-7员碳环。环烷基的例子包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环庚基。术语“卤素”意指氯，溴，碘，或氟。术语“杂环低级烷基”，“硫代低级烷基”，“环烷基低级烷基”和“芳基低级烷基”分别被1至3个杂环，硫基，环烷基和芳基取代。
本文中，“芳基”包括任何稳定的在各个环中最多7个成员的单环，双环，或三环碳环，其中至少一个环是芳香的。芳基的例子包括苯基，萘基，蒽基，联苯基，四氢萘基，二氢茚基，苯并蒽基，等等。
本文的术语杂环表示稳定的5-至7-员单环或稳定的8-至11-员双环，或稳定的11-至15-员三环杂环，它既可以是饱和的，也可以是未饱和的，并由碳原子和1至4个选自N,O，和S的杂原子组成，并包括任何其中上面定义的杂环与苯环稠合的双环基。杂环可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子上连接。这类杂环元素的例子包括，但不限于，丫庚因基，苯并咪唑基，苯并异噁唑基，苯并呋咱基，苯并吡喃基，苯并硫代吡喃基，苯并呋喃基，苯并噻唑基，苯并噻吩基，苯并噁唑基，苯并二氢吡喃基，噌啉基，二氢苯并呋喃基，二氢苯并噻吩基，二氢苯并硫代吡喃基，二氢苯并硫代吡喃基砜，呋喃基，咪唑烷基，咪唑啉基，咪唑基，吲哚啉基，吲哚基，异苯并二氢吡喃基，异吲哚啉基，异喹啉基，异噻唑烷基，吗啉基，1,5-二氮杂萘基，噁二唑基，2-氧代丫庚因基，2-氧代哌嗪基，2-氧代哌啶基，2-氧代吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，吡啶基，吡啶基N-氧化物，喹喔啉基，四氢呋喃基，四氢异喹啉基，四氢喹啉基，硫代吗啉基，硫代吗啉基亚砜，噻唑基，噻唑啉基，噻唑烷基，噻吩并呋喃基，噻吩并噻吩基，噻吩基，等等。
当基团被取代时，可以被取代一至四次。各种取代基可以连接在碳原子或杂原子(例如，S,N或O)上。
本文所用的术语“α-氨基酸残基”代表在自然界发现的天然α-氨基酸(例如，半胱氨酰，甲硫氨酰，苯丙氨酰，亮氨酰，等等)或没有在自然界发现的合成的α-氨基酸(例如，neurleucyl或1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸或青霉胺的残基，等等)的α-氨基酸残基。
本发明化合物可以以药用盐的形式提供。可接受的盐包括，但不限于无机酸的加成盐，如乙酸盐，马来酸盐，富马酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐，pamoate，水杨酸盐，草酸盐，和硬脂酸盐。也在本发明范围内，可应用的是由碱如氢氧化钠或氢氧化钾的盐形式。药用盐的其它例子参见，“药用盐，”J.Pharm.Sci.66:1(1977)。
另一方面，本发明涉及通过对主体施用治疗有效量的式Ⅰ或式Ⅱ化合物，在主体内，例如，哺乳动物如人体内抑制异戊二烯基转移酶(例如，法尼基转移酶或香叶基香叶基转移酶)的方法。具体地，本发明也涉及通过对主体施用治疗有效量的化合物或其盐在主体内治疗再狭窄或组织增生疾病(即肿瘤)的方法。组织增生疾病的例子既包括那些与良性(例如，非-恶性)细胞增生如纤维化，良性前列腺增生，动脉粥样硬化，和再狭窄相关的，也包括与恶性细胞增生，如癌症(例如，ras突变肿瘤)。可治疗的肿瘤的例子包括乳腺，结肠，胰腺，前列腺，肺，卵巢，表皮，和血癌(Sepp-Lorenzino,I等，癌症研究(Cancer Research)55:5302(1995))。
治疗有效量的本发明化合物和药用载体物质(例如，碳酸镁，乳酸，或治疗化合物可以与其形成胶束的磷脂)一起形成对需要该化合物的主体给药(例如，口服，静脉内，经皮，或皮下)的药物组合物(例如，丸剂，片剂，胶囊，或液体)。丸剂，片剂，或胶囊可以用能够保护该组合物，在主体的胃内，足以使组合物在不消化地进入主体小肠的时间周期内不受胃酸或肠道酶作用的物质包衣。
用于治疗上述疾病或病症的本发明化合物的剂量依赖于给药的方式，主体的年龄和体重，被治疗的主体的状况，并最终由主治医生或兽医决定。由由主治医生或兽医决定的这类化合物的量本文称为“治疗有效量”。
也包括在本发明范围内的是制备式Ⅰ或式Ⅱ化合物的方法，用于如本文所述这些合成中的新化学中间体。
本发明的其它方面和优点从发明详述和权利要求将显而易见。
发明详述
我们相信，本专业熟练的技术人员以本文的说明书为基础，将可以最大限度地应用本发明。因此，下列具体方案仅仅是举例说明，而不在任何意义上限制本发明。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义。而且，本文提到的所有出版物，专利申请，专利，和其它参考文献都引作本文参考。
下面是化合物1,4，和9合成的叙述。本发明的其它化合物可以由本专业熟练的技术人员以类似的方法制备。
本发明化合物通过用标准液相法制备，例如，如Greenstein等，氨基酸化学，Vols.1-3(J.Wiley,New York(1961))；和M.Bodanszky,et al.，肽合成操作(Springer-Verlag,1984))所述的。合成反应在惰性有机溶剂，例如，二甲基甲酰胺，二氯甲烷，四氢呋喃，苯或乙腈中，用合适的温和的缩合剂，例如，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺-HCl(EDC,o-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)，并用或不用催化剂，例如，1-羟基苯并三唑(HOBT)进行。反应温度保持在低于室温(-15℃至室温)以使副反应最少。环状二硫化物的形成在高度稀释的条件下，用碘在各种溶剂(例如，甲醇，四氢呋喃(THF)，乙酸，水，等等)中进行。B.Kamber,et al.,Helv.Chim.Acta,63(96):899(1980)。中间体和最终产物通过标准方法，例如，柱层析或HPLC分离和纯化。其中R8与R9一起形成CH2CH2的化合物可以根据Williams,et al.,J.Med.Chem.39(7):1346(1996)，的方法制造，例如从保护的半胱氨酸开始。
实施例Ⅰ：N-[2-(R)-氨基-3-巯基丙基)-L-青霉胺基-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯环二硫化物(化合物1)
(a)N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酰基-N,O-二甲基酰胺
往冰冷却的N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸(8.0g)和盐酸N,O-二甲基羟胺(7.1g)在80ml二甲基甲酰胺中的溶液中加入4.2ml氰基膦酸二乙基酯和14.7ml二异丙基乙基胺，在0℃搅拌1小时后，将反应混合物在室温下放置过夜。真空除去挥发性物质至干，将残余物分配在乙酸乙酯和水之间。乙酸乙酯层用碳酸氢钠水溶液，水洗涤，干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干，残余物用氯仿作洗脱剂硅胶(165g)层析。收集需要的部分，真空除去溶剂至干。白色泡沫体8.08gTLC(硅胶∶氯仿/丙酮=9∶1Rf=0.58)。
b)2(R)-叔丁氧羰基氨基-3-三苯基甲基巯基丙醛
在氮气氛中，往冰冷却的N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酰基-N,O-二甲基酰胺(0.85g)在20ml四氢呋喃中的溶液中滴加3ml 1.0M氢化铝锂THF溶液。混合物在0℃搅拌30分钟后，慢慢加入1M硫酸氢钾，将产生的乳化液滤过硅藻土垫，再用乙酸乙酯洗涤。无水硫酸镁干燥后，真空除去溶剂至干产生0.7g上述标题化合物，TLC(硅胶；氯仿/丙酮=4∶1；Rf=0.88)。
c)N-叔丁氧羰基-S-乙酰氨基甲基青霉胺基-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基-甲硫氨酸甲酯
往冰冷却的N-叔丁氧羰基-L-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉(2.77g)和L-甲硫氨酸甲酯盐酸盐(2.0g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.37g)和o-苯并三唑-1-基N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)(3.87g)在30ml二甲基甲酰胺中的溶液中加入4.9ml二异丙基乙基胺(DIEA)。在0℃搅拌30分钟后，反应混合物在室温过夜。真空除去挥发性物质至干，并将残余物分配在乙酸乙酯和水之间。乙酸乙酯层用碳酸氢钠水溶液，水洗涤，干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干。将其用含有4.8ml三乙胺的50％三氟乙酸氯仿溶液(40ml)处理1小时，真空除去挥发性物质至干。痕量的三氟乙酸(TFA)再用甲苯蒸发。往冷却至0℃的上述L-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯TFA盐(2.2g)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入1.2mlDIEA，接着加入HOBT(0.7g),N-叔丁氧羰基-S-乙酰氨基甲基青霉素(1.6g)在DMF(3ml)和EDC(1.2g)中的溶液。混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温过夜。真空除去挥发性物质至干。将残余物分配在碳酸氢钠水溶液和水之间，然后干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干给出3.3g橙色固体。
d)L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯和其TFA盐
将N-叔丁氧羰基-S-乙酰氨基甲基青霉胺基-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基-甲硫氨酸甲酯(3.3g)用含有1ml三乙胺的50％TFA的二氯甲烷溶液(20ml)处理30分钟。真空除去挥发性物质至干。通过与甲苯共蒸发几次除去痕量的TFA。将TFA盐溶于氯仿(30ml)，用过量的三乙胺处理，水洗，干燥(硫酸镁)，真空蒸发溶剂给出游离的碱。
e)N-[2(R)-(叔丁氧羰基)氨基-3-三苯基甲基巯基丙基]-L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基]-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯
往2(R)-叔丁氧羰基氨基-3-三苯基甲基巯基丙醛(0.7g)和L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯(0.43g)在含有1％乙酸的二氯甲烷(20ml)中的溶液中一次加入三乙氧基硼氢化钠Na(OAc)3BH(360mg)。搅拌2小时后，将混合物用水，5％碳酸氢钠水溶液，水洗涤，然后干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干，残余物用氯仿/丙酮(19∶1至9∶1)作洗脱剂硅胶(50g)层析。收集需要的部分，并将溶剂真空蒸发至干，产生上述标题化合物的白色泡沫体。TLC(硅胶；氯仿/丙酮=4∶1；Rf=0.4)。
f)N-[2(R)-(叔丁氧羰基)氨基-3-巯基丙基)-L-青霉胺基]-1,2,3，4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯环二硫化物
往N-[2(R)-(叔丁氧羰基)氨基-3-三苯基甲基巯基丙基]-L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基]-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯(500mg)在50ml90％甲醇水溶液中的溶液中滴加碘(250mg)的甲醇(MeOH)(10ml)溶液。搅拌1小时后，真空除去大部分甲醇至一小体积，用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取液用水，Na2S2O3，水洗涤，然后干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干产生400mg上述标题化合物。
g)N-[2-(R)-氨基-3-巯基丙基)-L-青霉胺基-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯环二硫化物
将粗N-[2(R)-(叔丁氧羰基)氨基-3-巯基丙基)-L-青霉胺基]-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯环二硫化物(400mg)用90％的水中的三氟乙酸(TFA)TFA/H2O(9∶1)(10ml)处理30分钟。真空除去挥发性物质至干，痕量的TFA用甲苯蒸发几次，用己烷研制，倾析，然后干燥。将粗产物进行制备性高效液相色谱(HPLC)，用C18柱，0.1％TFA和乙腈作流动相。收集需要的部分，除去溶剂给出标题化合物白色固体(78mg)。M/e=541.1。
实施例2:N-[2-(R)-氨基-3-巯基丙基)-L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基]-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸(化合物4)
往N-[2(R)-(叔丁氧羰基)氨基-3-三苯基甲基巯基丙基]-L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基]-1,2,3,4-四氢-3(S)-异喹啉羰基甲硫氨酸甲酯(实施例Ie))(500mg)在10 MeOH(50ml)溶液中加入2ml 2N氢氧化钠。30分钟后，真空除去大部分甲醇至一小体积，用水稀释，用5％柠檬酸水溶液酸化，用乙酸乙酯萃取。然后将乙酸乙酯萃取液干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干。残余物用含有三乙基甲硅烷(Et3SiH)(0.5ml)的二氯甲烷中的50％TFA处理40分钟。除去挥发性物质至干，用甲苯蒸发痕量的TFA，然后干燥。粗产物通过制备性HPLC纯化给出上述标题化合物(100mg)白色固体。M/e=600.2
实施例3：N-[2-(R)-氨基-3-巯基丙基)-L-青霉胺基]-2,3-二甲酰苯胺环二硫化物(化合物9)
(a)[N-叔丁氧羰基-S-乙酰氨基甲基]青霉胺基-2,3-二甲酰苯胺
往冰冷却的N-(叔丁氧羰基)-S-乙酰氨基甲基青霉胺(BachemCalifornia,Torrance,CA)(0.64g),2,3-二甲基苯胺(0.25g)，羟基苯并三唑(0.41g)在二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(1∶1,20ml)中的溶液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(0.57g)。混合物在0-5℃搅拌30分钟，然后将温度慢慢升至室温过夜。蒸发溶剂后，将残余物分配在乙酸乙酯(EtOAc)和水之间。乙酸乙酯萃取液用碳酸氢钠水溶液，水洗涤，然后干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干。残余物用氯仿/丙酮=19∶1作洗脱剂硅胶(40g)层析，收集需要的部分，真空除去溶剂至干给出350mg上述标题化合物。TLC(硅胶∶氯仿/丙酮=4∶1,Rf=-0.77)。
b)L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基-2,3-二甲酰苯胺TFA盐
将[N-叔丁氧羰基-S-乙酰氨基甲基]青霉胺基-2,3-二甲酰苯胺用二氯甲烷(20ml)中50％的TFA处理30分钟。真空除去溶剂至干。痕量的TFA通过用甲苯共蒸发几次而除去。将TFA盐溶于氯仿(30ml)，用过量的三乙胺处理，水洗，干燥(硫酸镁)，真空蒸发溶剂给出游离的碱。
c)N-[2(R)-(叔丁氧羰基)氨基-3-三苯基甲基巯基丙基]-L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基]-2,3-二甲酰苯胺
搅拌下，往2(R)-叔丁氧羰基氨基-3-三苯基甲基巯基丙醛(0.5g；实施例1b)和L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基]-2,3-二甲酰苯胺TFA盐(0.3g)在含有1％乙酸(HOAc)的甲醇中的溶液(10ml)中分批加入NaCNBH3(100mg)。混合物在室温搅拌过夜。真空蒸发大部分溶剂至一小体积，将其分配于乙酸乙酯和水之间。乙酸乙酯层再用碳酸氢钠水溶液，水洗涤，然后干燥(硫酸镁)。蒸发溶剂后，将残余物用氯仿-丙酮(19∶1至9∶1)作洗脱剂硅胶(30g)层析。收集需要的部分，将溶剂蒸发至干给出360mg上述标题化合物。TLC(硅胶∶氯仿/丙酮=9∶1,Rf=0.13)。
d)N-[2-(R)-氨基-3-巯基丙基]-L-[青霉胺基]-2,3-二甲酰苯胺环二硫化物
在搅拌下，往N-[2(R)-(叔丁氧羰基)氨基-3-三苯基甲基巯基丙基]-L-[S-乙酰氨基甲基青霉胺基]-2,3-二甲酰苯胺(350mg)在50ml90％甲醇水溶液中的溶液中滴加碘(250mg)的甲醇(MeOH)(5ml)溶液。1小时后，真空除去大部分溶剂至一小体积，用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取液用Na2S2O3，水洗涤，然后干燥(硫酸镁)。真空蒸发溶剂至干(220mg)，用90％TFA水溶液(ml)处理30分钟，真空除去挥发性物质至干。粗产物通过制备性HPLC纯化给出62mg上述标题化合物白色固体。M/e=340.2。
其它方案
应该理解，在本发明结合其详细说明进行描述时，前述说明只是举例说明，而不限制本发明的范围，该范围在权利要求书中定义。其它方面，优点和修饰在权利要求的范围中。