一株产紫杉醇的腐生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法.pdf

一株能产紫杉醇的腐生真菌拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora NK17(菌种保藏号CGMCC2694)，属于生物工程技术领域。本发明的菌株是第一次在拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)中发现的能通过发酵法生产紫杉醇的腐生真菌，其产物为现今最有效的抗肿瘤药物一紫杉醇。本发明还包括了应用本发明的菌株生产紫杉醇的方法，包括在培养基中培养本发明菌株，以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。本发明紫杉醇产率高，生产成本低，发酵周期短，应用于工业化生产，可彻底解决紫杉醇的生产工业问题，既保护了自然资源，又可满足市场需求。

1、  一株产紫杉醇的腐生真菌，其分类命名为拟盘多毛孢属Pestalotiopsis microspora NK17，菌种保藏号：CGMCC2694。

2、  根据权利要求1所述的腐生真菌，其特征是该菌株的18S rDNA片段长1631bp，其核苷酸序列如序列表所示。

3、  根据权利要求1所述的腐生真菌，其特征是该菌株能够用来生产抗肿瘤药物—紫杉醇paclitaxel。

4、  一种使用权利要求1所述的腐生真菌生产紫杉醇的方法，其特征在于：在培养基中培养权利要求1所述腐生真菌以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。

5、  根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述培养基为PDA培养基，其组成为g/L：马铃薯180-220g，蔗糖20g，自然pH，固体补加20g琼脂粉。

6、  根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的培养是在需氧条件下进行，温度为25-30℃，发酵初始PH值为PDA培养基自然PH。

7、  根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述菌株在500mL-1L三角瓶中发酵培养，接种方式采用块状菌丝的接种方式。

8、  根据权利要求4至7所述的方法，其特征在于所述回收并提纯紫杉醇的步骤包括：
(1)从所得培养液分离出发酵菌体和发酵上清液；
(2)将菌体冷冻干燥，液氮研磨，用甲醇浸提；将浸出液与发酵上清液混合后进行抽滤，除去沉淀物；使用旋转蒸发器对所得滤液浓缩，得到粗提产物；
(3)将第(2)步所得粗提产物用色谱纯化的方法纯化，得产物紫杉醇。

9、  根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在第(2)步用饱和Na₂CO₃溶液调节所得滤液的PH值为6.0-8.0。

10、  根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：第(3)步所述色谱纯化方法中，使用一个或一个以上的色谱柱，填料为C18，流动相为甲醇/H₂O。.

一株产紫杉醇的腐生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法
【技术领域】：本发明属于生物工程和生物制药技术领域。具体涉及一株能产紫杉醇的腐生真菌拟盘多毛孢，以及应用该菌株发酵生产紫杉醇的方法。
【背景技术】：紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是一种复杂的天然的抗癌药物，属于二萜生物碱，其基本结构由浆果赤霉素III(baccatinIII)和连接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物构成。
工业生产紫杉醇的早期策略，是采用从红豆杉树木原料中直接提取的方法，由于紫杉醇含量极低，只有树木干重的0.0001-0.008％，加之紫杉醇水溶解性差，平均产量约0.015％，生产1公斤紫杉醇，一般需要7000公斤、相当于2000-2500棵红豆杉树木的原料。以1992年为例，Bristol-Myers-Squibb(BMS)公司为临床试验提供了16公斤的紫杉醇，消耗了120万公斤的红豆杉。有人估计，治疗一个卵巢癌患者需要6棵树龄60-100年的红豆杉树。随着该药品应用范围的扩大，所需红豆杉数量将十分可观，这也给红豆杉资源带来严重威胁，可能造成生态环境的严重破坏。
化学法全合成紫杉醇，已于1994年在实验室里取得了成功。但是，紫杉醇手性基团较多，合成路线复杂，成本高、产率低，至今无法应用于工业生产。近年来，国内外学者进行了大量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养研究，培养的红豆杉细胞系已超过10个，其中大部分已证实能产生紫杉醇，但是离体培养生产紫杉醇实现工业化生产的关键问题难以突破，例如：培养物生物量小，紫杉醇产率较低，生产周期长，并且还需要保持细胞生长与生产特性的稳定等等。
Christen首次利用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后，研究吸引了众多的实验室跟进，这方面的研究也取得了一定的进展。例如：ESC Agenetics公司在1992年NCI主持的第二次紫杉醇研讨会上宣布他们用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树皮中含量的2-5倍。中国的甘烦远等发现云南红豆杉细胞在发酵罐中生长量达到12g/L，紫杉醇含量为0.119％，约为成年树树皮中含量的12倍，为栽培植株的40倍。但是这项技术同样存在一些问题，如培养细胞的褐化问题，虽有该技术进入生物反应器放大阶段的试验，但未见实际应用的报道，短期内成功应用的可能性较小。
国际制药公司当前较普遍采用的生产技术则是生化半合成法。对东北红豆杉(Taxus cuspidate)紫杉醇生成的分子生物学研究表明，紫杉醇合成大致可分为三个主要的生物合成阶段：1)紫杉烷环baccatin III母核中间体的合成，2)C-l3位侧链中间体的合成，3)紫杉烷环和侧链的酰化反应，形成完整的紫杉醇分子。Baccatin III和C-13位侧链中间体独立合成，可以稳定存在，而且水溶性较好。依据这一特点，利用生物酶类将红豆杉原料进行处理，使baccatin III和C-l3位侧链中间体得到一定程度的富集，然后提取这些较易溶解的前体，最后利用酶法或化学法将这些前体合成成品紫杉醇。半合成法虽然提高了紫杉醇产量，但与直接提取紫杉醇的办法并无本质上区别，仍然需要消耗大量红豆杉树木，为此BMS公司开辟了3000万株红豆杉种植场。
由于紫杉醇的市场供应受制于原料来源和制备技术两方面的制约，使得药价昂贵。为此，制药界和学术界一直在寻找新的更好的原料及方法，来代替现有的生产技术，以提高紫杉醇的产量、满足临床需求。过去十余年中取得的最有意义的进展，是发现了与红豆杉等裸子木本植物共生的一些真菌产生紫杉醇，并且其化学结构和生物活性与红豆杉所产紫杉醇完全相同。
1993年，Stierle等从太平洋红豆杉的韧皮部分离到1株内共生真菌-安德烈紫杉菌(Taxomycesandreanae)，经培养，采用质谱、色谱(TLC/HPLC)和放射性化学标记等方法，发现该菌的发酵液中存在紫杉醇，尽管产量较低，每升发酵液含紫杉醇24-50ng。同时还证实，这些真菌产生的紫杉醇与红豆杉中紫杉醇结构和性质完全一样。随后，许多人分离到不同的产紫杉醇的内共生真菌。我国境内也发现了多种产紫杉醇的内共生真菌。据统计，国内外已报道的产生紫杉醇真菌种类已超过三十种，这些真菌绝大多数是子囊菌或半知菌，而且都是内共生真菌。由于目前这些真菌发酵产物中紫杉醇的含量很低，不能达到工业发酵生产的水平，因此远远不能满足市场的需求。
综上所述，现有紫杉醇生产技术存在的主要问题是：(1)采用从红豆杉树木原料中直接提取的方法，由于紫杉醇含量极低，红豆杉的大量砍伐造成了生态环境的严重破坏。(2)化学法全合成紫杉醇，因为紫杉醇手性基团较多、合成路线复杂、成本高、产率低，至今无法应用于工业生产。(3)生化半合成紫杉醇，虽然提高了紫杉醇产量，但与直接提取紫杉醇的方法并无本质上的区别，仍然需要消耗大量红豆杉树木。(4)植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇，培养物生物量小，紫杉醇产率较低，生产周期长，培养细胞易发生褐化，并且还需要保持细胞生长与生产特性的稳定。(5)利用内共生真菌发酵生产紫杉醇，发酵产物中紫杉醇的含量很低，不能达到工业发酵生产的水平，因此远远不能满足市场的需求。
基于紫杉醇生产与需求现状，世界市场急需能工业化生产紫杉醇的新方法。
【发明内容】：本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一株能够产紫杉醇的新菌株，以及利用该菌株生产紫杉醇的方法。
本发明提供的能产紫杉醇的新菌株是一株腐生真菌拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora NK-17(菌种保藏号CGMCC2694)。本发明菌株为国内外首次发现。因此用该种菌株发酵的方法生产紫杉醇是最有应用前景的途径之一。
本发明经过多年大量的深入研究，发现并培养了一种腐生真菌，该菌可产生紫杉醇，同时本发明人经过大量的实验，研究出利用该菌种来发酵生产紫杉醇的方法。
该菌紫杉醇产量较高，发酵条件容易控制，培养周期短，是一株工业化发酵生产紫杉醇的优势菌。
本发明通过从自然界分离微生物的方法，分离得到这种微生物。对这种微生物进行培养，制备发酵粗提物，使用薄层层析(TLC)，高效液相色谱(HPLC)，液质联用质谱分析(LC-MS)和核磁共振(NMR)等方法对发酵产物进行了分析和鉴定。利用形态学和分子生物学方法对这种微生物进行了种属鉴定，将其鉴定为拟盘多毛孢属，命名为NK-17。
本发明提供了从自然界分离得到这种微生物的方法。
本发明利用形态学和分子生物学方法对这种微生物进行了种属鉴定。
本发明提供了这种微生物的培养方法和发酵粗提物的制备方法。
本发明提供了对这种微生物发酵产物进行分析和鉴定的方法，证明这种微生物能够产生紫杉醇。
下面以实施例说明本发明中这种微生物的分离方法、种属鉴定方法、培养方法、发酵粗提物的制备方法和发酵产物分析及鉴定方法等内容。
本发明的优点和积极效果：
本发明提供了一株能够产紫杉醇的腐生真菌NK-17。
本发明提供的微生物是国内外发现的第一株产紫杉醇的腐生真菌，属拟盘多毛孢属，与已知的产紫杉醇内共生真菌相比，具有新颖性和实用性。这种微生物发酵周期短，产量高。已知的产紫杉醇内共生真菌发酵周期长，一般是2—3周，紫杉醇产量低，发酵工艺难于掌握。这就意味着，用本发明的菌株有可能实现紫杉醇的大规模发酵生产。
与其它紫杉醇生产方法相比，如从红豆杉树木原料中直接提取的方法，化学法全合成和生化半合成紫杉醇的方法，植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇的方法，本发明提供的微生物可以通过发酵培养直接生产紫杉醇，其生产成本低，不会对生态资源造成破坏，发酵工艺易于掌握，后续的分离纯化步骤简单，产率高，因此在这几点上都有鲜明的可比性。
【附图说明】：
图1是本发明提供的菌株NK-17的分生孢子形态；
图2是高效液相色谱(HPLC)分析方法纯化和鉴定NK-17发酵产物中所含紫杉醇，图2-1、紫杉醇标准品(12.847min)，图2-2、待测样品(12.840min)；
图3是液-质联用(LC-MS)分析方法鉴定NK-17发酵产物中所含紫杉醇；
图4是核磁共振(NMR)分析方法鉴定NK-17发酵产物中所含紫杉醇，图4-1、紫杉醇标准品，图4-2、待测样品。
本发明提供的能产紫杉醇的新菌株是一株腐生真菌拟盘多毛孢，已于2008年10月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路甲3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC2694，分类命名：Pestalotiopsis microspora NK17。
【具体实施方式】：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所著的“分子克隆实验室手册”(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、本发明提供的微生物菌株NK-17的分离方法
将来源于我国南部某城市处的废布条剪成1×1cm小块；将该样品放入体积百分数为75％的乙醇中浸泡3分钟进行杀菌消毒；用无菌水洗净后接种于PDA平板(每板3-4块样品)，28℃培养3-4天后观察；待初步长出菌落时，选择长势较好的菌落接种于pDA斜面培养，纯化，保存。PDA培养基配方(/L)：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g(固体培养基中添加)。
实施例2、本发明提供的微生物菌株NK-17的种属鉴定
(1)形态学方法鉴定
将NK-17菌株培养30天左右，待菌落长出分生孢子后，进行镜检。通过菌落形态以及分生孢子的电子显微镜照片(实验结果见图1)表明，这种微生物与拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)形态学上极为相似。
(2)分子生物学方法鉴定
通过设计引物UK4F(5’-cyggttgatcctgccrg-3’)和UREV(5’-gytaccttgttacgactt-3’)，我们使用PCR方法对该微生物的18SrDNA进行扩增，得到了一个长1631bp的片段。通过测序后与Genbank中序列进行比对，发现与Pestalotiopsis microspora18S rDNA的相似性达到了99％(序列结果见序列表)。
根据实施例2的结果，我们将这种微生物鉴定为Pestalotiopsis属，命名为NK-17。
实施例3、本发明提供的微生物NK-17的培养方法
培养基的制备按实施例1中所涉及的方法进行配制。在固体培养过程中，培养温度为28℃，如需得到分生孢子，需连续培养30天左右；在液体培养过程中，培养温度为28℃，转速200rpm，如需大量得到紫杉醇，培养时间需达到15天左右，由于产物紫杉醇在pH4-8之间是稳定的，因此需要在发酵过程中监测pH，使其处于该范围之内。
实施例4、本发明提供的微生物NK-17发酵产物前处理过程
将发酵产物进行抽滤，使得菌丝同发酵液分离开来；将抽滤后所得菌丝冷冻干燥，液氮研磨破碎细胞之后使用甲醇浸提1-2天；将浸出液与之前的发酵液混合后再次进行抽滤，除去沉淀物，并调节pH至7.0；使用旋转蒸发器对上步所得滤液浓缩后得到粗提产物，进行下一步分析和鉴定。
实施例5、本发明提供的微生物NK-17发酵产物中所含紫杉醇的分析和鉴定
将NK-17的发酵产物用下述方法进行分析和鉴定：
(1)薄层层析(TLC)
使用二氯甲烷：乙酸乙酯＝6：1的展层体系，对NK-17发酵粗提产物进行展开，在GF254硅胶板上通过紫外光照射能够显现出明显的暗点，通过与紫杉醇标准品进行比对，发现两者有相同的Rf值，证明两者为同一物质。
(2)高效液相色谱(HPLC)
选择分析型C-18ODS色谱柱(4.6×250mm，Kromasil)，色谱条件：检测波长227nm，流速1mL/min，柱温是室温，流动相为甲醇：水＝7：3。通过实验表明，发酵产物中含有与紫杉醇标准品保留时间相同的物质(实验结果见图2)。(1.紫杉醇标准品，12.847min；2.NK17发酵产物，12.840min.)。根据出峰面积，可以计算出发酵产物中紫杉醇的含量。
(3)质谱(LC-MS)
实施例中使用了少量经过HPLC纯化后的样品进行了液-质联用检测。实验结果表明，样品中的主要成分分子量[M+Na]⁺＝876，由此可以得出[M]＝853，与紫杉醇标准品的分子量相同，可以说明两者为同一物质(实验结果见图3)。
(4)核磁共振(NMR)
实施例中使用了大量经过HPLC纯化后的样品进行了核磁共振检测。通过实验表明，待测样品同紫杉醇标准品具有相同的响应信号，从分子结构上证实两者为同一物质(实验结果见图4)。
序列表
<110>南开大学
<120>一株产紫杉醇的腐生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法
<160>1
<210>1
<211>1631
<212>DNA
<213>拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora NK17)
<220>
<221>gene
<222>(1)...(1631)
<400>1