药物 本发明涉及用于治疗疼痛的一类新的谷氨酸受体拮抗剂。
L-谷氨酸通过其对谷氨酸受体的作用调节哺乳动物中枢神经系统的兴奋性神经传递。谷氨酸受体主要有两种类型:称作离子型(ionotropic)谷氨酸受体和代谢型(metabotropic)谷氨酸受体。离子型谷氨酸受体有三类,称作N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、(R,S)-2-氨基-3-(3-羟基-5-甲基-异噁唑基-4-基)丙酸(AMPA)和红藻氨酸(kainate)(KA)受体。分子生物学研究已证实AMPA受体是由能聚集形成功能通道的亚单元(Glur1-4)组成。已鉴定出5种Kainate受体,分为高亲合力(KA1和KA2)或低亲合力(GluR5、GluR6、GluR7)Kainate受体(BleaKman等等.,Molecular pharmacology,1996,Vol.49,No.4 pgs.581-585)。
欧洲专利申请公开号590789A1和美国专利号5,446,051公开某些十氢异喹啉衍生物是AMPA受体的拮抗剂,可以用于治疗许多不同的疾病、包括疼痛在内。但没有公开实际被用于治疗病痛试验的任何化合物。
惊奇的是,现已发现在欧洲专利申请公布号590789A1范围内的一个化合物,即(3S,4aR,6S,8aR)-6-[(1(2)H-四唑-5-基)甲氧基甲基]十氢异喹啉-3-羟酸,是一个选择性的GluR5拮抗剂并在动物疼痛模型中有疗效。因此,相信已找到一类新的可治疗疼痛的药物,它以(3S,4aR,6S,8aR)-6-[(1(2)H-四唑-5-基)甲氧基甲基]十氢异喹啉-3-羟酸为代表。
一方面,本发明提供治疗病痛的方法。该方法包括对需治疗的哺乳动物给予有效量的选择性的GluR5受体拮抗剂。
另一方面,本发明提供了选择性GluR5受体拮抗剂在制备可治疗疼痛的药物中的用途。
GluR5受体拮抗剂可以通过在克隆和表达的人类GluR5受体中放射标记的配位基结合研究(Korczak等.,1994,Recept.Channels 3;41-49),或是通过在人类GluR5受体中进行全细胞电压钳的电生理的功能活性记录(Korczak等.,1994,Recept.Channels 3;41-49)及通过急速分离的大鼠神经节神经元中全细胞电压钳电生理的电流记录来鉴定(Bleakman等.,1996,Mol.Pharmacol.49;581-585)。
作用于GluR5受体的化合物的选择性取决于对其他地AMPA和Kainate受体的活性的测定,包括:受体-配位基结合研究以及对于人体GluR1、GluR2、GluR3、GluR4受体的全细胞电压钳电生理功能活性的记录(Fletcher等.,1995,Recept.Channels 3;21-31),受体-配位基结合研究以及全细胞电压钳对于人类GluR6受体的电生理功能活性的记录(Hoo等.,Recept.Channels 2;327-338)及对急速分离的小脑普尔钦(purkinje)神经元的AMPA受体的全细胞电压电生理功能活性的记录(Bleakman等.,1996,Mol.Pharmacol.49;581-585)和表达AMPA受体的其他组织(Fletcher and Lodge,1996,Pharmacol.Ther.71;65-89)。
选择性的GluR5受体拮抗剂对GluR5的亲合力最好至少比对其他谷氨酸受体的亲合力大10倍,优选至少大100倍。
用于本发明的选择性的GluR5拮抗剂可能是单一化合物或几个具有拮抗剂功能的化合物的组合物,其对GluR5受体比对其它离子型谷氨酸受体更具选择性。例如,它可以是对GluR5受体和一个或多个其它谷氨酸受体具有拮抗剂功能的化合物与可在一个或多个其它离子型谷氨酸受体中阻断其活性的一个或多个化合物的组合物。优选选择性的GluR5拮抗剂为单一化合物。
已发现下列化合物可作为本发明优先采用的选择性GluR5受体拮抗剂:3SR,4aRS,6SR,8aRS-6-((((1H-四唑-5-基)甲基)氧基)甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸,3S,4aR,6S,8aR-6-((((1H-四唑-5-基)甲基)氧基)甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸,3SR,4aRS,6SR,8aRS-6-(((4-羧基)苯基)甲基)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸和3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-羧基)苯基)甲基)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸。
上述实验中,前面提到的十氢异喹啉对GluR5受体和其它离子型谷氨酸受体活性的评价结果如下表1和表2所示。
表1
本发明化合物结合研究的选择性模式
采用人类GluR受体稳定转染的细胞系(HEK243细胞系),通过增加测试化合物的浓度取代3H AMPA,以用于GluR1-4表达细胞及使3Hkainate(KA)用于GluR5和表达细胞。以nM作单位估算的活性(Ki)如下:测试化合物GLuR1GLuR2GLuR3GLuR4GLuR5GLuR6 A*150686±49789(3)35337±6163(3)47793±8770(3)31606±5914(3)3061±1038(3)6±5%displ@100μm(3) B*--------5823(2)-- C*21%在1mM处55%在1mM处--23%在1mM处6810--A-3SR,4aRS,6SR,8aRS-6-[(1(2)H四唑-5-基)甲氧基-甲基]-十氢异喹啉-3-羧酸(三个结果的平均值)B-实施例1的化合物C-3SR,4aRS,6SR,8aRS-6-(((4-羧基)苯基)甲基)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸(仅有一个结果)D-实施例2的化合物--没有测试
表2
本发明化合物的电生理学研究的选择性模式
应用膜片钳术,对已稳定转染人类GluR受体的HEK293细胞和急速分离的脊神经节神经元(DRG)进行功能研究(Bleakman等.,1996,Mol.Pharmacol.,49,581-585)。测试化合物A的IC50值(μM)用来估算GluR1-4对100μM AMPA及GluR5和GluR6对100μM的结果,见下表:测试化合物 GluR1 GluR2 GluR3 GluR4 GluR5 GluR6 DRG* A >100 >100 >100 >100 3.9±0.5 >100 0.60±0.06 D -- -- -- >100 -- >100 0.98±0.07
*基于对30μM Kainate感应电流的抑制百分比。
本发明可治疗的疼痛形式包括剧痛、慢性痛、顽固性疼痛和神经痛。
3S,4aR,6S,8aR-6-((((1H-四唑-5-基)甲基)氧基)甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸和3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-羧基)苯基)甲基)1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸及其药学上可接受的盐是新的并作为本发明的另一个方面而提供。本发明也提供由这些化合物之一和药学上可接受的稀释剂或载体组成的药用组合物。它们可根据欧洲专利申请号.590789A1和美国专利No.5,446,051所描述的通用方法配制和制备成药物组合物。
选择性的GluR5受体拮抗剂治疗哺乳动物疼痛的能力可以通过熟知的福尔马林、尾弹动(tail flick)和乙酸扭曲实验证实。
1)福尔马林实验
研究开始前,雄性的Sprague-Dawley大鼠(重200-250g;CharlesRiver,Portage,MI)在一组笼中饲养并保持恒温,每天12小时光照和12小时黑暗,循环4-7天。在实验日前,这些鼠始终可以自由进水和进食。
药物或溶媒按1ml/kg的体积进行腹膜内(i.p.)给药或通过管饲法口服(p.o.)给予。
实验在定制的、大小为25×25×20cm3的plexiglas箱中进行(根据shibata等.,Pain 38;347-352,1989,wheeler-Aceto等.,Pain,40;229-238,1990)。在笼的背面安放一面镜子,以不防碍对福尔马林注射过的爪的观察。实验前对大鼠在小室内单独驯化至少一小时。所有的测试在8:00-14:00之间进行,测试时室温保持在21-23℃。在福尔马林注射前30分钟给予测试化合物。用27号标准针将福尔马林(50μl 5%盐水溶液)皮下注射到右后爪背侧面。注射完福尔马林马上开始观察。福尔马林引起的疼痛可以通过每隔5分钟记录舔已注射福尔马林的爪的次数和每次舔的持续时间(秒)来量化。福尔马林注射后进行50分钟的记录。
对福尔马林测试报道了不同的记分参数。表明鼠花在舔和咬注射过的爪的总时间是最相关的(Coderre等.,Eur.J.Neurosci.6;1328-1334,1993;Abbott等.,Pain,60;91-102,1995),并被选为测试评分。早期的评分是在0-5分钟内花在舔爪上的总时间。后期为15-40分钟之间每5分钟评分一次,并相应地表示出来或还加上从观察期的15-40分钟间花在舔爪上的时间总数(秒)来表示。数据用均数与均数的标准误(±SEM)表示。按照单向方差分析(ANOVA)评价数据及用Dunnett“t”检验进行适当的对照分析以对两侧做出比较。如果P值小于0.05,就认为差异是显著的,并以星号标识。在15-40分钟之间,对5分钟的时间点和5分钟的间隔进行统计学处理,这些数据表示为后期花在舔爪上的时间总数时,则对花在舔爪上的总时间进行统计学处理,并相应地表示出来。
实验中,发现实施例1的化合物在10-100mg/kg的剂量范围内对减低少第二阶段的舔爪时间具有活性。
2)尾弹动实验
这个熟知的实验是测定测试化合物对动物在一束聚焦光照射下尾巴从突然弹开所用时间的影响。实验中,灯光射出一束聚焦光到地面上,然后关灯,限制处理和未处理(对照组)的动物,使其尾巴放在电灯光束的焦点上。然后开灯,记录动物尾巴移开的响应时间。
皮下注射3、10、及30mg/kg剂量的实施例1的化合物的小鼠导致了响应时间的剂量依赖性增加。同样的化合物按0.03、0.1、.3和3mg/kg的剂量口服给予cynomolgous灵长目动物也导致了响应时间的剂量依赖性增加。这些数据表明实施例1的化合物,即选择性的GluR5拮抗剂,在治疗疼痛方面是有效的,而且在cynomolgous灵长目动物中有意想不到的口服活性。
3)乙酸引起的小鼠扭曲实验
这个实验测试试验化合物减少腹膜内注射乙酸诱导的小鼠扭曲次数的能力。
将测试化合物和对照物的剂量给予雄性CD-1小鼠。每只鼠按0.01mg/g的剂量腹膜内注射0.5%的乙酸。将动物单独放入一个有机玻璃观察室内,记录乙酸注射后5-10分钟之间扭曲的总次数(腹壁的扁平、身体和后肢的不对称伸展和延伸)。
实施例1的化合物按1、3、10和30mg/kg剂量给予,并导致了扭曲次数的剂量依赖性减少。
给予本发明的拮抗剂的特定剂量当然取决于病例周围的不同情况,包括给予的具体拮抗剂的活性、给药的途径、待治疗的具体病情以及类似的考虑。拮抗剂可以通过不同的途径给药,包括口服、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌内或鼻腔内途径。或者,拮抗剂也可连续输注给予,拮抗剂常用日剂量为约0.001mg/kg-约100mg/kg,优选日剂量为约0.05mg/kg-约50mg/kg,更优选日剂量为约0.1mg/kg-约20mg/kg。
下面的实施例说明选择性GluR5拮抗剂这一新化合物的制备。
从钠中蒸馏干燥四氢呋喃,使用所有可获得的其他溶剂和试剂。通常使用薄层色谱法(TLC)监测反应完成。使用E.Merck Kieselgel 60F254板(大小5cm×10cm,厚度0.25cm)进行薄层层析。用紫外和化学检验的组合方法检测斑点[盘子浸入钼酸胺铈溶液(75g钼酸胺和4g硫酸铈(IV)溶于500ml 10%含水硫酸中),然后在热板上加热]。用ControlEquipment Corporation440元素分析仪进行碳、氢和氮元素分析。色谱分离法指的是230-400目硅胶60网上的快速色谱分离法(Stull,WC;Kahn,M;Mitra,A.J.Org Chem.1978,43,2923),所用硅胶和洗脱溶剂的量见文中括号内。阳离子交换色谱分离法指的是用Dowex 50X-8(100-200)树脂(H+形式)进行离子交换。(在粗孔烧结玻璃漏斗中)先后用水、甲醇、水、3N氢氧化铵(pH3 12)、水、1N HCl(pH21),最后用水洗至pH呈中性来准备树脂。将树脂压入在水中的玻璃柱内,使化合物(在pH为2-7时溶于水中)慢慢洗脱到树脂中,柱子用水洗至pH呈中性,再用50%THF、水顺序洗涤。用10%吡啶溶液将化合物从树脂上洗脱,把含有产物的部分(用茚三酮痕迹在TLC板上可测定)合并,真空浓缩。加水并真空浓缩该混合物。该程序重复两次以上,以确保完全移出吡啶。
实施例1
3S,4aR,6S,8aR-6-((((1H-四唑-5-基)甲基)氧基)甲基)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸A.3S,4aR,6S,8aR-6-(((1H-氰基甲基)氧基)甲基)-2-甲氧基羰基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸乙酯:12.8g(42.6mmol)的3S,4aR,6S,8aR-6-羟甲基-2-甲酯基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸乙酯(Ornstein,等.,Journal of Organic Chemistry,1994,59,7862-7869)、10.6g(85.3mmol)((甲氧基)乙氧基)甲基氯及16.5g(127.9mmol)N,N-二异丙基乙基胺、20mg 4-N,N-二甲基氨基吡啶在70ml二氯甲烷中的溶液加热至回流4小时,冷却后用150ml乙醚稀释,用100ml 10%硫酸氢钠水溶液冲洗两次。干燥(硫酸镁)有机相,过滤、真空浓缩。残油用70ml二氯甲烷溶解,然后用17.0ml(12.7g,127.9mmol)三甲基硅烷基氰化物处理,溶液冷却到0℃后,用1.3ml(1.5g、10.7mmol)三氟化硼乙醚合物处理。将所得溶液加热到室温,室温下放置三小时后,反应混合物用100ml 10%碳酸钾水溶液处理,再用150ml乙醚处理。分离各相后,有机相用100ml 10%碳酸钾水溶液多洗几次。有机相用硫酸镁干燥后过滤,真空浓缩。对残留物采用色谱分离(350g硅胶、30%乙酸乙酯/己烷)得到11.9g(83%)的目标化合物。C17H26N2O5的分析计算值:C,60.34,H,7.74;N,8.28。实测值:C,60.06;氢,7.69;N,8.31。[α]D=-33.5°(c=1,CH2Cl2)B.将11.7g(34.6mmol)得自实施例1A的化合物与23.0g(69.2mmol)三丁基锡叠氮化物的混合物加热到100℃5天。混合物用100ml 6N盐酸处理后并继续到加热100℃。约18小时后,反应混合物冷却到室温,先后用50ml乙醚、50ml二氯甲烷和50ml乙醚萃取,真空浓缩水相。残余物经阳离子交换色谱分离产生悬浮在丙酮中的固体,回流1小时,然后过滤并用丙酮和乙醚洗涤,于60℃下真空干燥,获得8.5g(83%)目标化合物。C13H21N5O3·0.33H2O·0.33C3H6O的分析计算值:C,52.43;7.44;N,21.84。实测值:C,52.74;H,7.22;N,21.50。[α]D=-21.6°(c=1,1N HCl)
实施例2
3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-羧基)苯基)甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸的制备。A.将4-(二乙基磷酰基甲基)苯甲酸甲脂:25.0g(110mmol)4-溴代甲基苯甲酸甲脂和37ml(36.3g、220mmol)亚磷酸三乙酯的150ml甲苯的溶液回流加热18小时,然后冷却,真空浓缩。残余物用色谱分离(400g硅胶、乙酸乙酯)得到30.6g(98%)的目标化合物。B.3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-甲酯基)苯基)-甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸乙酯:将14.1g(49.4mmol)得自实施例2A的化合物和48ml双(三甲代甲硅烷基)氨化钠(1.0M溶液)的100ml THF溶液于0℃搅拌45分钟,然后用10.0g 3S,4aR,8aR-6-氧代-2-甲羟基-羰基-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-十氢异喹啉-3-羧酸乙酯在40ml THF中处理。在0℃下15分钟后,用100ml水骤冷,各用150ml乙醚萃取三次。用硫酸镁干燥合并的有机物,过滤并真空浓缩。残留物用500ml乙醚溶解,用3.0g、5%的碳载钯在室温和一个氢气压下氢化24小时。混合物用500ml乙醚稀释,通过硅藻土垫片过滤,滤液真空浓缩。对残留物用色谱分离法(400g硅胶、25%乙酸乙酯/己烷)得到12.0g(81%)目标化合物,为氢化过程从甲酯的酯基交换作用中得到的甲酯和乙酯混合物。C.将12.0克得自实施例2B的化合物与100ml 6N盐酸一起加热至回流18小时,然后冷却到室温。将所得固体过滤,用水、丙酮、乙醚洗涤,60℃下真空干燥,得到6.2g(57%)目标化合物。C18H23NO4·HCl·1.25H2O的分析计算值:C,57.44;H,7.10;N,3.72。实测值:C:57.44;H,6.69;N,3.76。[α]D=-4.8°(c=1,1N HCl)。