本发明涉及对醇或硫醇进行亚磷酰化(phosphitylation)的方 法，尤其涉及对核苷进行亚磷酰化而形成核苷亚磷酰胺的方法。
合成的低聚核苷酸是检测基因和病毒疾病的重要诊断工具。而 且，低聚核苷酸和修饰的低聚核苷酸作为抑制基因表达或蛋白质功能 的治疗候选物质是很有用的。由于FDA已批准将低聚核苷酸类似物用 于治疗细胞巨化病毒(CMV)，而且其它几种低聚核苷酸类似物目前也 正在进行临床试验，因此大规模合成作为治疗候选物质的低聚核苷酸 已变得越来越重要。每个临床试验中都需要数千克的纯化低聚核苷酸 类似物。
目前用于制备低聚核苷酸的主要方法是亚磷酰胺法。对于更大量 的低聚核苷酸的不断增长的需求也使亚磷酰胺化合物的需求量相应增 加。通常，亚磷酰胺化合物是在活化剂的存在下，将核苷用亚磷酰化 试剂进行亚磷酰化作用来制备。最常使用的活化剂为亲核活化剂1H- 四唑。但是，1H-四唑为爆炸性物质，因此用在大规模合成中可能带来 危险。
为了更容易地制备诊断和治疗用途的低聚核苷酸，则需要可促进 亚磷酰化作用又不会增加副产物的非爆炸性活化剂。
根据本发明，其提供了在活化剂存在下，用亚磷酰化试剂对醇或 硫醇进行亚磷酰化作用的方法，其特征在于，活化剂具有式1的结构：
式1中，p为0或1-4的整数。R在每次出现时为取代基，优选各自 独立为卤素、取代或未取代的脂肪族基团、-NR1R2、-OR3、-OC(O)R3、 -C(O)OR3、氰基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、-CHO、 -COR3、-NHCOR3、取代或未取代的芳烷基、卤代烷基(如，三氟甲基和 三氯甲基)，或-SR3。优选，R为卤素、取代或未取代的脂肪族基团、 -NR1R2、-OR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3或氰基。或者，两个相邻R基团与 其所连接的碳原子一起形成饱和或不饱和六元环，优选芳环。R1和R2各自独立为-H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳基、 取代或未取代的芳烷基；或与其所连接的氮原子一起形成杂环基。R 为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代 的芳烷基。X为O或S。优选，X为O。特别优选X为O，且p为0。
优选所使用的式1化合物为与有机碱形成的盐络合物。
在许多实施方案中，该醇或硫醇为含有游离羟基或硫醇基团的核 苷或低聚核苷酸，而且该醇或硫醇还包括含有天然核苷戊糖和非天然 核苷糖，如己糖的核苷和低聚核苷酸。当醇或硫醇为核苷或低聚核苷 酸时，其通常为被保护的脱氧核糖核苷、被保护的核糖核苷、被保护 的寡脱氧核糖核苷酸、被保护的寡核糖核苷酸，或具有脱氧核糖核苷 酸和核糖核苷酸部分的被保护的低聚核苷酸，其中各个部分都包括游 离的3’-或5’，优选3’-羟基或硫醇基团，且最优选为3’-羟基基团。
可按照本发明的方法进行亚磷酰化的醇和硫醇包括式2的化合 物：
其中，A代表
或
其中，X1每次出现时独立为-O-或-S-。优选，X1每次出现时均为-O-。 X2每次出现时独立为-O-、-S-、-CH2或-(CH2)2-。优选，X2每次出现时 均为-O-。X3每次出现时独立为O或S。在更优选的实施方案中，X1和 X2每次出现时各自为-O-。R4为醇保护基团或硫醇保护基团。优选，R 为对酸不稳定的保护基团。R5每次出现时独立为-H、-F、-OR6、-NR7R8、 -SR9，或取代或未取代的脂肪族基团，例如甲基或烯丙基。R10每次出 现时独立为磷保护基团，其通常为合成低聚核苷酸时使用的的可裂分 的磷保护基团，并优选为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代 的芳基或取代或未取代的芳烷基，例如式-CH2CH2CN、-CH2CH2CN、 -CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3、-CH2CH2-C6H4-NO2、 -CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3或-CH2CH2-C6H4-NO2的基 团。R6每次出现时独立为-H、取代或未取代的脂肪族基团(如，甲基、 乙基、甲氧基乙基或烯丙基)、取代或未取代的芳基、取代或未取代 的芳烷基、醇保护基团、特别是碱-不稳定的保护基团，或甲硅烷基保 护基团，或-(CH2)q-NR11R12。R7和R8每次出现时各自独立为-H、取代或 未取代的脂肪族基团，或氨保护基团。或者，R7和R8与其所连接的氮 原子一起为杂环基。R9每次出现时独立为-H、取代或未取代的脂肪族 基团，或硫醇保护基团。R11和R12各自独立为-H、取代或未取代的芳基、 取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代 的芳烷基、取代或未取代的杂芳烷基，或氨基保护基团。或者，R11和 R12与其所连接的氮原子一起形成杂环基。q为1-约6的整数。s为0 或正整数。优选，s为0、1或2，最优选为0。B各自独立为-H、天然 或非天然核碱、被保护的核碱、被保护的天然或非天然核碱、杂环或 被保护的杂环。
核苷碱包括天然存在的碱，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺 嘧啶和尿嘧啶，还包括经修饰的碱，例如7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8- 氮鸟嘌呤、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、7-脱 氮-8-氮腺嘌呤、7--脱氮-6-氧嘌呤、6-氧嘌呤、3-脱氮腺苷、2-氧-5- 甲基嘧啶、2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧 啶、4-氧-5-甲基嘧啶、2-氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、 8-氨基嘌呤、4-三唑-5-甲基胸腺嘧啶、4-三唑-5-甲基尿嘧啶和次黄 嘌呤。
被保护的核苷碱是指其中的反应性碱官能团被保护起来的核苷 碱。类似地，被保护的杂环是杂环中的反应性取代基被保护起来的杂 环。通常，核苷碱或杂环具有可被氨基保护基团(如酰胺或氨基甲酸 酯)保护起来的氨基基团。例如，腺嘌呤和胞嘧啶的氨基基团通常被 苯甲酰保护基团所保护，鸟嘌呤中的氨基基团通常被异丁酰基、4-异 丙基苯氧乙酰基或叔丁基苯氧乙酰基保护。但是，还可使用其它保护 方案，例如甲脒。例如，为了快速解保护，腺嘌呤和鸟嘌呤的氨基基 团用苯氧乙酰基进行保护，胞嘧啶的氨基基团用异丁酰基或乙酰基进 行保护。除去核碱或杂环保护基团的反应条件要取决于所用的保护基 团。使用酰胺保护基团时，可用碱溶液处理低聚核苷酸来除去保护基 团，该碱溶液例如为浓缩氢氧化铵溶液、正甲胺溶液或氢氧化铵中的 叔丁胺溶液。
氨、羟基和硫醇保护基团对本领域熟练技术人员来说是已知的。 氨保护基团的例子参见Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis(1991)，John Wiley & Sons，Inc.，309-405页，该文 献所教导的全部内容引入本文作为参考。优选，将氨保护为酰胺或氨 基甲酸酯。羟基保护基团的例子参见同上，10-142页，其全部教导引 入本文作为参考。可使用的保护基团的例子包括甲硅烷基，特别是三 烷基，例如三(C1-4烷基)甲硅烷基。优选的甲硅烷基保护基团为叔丁基 二甲基甲硅烷基。优选的羟基保护基团为叔丁基二甲基甲硅烷基。硫 醇保护基团的例子参见同上，277-308页，其全部教导引入本文作为 参考。
酸不稳定的保护基团是指通过使该基团与Bronsted或Lewis酸接 触可将其除去的保护基团。酸不稳定的保护基团对本领域熟练技术人 员来说是已知的。常用的酸不稳定保护基团的例子包括取代或未取代 的三苯甲基(同上，60-62页)、取代或未取代的四氢吡喃基团(同上， 31-34页)、取代或未取代的四氢呋喃基团(同上，36-37页)或pixyl 基团(同上，65页)。通常用给电子取代基，例如烷氧基基团取代三 苯甲基基团。优选的酸不稳定保护基团为取代或未取代的三苯甲基， 例如4，4’-二甲氧基三苯甲基(下文中为“DMT”)。
碱不稳定的保护基团是指通过使该基团与Bronsted或Lewis碱接 触可将其除去的保护基团。碱不稳定的保护基团对本领域熟练技术人 员来说是已知的。常用的碱不稳定保护基团的例子包括羰基化合物， 例如乙酰基、苯甲酰基和新戊酰基。
应当认识到，如果式2表达为给定醇的天然核苷构型(D-异构体)， 则本发明同样还可用于相应的合成或非天然醇构型(L-异构体)，以 及上述两种构型的混合物中。
可用于本发明方法中的亚磷酰化试剂通常具有下述化学通式：
R13-X6-PX4X5其中，R13表示磷保护基团，通常为合成低聚核苷酸中所用的可裂解的 磷保护基团，例如取代或未取代的脂肪族基团或芳烷基，例如甲基、 -CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3、-CH2CH2-C6H4-NO2，并优 选为式-CH2CH2CN的基团；取代或未取代的芳香族基团，例如苯基或取 代的苯基，例如4-氯苯基、2-氯苯基、2-硝基苯基或4-硝基苯基；X6代表O或S，并优选O；X4和X5可相同或不同，代表离去基团，例如卤 素，通常为溴或氯，或-NR14R15，其中R14和R15各自独立代表烷基，优 选C1-6烷基基团，或R14和R15与其所连接的N一起形成5-7元环。通 常X4和X5中的至少一个基团为式-NR14R15的基团。最优选，X4和X5相同， 并且尤其优选X4和X5都为-N[CH(CH3)2]2基团。特别优选X6为0且R15为-CH2CH2CN。
本发明的方法尤其适用于制备亚磷酰胺，尤其是核苷和低聚核苷 酸亚磷酰胺。
优选的亚磷酰化试剂的例子包括O-β-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异 丙基亚磷酰二胺(O-β-cyanoethy1-N，N，N’，N’- tetraisopropylphosphorodiamidite)，(通常称作“tetraphos”)、 O-β-氰基乙基-N，N，N’，N’-四甲基亚磷酰二胺、O-β-氰基乙基- N，N，N’，N’-四乙基亚磷酰二胺、双(N，N-二异丙基氨基)-2-甲基三氟乙 酰基氨基乙氧基膦、双(N，N-二异丙基氨基)-2-二苯甲基甲硅烷基乙氧 基膦和O-β-氰基乙基-双(N-吗啉代)亚磷酰二胺。
本发明的方法通常在0℃-约50℃的温度下进行，优选在环境温 度，例如约15℃-约30℃下进行。
有利的是使用基本无水的反应条件。
本发明的许多实施方案是在惰性气氛，例如氮气或氩气下进行。
根据本发明的方法可有利地用于制备核苷亚磷酰胺。因此，本发 明的优选方面包括制备下式化合物的方法：
其包括：使下式化合物：
其中，R4如上述定义，并优选为二甲氧基三苯甲基，R5如上述定义；
与下式化合物：
NCCH2CH2O-P(N(R16)2)其中，R16代表C1-6烷基，优选为异丙基；
在活化剂存在下进行反应，其中活化剂包括下式化合物：
及有机碱。
在许多实施方案中，活化剂按照与醇的化学计量摩尔比或小于化 学计量摩尔比的量使用，活化剂与醇的摩尔比为约0.4∶1-1∶1，尤 其优选为约0.5∶1-0.75∶1。
通常，亚磷酰化试剂按照与醇的化学计量摩尔比或过量使用，亚 磷酰化试剂与醇的摩尔比为约1∶1-3∶1，尤其优选为约1∶1-1.5∶ 1。
在有机碱存在下，本发明中所用的活化剂具有良好的溶解性，尤 其是在亚磷酰化反应常用的有机溶剂中。活化剂和有机碱的浓度可达 到活化剂在所用溶剂中的溶解度。在优选实施方案中，活化剂和有机 碱的存在浓度为约0.01M-约2M，例如约0.05M-约0.5M。通常活化 剂和有机碱的存在浓度可高达0.25M，例如约0.1M-约0.25M。在更 优选的实施方案中，活化剂和有机碱的摩尔浓度相同。在某些实施方 案中，有机溶剂为氯碳化合物，例如二氯甲烷。在优选的实施方案中， 有机溶剂包括乙腈。另一个优选实施方案中，有机溶剂包括有机酰胺， 例如二甲基甲酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮或1，3-二甲基-2-咪唑啉酮。
有机碱是指pH为7时趋向于接受质子的有机化合物。优选的有机 碱为仲胺、叔胺或氮杂环化合物，每种化合物均可被一个或多个取代 基取代或未取代。非质子有机碱是指接受质子之前其化学结构中不具 有氢键合质子的有机碱。优选将非质子有机碱，例如叔胺和非质子氮 杂环化合物与本文中描述的式1化合物结合使用，以改善亚磷酰化反 应。
本文中描述的氮杂环化合物包括芳环上具有一个或多个氮原子的 杂芳基，和非芳环体系上具有至少一个氮原子的杂脂环族基。优选， 氮杂芳基化合物具有5-或6-元芳环，且芳环上具有1-3个氮原子。 优选氮杂脂环基化合物为5-或6-元环，通常在环上包括一个或两个氮 原子。优选的氮杂环化合物为有机碱。有机碱氮杂环化合物的例子包 括嘧啶、1-烷基吡唑，特别是1-(C1-4烷基)吡唑、1-芳基吡唑、1-苄 基吡唑、吡嗪、N-烷基嘌呤，特别是N-(C1-4烷基)嘌呤、N-芳基嘌呤、 N-苄基嘌呤、N-烷基吡咯，特别是N-(C1-4烷基)吡咯、N-芳基吡咯、 N-苄基吡咯、吡啶、N-烷基咪唑，特别是N-(C1-4烷基)咪唑、N-芳基 咪唑，特别是N-苯基咪唑、N-苄基咪唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹 唑啉、N-烷基吲哚，特别是N-(C1-4烷基)吲哚、N-芳基吲哚，N-苄基 吲哚、N-烷基苯并咪唑，特别是N-(C1-4烷基)苯并咪唑、N-芳基苯并 咪唑、N-苄基苯并咪唑、三嗪、噻唑、1-烷基-7-吖吲哚，特别是1- (C1-4烷基)-7-吖吲哚、1-芳基-7-吖吲哚、1-苄基-7-吖吲哚、吡咯烷、 吗啉、哌啶和哌嗪。特别优选的氮杂环化合物为吡啶类，例如吡啶和 3-甲基吡啶，和N-(C1-4烷基)咪唑，例如N-甲基咪唑。
叔胺是指一种具有氮原子的有机碱，且其中的氮原子键合于三个 碳原子上，往往键合于三个芳基上，通常为苯基，和/或烷基，通常键 合于三个烷基上，该烷基包括，例如三烷基胺，例如三甲胺、三乙胺 和二异丙基乙基胺。此外，叔胺还可为氮杂环基团，且其中的氮原子 为非质子性。氮杂环基团类的叔胺为优选的。氮杂环叔胺的例子为N- 烷基吡咯烷、N-芳基吡咯烷、N-烷基吡咯、N-芳基吡咯、N-烷基吗啉、 N-芳基吗啉、N-烷基哌啶、N-芳基哌啶、N，N-二烷基哌嗪、N，N-二芳 基哌嗪、N-烷基-N-芳基哌嗪、奎宁环、1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬- 5-烯和1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。叔胺还可为氮杂芳基化 合物或氮杂杂脂环基化合物。
仲胺是指氮键合到单个氢和两个碳原子上的有机碱。通常，氮原 子键合到两个烷基或芳基上，或形成氮杂环基团的一部分。仲胺化合 物的例子包括二乙胺和二异丙基胺。
特别优选的有机碱包括吡啶、3-甲基吡啶和N-甲基咪唑。
脂肪族基团、芳基、芳烷基、杂芳基、氮杂芳基和杂脂环族基的 适当取代基包括芳基、卤代芳基、烷基、卤代烷基(如，三氟甲基和 三氯甲基)、脂肪族醚、芳香族醚、苄基、取代的苄基、卤素，尤其 是氯和氟、氰基、硝基、-S-(脂肪族或取代的脂肪族基团)，和-S-(芳 香族或取代的芳香族基团)。
本文中所用的脂肪族基团包括直链或支链的、完全饱和或含有一 个或多个非共轭双键的C1-C18烃，或完全饱和或含有一个或多个非共轭 双键的环状C3-C18烃。烷基基团为完全饱和的直链或支链C1-C8烃或 C3-C8环状烃。脂肪族基团优选为烷基。
芳基基团包括碳环芳环体系(如，苯基)，和稠合于一个或多个 碳环芳烃的碳环芳环体系(如，萘基和蒽基)，或稠合于一个或多个 非芳环的芳环体系(如，1，2，3，4-四氢萘基)。
本文中所用的杂环基团包括杂芳基和杂脂环族基。本文中所用的 杂芳基包括芳环上具有一个或多个选自硫、氮或氧的杂原子的芳环体 系。优选，杂芳基为具有1-4个杂原子的5或6元环体系。本文中所 用的脂肪族杂环基为非芳环体系，其优选具有5-6个原子并包括至少 一个选自氮、氧和硫的杂原子。杂环基团的例子包括吗啉基、哌啶基、 哌嗪基、硫代吗啉基、吡咯烷基、噻唑烷基、四氢thienyl、吖丁啶 基、四氢呋喃基、二氧己环基和二氧杂烷基(dioxepanyl)、噻吩 基、吡啶基、噻二唑基、噁二唑基、吲哚基、呋喃、吡咯、咪唑、吡唑、 三唑、嘧啶、吡嗪、噻唑、异噁唑、异噻唑、四唑、噁二唑、苯并噻吩、 苯并咪唑、吲哚、四氢吲哚、吖吲哚、吲唑、喹啉、咪唑并吡啶、嘌 呤、吡咯并[2，3-d]嘧啶和吡唑并[3，4-d]嘧啶。
本文中所用的芳烷基基团是指通过烷基进行连接的芳香族取代 基。优选的芳烷基包括苄基。
本文中所用的杂芳烷基基团是指通过烷基进行连接的杂芳基取代 基。
通过下面实施例对本发明进行非限制性的说明。
实施例1
按照下列步骤制备糖精的N-甲基咪唑盐。将糖精悬浮在乙腈中， 并向悬浮液中滴加相对于糖精为1.1当量的N-甲基咪唑。减压浓缩反 应混合物以形成结晶盐，用醚或己烷洗涤该结晶盐以除去痕量的N-甲 基咪唑和乙腈。
实施例2
使用O-β-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰胺，和作为活化剂 的糖精N-甲基咪唑盐来对一系列核苷进行亚磷酰化作用。
一般方法：
向适当尺寸的烧瓶中加入核苷(1.5mmol)，并与20mL吡啶一起 共沸蒸馏两次(旋转蒸发器)以干燥固体。用Ar吹扫烧瓶并向烧瓶中 加入15mL乙腈。室温下搅拌混合物直至获得澄清溶液。向混合物中加 入O-β-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰胺(Tetraphos)，之后 加入糖精的N-甲基咪唑盐。室温下搅拌混合物，同时用HPLC监测反应 直至结束。反应结束时，用30mL乙酸乙酯稀释混合物，并用2×25mL 的碳酸氢钠饱和水溶液和25mL氯化钠饱和水溶液洗涤有机混合物。分 离有机层并用MgSO4干燥。过滤悬浮液，并使用旋转蒸发器除去溶剂。 剩余物经真空干燥得到泡沫状物。
表1：amidite合成结果 Tctraphos (当量) 活化剂 (当量) 核苷 Rxn时 间(h) ％amiditea (HPLC) 产率b (％) 1.2 0.6 5’-DMT-N-Bz-deoxyA 7 91.9 84 1.2 0.5 5’-DMT-N-Bz-deoxyA 5 91.5 86 1.2 1.0 5’-DMT-N-Bz-deoxyA 5 89.8 87 1.2 0.5 5’-DMT-N-iBu-deoxyG 16 79.1 85 1.2 0.5 5’-DMT-N-Ac-2’-OMeC 5 5 89.3 85 1.2 0.6 5’-DMT-N-Bz-deoxyC 8 91.1 79 1.2 0.6 5’-DMT-2’-TBDMS-L-U 16 82.b 82 1.2 0.6 5’DMT-Ni-Bu-2’-TBDMS-L-G 1b 59.3 84 2.2 0.6 5’-DMT-N-iBu-2’-TBDMS-L-G 1b 87.4 82
a％amidite＝粗产物中的％amidite
b产率＝粗产物产率
实施例2
向500mL圆底烧瓶中加入5’-DMT-N-Bz-2’-去氧腺苷(18.00g， 27.37mmol)，并通过加入和蒸发(旋转蒸发器)2×200mL的甲苯来共 沸干燥固体。剩余物真空干燥16h。在氩气氛下将剩余物溶解在乙腈 (180mL)中，并加入O-β-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺 (9.90g，32.84mmol)。搅拌混合物5分钟并加入固体糖精N-甲基咪 唑盐(3.63g，13.69mmol)。室温下搅拌混合物，同时用HPLC监测 反应的进行。18h后，未观察到进一步反应。向反应混合物中加入乙酸 乙酯(200mL)，并用碳酸氢钠饱和水溶液(2×150mL)和氯化钠饱和 水溶液(150mL)洗涤有机溶液。分离有机层并用MgSO4干燥。过滤悬 浮液，并使用旋转蒸发器除去溶剂。剩余物经真空干燥16h得到白色 泡沫状物。
粗产率：23.70g
HPLC：92.5％
使用硅胶(230g)柱对粗产物(23.70g)进行色谱分离。用30％ 乙酸乙酯/含0.5％三乙胺的己烷装载色谱柱。用2倍柱体积的30％乙 酸乙酯/己烷洗涤色谱柱。将粗产物装载在色谱柱上，并用2倍柱体积 的30％乙酸乙酯/己烷、2倍柱体积的40％乙酸乙酯/己烷、2倍柱体 积的50％乙酸乙酯/己烷和最后的3倍柱体积的70％乙酸乙酯/己烷洗 脱色谱柱。当TLC(8∶3的乙酸乙酯∶己烷)检测出产物时收集馏分。 将含有所希望的产物的馏分合并起来，并使用旋转蒸发器除去馏分中 的溶剂。真空干燥剩余物16h得到白色泡沫状物。
产率：17.55g(75％)
HPLC：97.5％
31P NMR：99.3％