技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种重组人成纤维细胞生长因子21 融合蛋白的表达和纯化方法。
背景技术
据2011年WHO统计，全球糖尿病患者已达3.66亿，且每年均有460万人 死于此病；2012年“中国慢病监测及糖尿病专题调查”报告结果显示，中国已 有9700万的糖尿病患者，其中T2DM患者约占了95％，并且呈逐年增加趋势。目 前还没有确切有效的治疗方法可治愈该病，临床上使用的胰岛素、噻唑烷二酮等 药物均未达到标本兼治的目的，根据给药时间点只具有短期的降血糖作用，不能 满足机体的生理节律性调节机制，而且对肝肾功能有一定的损伤作用。因此，继 续寻找安全有效的治疗药物和方法仍然是当今急待解决的问题。
成纤维细胞生长因子21(Fibroblastgrowthfactor21，FGF21)是成纤维 细胞生长因子家族的新成员，是Nishimura等首次在小鼠胚胎组织中分离鉴定获 得。大量研究表明，FGF21是一种特异性作用于肝脏、胰岛和脂肪组织的新型糖 脂代谢调控因子，具有降低血脂、血糖、改善胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的作 用，在机体的糖脂代谢中具有重要作用。FGF21是FGFs家族成员中目前发现的 唯一没有促有丝分裂的基因，从而很大程度上降低了临床用药的潜在风险。正是 由于FGF21在糖脂代谢中具有独特的生物学功能和药理特性，成为了治疗T2DM 和代谢综合征的一个很有希望的治疗靶点。目前，FGF21的研究焦点主要在糖尿 病为主的代谢病，在糖尿病和肥胖动物模型的研究中显示出较好的抗糖尿病的特 点，同时可以使饮食引起肥胖的小鼠的代谢恢复正常，对于脂肪肝、肥胖和2 型糖尿病具有较强的治疗潜力。因此有国外学者预言，FGF21有望替代胰岛素成 为治疗糖尿病和肥胖病的一代新药，随之也成为了近年研究的一个热点，然而 FGF21基因工程蛋白药物的研究具有重要的现实意义。
根据报道目前表达该蛋白的系统有SUMO系统和酵母系统等，SUMO系统表达 该蛋白是用His标签的亲和层析进行融合蛋白纯化，酵母系统表达该蛋白是用离 子交换柱层析进行蛋白纯化，用以上的方法进行纯化后不仅蛋白损失大纯度也不 高等。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产方便、产量较高纯度高的制备重组人成纤维细 胞生长因子21融合蛋白的表达和纯化方法。
本发明的技术方案是：
一种含有重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其氨基酸序列为SEQID NO:1,编码该融合蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO:2。
以上SEQIDNO:1包括GST蛋白的氨基酸序列和重组人成纤维细胞生长因 子21的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。
以上SEQIDNO:1包括GST蛋白的核苷酸序列和重组人成纤维细胞生长因 子21的核苷酸序列(SEQIDNO:4)。
SEQIDNO:4的获得方式为以P1为上游引物，P2为下游引物，以人肝脏细 胞cDNA为模板，进行PCR扩增得出的核苷酸序列。
所述上游引物P1的序列为SEQIDNO:5，所述下游引物P2的序列为SEQID NO:6。
一种包含SEQIDNO:2的基因，以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ为酶切位 点，对SEQIDNO:4的序列进行酶切，插入到含有EcoRⅠ和BamHⅠ的载体中。
一种对以上融合蛋白的表达方法：将含有SEQIDNO:2的序列构建到载体 中，然后转入大肠杆菌BL21形成工程菌株，工程菌于37℃恒温振荡箱至OD值 为0.3时，加1mol/LIPTG5μl，开始摇菌诱导表达。
以上诱导表达的时间为6个小时。
对以上表达蛋白的纯化方法：
(1)PH值为8.0的PB缓冲液使菌体重悬，用超声破碎仪进行超声破碎 30min，超声破碎时菌液应保持低温2-8℃；
(2)超声破碎后菌体沉淀加预冷1％Triton10ml左右使菌体重悬，超 声破碎1min，4℃放置30min，4℃7000rpm离心15min，进行杂蛋白洗涤；
(3)沉淀分别用1mol/L、2mol/L、4mol/L尿素进行洗涤，4℃7000rpm 离心15min后收集沉淀；沉淀用8mol/L尿素溶解，4℃放置过夜。
(4)蛋白复复性：测定8mol/L尿素溶解的蛋白浓度后，用PB缓冲液将 蛋白溶液液稀释至终浓度为100μg/ml，4℃放置过夜。
(5)选用4FF胶装离子交换Q柱进行纯化；
(6)GST亲和柱纯化。
一种含有以上融合蛋白的药物。
本发明具有的优点和积极效果是：选用GST系统表达hFGF21蛋白，通过诱 导条件的优化大幅度提高了蛋白表达量；经过离子交换柱层析纯化和GST亲和柱 二次纯化，不仅可尽量减小蛋白的损失，还可有效提高蛋白纯度；对hFGF21蛋 白的成药性开发具有重要的现实意义。
附图说明
图1是重组质粒PGEX-5X-1-hFGF21酶切鉴定图。M：DL2000DNAmarker
1：重组质粒PGEX-5X-1-hFGF21酶切产物，从上到下亮带分别为质粒 PGEX-5X-1，目的基因hFGF21560bp。
图2是融合蛋白的优化表达鉴定SDS-PAGE图。从右到左分别为蛋白Marker、 0h菌体蛋白、2h菌体蛋白、4h菌体蛋白和6h菌体蛋白。
图3是融合蛋白的大量表达鉴定SDS-PAGE图。从左到右分别为蛋白Marker、 0h菌体蛋白和6h菌体蛋白。
图4是包涵体处理和蛋白复性的结果。1、菌体超声后的沉淀，2、1％Triton 洗后包涵体，3、1mol/L尿素洗后包涵体，4、2mol/L尿素洗后包涵体，5、4mol/L 尿素洗后包涵体，6、8mol/L尿素溶解后的蛋白溶液，7、稀释复性后的蛋白溶 液
图5Q柱离子交换层析纯化的穿透峰和洗脱峰。
图6是离子交换层析纯化后的融合蛋白(1、2均为纯化后样品)。
图7GST亲和柱二次纯化的洗脱峰。
图8GST亲和柱二次纯化后融合蛋白(1、2均为二次纯化后样品)。
图9WB鉴定hFGF21融合蛋白结果(1、空载体诱导后的总蛋白，2、二次纯 化后的融合蛋白)。
实施例1
构建pGEX-5X-1的hFGF21基因重组质粒
1.1PCR获取hFGF21成熟肽目的片段
以人肝脏细胞cDNA为模板加上下游引物进行PCR扩增。PCR体系:模板、 上下游引物各1μl，PCRmastermix12.5μl，H2O9.5μl；PCR条件:94℃10 min，94℃30s、52℃30s、72℃1min35个循环，72℃7min，4℃12min， PCR产物经1.4％琼脂糖凝胶鉴定并回收。
1.2载体PGEX-5X-1-hFGF21的构建
1.2.1质粒PGEX-5X-1和目的片段hFGF21连接
(1)先对质粒和PCR产物进行相应酶切，酶切体系：PGEX-5X-1质粒5μl， 10xQuikCutGreenBuffer2μl，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ各1μl， H2O11μl；hFGF21PCR产物片段12μl，10xQuikCutGreenBuffer2μl， 限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ各1μl，H2O4μl；酶切条件：水浴37℃15-30min， 然后分别回收。
(2)连接体系：目的片段15μl，质粒1μl，10xT4Buffer2.5μl， T4连接酶1μl，H2O5.5μl；条件：16℃放置16小时。
1.2.2.质粒的转化
(1)取-80℃冻存DH5α感受态细胞一支冰上融化，加入连接产物 PGEX-5X-1-hFGF21重组质粒轻柔混匀，冰水浴45min；
(2)42℃水浴90s，冰水浴2min；
(3)加入无选择性LB培养基800μl，37℃250rpm恒温振荡30min；
(4)无菌操作取200μl左右菌液接种于氨苄抗性固体培养基，涂板，培养 皿正放培养箱约30min后倒置，过夜培养。
1.2.3.质粒的提取
(1)对平板PGEX-5X-1-hFGF21DH5α挑选单克隆菌于5ml加氨苄(1：1000) 5μl的灭菌LB液体培养基中，37℃250rpm恒温过夜摇菌；
(2)每5ml菌液全部收集于1.5ml离心管，室温8000xg离心2min；
(3)菌体沉淀加250μlBufferp1移液枪吸打使菌体重悬再加1μlvisual Lyes振荡混匀，出现浑浊现象；
(4)加250μlBufferp2，立即温和颠倒离心管混匀，室温静置4min，溶 液应呈均匀的蓝色；
(5)加350μlBufferp3，立即温和颠倒离心管充分混匀，溶液有蓝色变 为无色并伴有大量絮状沉淀，室温静置2min；
(6)12000xg离心10min，上清小心移入吸附柱，9000xg离心30s， 弃去收集管中废液，吸附柱放回收集管；
(7)吸附柱中加入去蛋白液BufferDW1500μl，9000xg离心30s，弃 去收集管中废液，吸附柱放回收集管；
(8)吸附柱中加入500μlWashsolution，9000xg离心30s，弃去收集 管中废液，吸附柱放回收集管，重复一次；
(9)将空吸附柱和收集管放入离心机9000xg离心2min；
(10)将吸附柱放到灭菌1.5ml离心管中，在吸附膜中央加50μlElution Buffer，室温静置2min，9000xg离心1min，所得质粒DNA溶液-20℃保存备 用
(11)取样适量用于测序。
1.2.4.酶切和测序鉴定
(1)酶切体系：重组质粒5μl，10xQuikCutGreenBuffer1μl，限 制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ各0.5μl，H2Oμl，共10μl。
(2)酶切条件：37℃水浴15-30min；
(3)跑1.4％琼脂糖凝胶，紫外仪观察载体PGX-1-hFEX-5GF21是否构建成 功。
实施例2
hFGF21成熟肽的诱导表达
2.1.将PGEX-5X-1-hFGF21重组质粒转化至BL21感受态细胞。
2.2优化诱导条件
(1)取一支装有5ml灭菌LB液体培养基的试管，无菌操作加100mg/mlAmp5 μl摇匀，挑取生长状态良好单克隆菌放入试管，37℃250rpm/min恒温振荡过 夜；
(2)取装有5ml灭菌LB液体培养基的试管，无菌操作加100mg/mlAmp5μl 摇匀，取菌液50μl转接到试管中；
(3)试管于恒温振荡箱37℃250rpm/min摇菌1.5-2小时左右测OD值为0.3 时，加1mol/LIPTG5μl，开始摇菌诱导；
(3)在加诱导剂后的0、2、4、6h分别取样1ml菌液至1.5ml离心管4℃7500 rpm离心3min，弃上清-20℃保存；
(4)将0、2、4、6h的菌体沉淀样品各加水100μl重悬，分别取样30μl于 1.5ml离心管，分别加5μl5x蛋白上样缓冲液混匀，100℃处理10min；跑 蛋白电泳；
(5)蛋白胶用考马斯亮蓝染色过夜，次日蛋白胶脱色液脱色2次每次2小时， 可观察到不同诱导时间的蛋白表达量。结果此方案在6h时重组蛋白大量表达， 分子量大小为45kD左右，见附图2。
2.3.大瓶诱导蛋白表达
(1)根据优化好的条件，取一支装有5ml灭菌LB液体培养基的试管，无菌操作 加100mg/mlAmp5μl摇匀，挑取生长状态良好单克隆菌放入试管，37℃ 250rpm/min恒温振荡过夜；
(2)取装有200ml灭菌LB液体培养基的锥形瓶无菌操作加100mg/mlAmp200 μl摇匀，取试管菌液2ml转接到锥形瓶，恒温振荡箱37℃250rpm/min摇菌 1.5-2小时左右测OD值为0.3时，加1mol/LIPTG200μl，开始摇菌诱导；
(3)6h取样收集菌液，菌液收集于一支50ml离心管，离心机7000rpm4℃离 心15min，弃上清，hFGF21菌体沉淀-70℃冻存备用；
(4)采集到的样品经过处理，跑蛋白胶电泳，蛋白胶用考马斯亮蓝染色过夜， 蛋白胶脱色液脱色2次每次2小时。结果表明，大瓶诱导在6h该重组蛋白依然 大量表达，分子量大小为45kD左右，说明优化后的条件可行，结果见图3。
实施例3
重组蛋白的纯化
3.1包涵体的处理及复性
3.1.1.包涵体处理
(1)每个50ml管的菌体沉淀加入预冷30mlPH值为8.0的PB缓冲液使菌 体重悬，用超声破碎仪进行超声破碎30min，超声破碎时菌液应保持低温2-8℃；
(2)破碎后7500rpm4℃离心10min，上清取样100μl，沉淀取样用100 μl水溶，再分别取30μl加5μl5xSDS-PAGE上样缓冲液煮沸10min，跑蛋 白胶检验蛋白是否在包涵体中表达。
(3)超声破碎后菌体沉淀加预冷1％Triton10ml左右使菌体重悬，超声 破碎1min，4℃放置30min，4℃7000rpm离心15min，进行杂蛋白洗涤；
(4)沉淀加1mol/L尿素5-10ml使沉淀重悬，4℃放置30min，离心机4℃ 7000rpm离心15min；
(5)沉淀加2mol/L尿素5-10ml使沉淀重悬，4℃放置30min，离心机4℃ 7000rpm离心15min处理；
(6)沉淀加4mol/L尿素5-10ml使沉淀重悬，4℃放置30min，离心机4℃ 7000rpm离心15min处理；
(7)沉淀加8mol/L尿素3-5ml刚好溶解沉淀，4℃放置过夜，离心机4℃ 7000rpm离心15min处理；取上清测定蛋白浓度。
3.1.2.蛋白复性
(1)酶标仪测蛋白浓度，96孔板选两孔分别加180μlBradford蛋白测定 试剂，空白样孔加20μlPB，需测样加8mol/L尿素溶解物20μl室温静置10min 同时酶标仪开机预热，然后于波长595nm处进样测得C空白和C样品，二者求 差，记做Y，然后根据标准曲线方程Y＝0.002X+0.04，求x即为需测蛋白浓度；
(2)用PB缓冲液稀释蛋白液至终浓度为100μg/ml，4℃放置过夜。
包涵体处理和蛋白复性的结果见附图4。
3.2离子交换柱层析纯化
选用4FF胶装离子交换Q柱，根据该重组融合蛋白的等电点预测出缓冲液的 PH为8.0，然后在纯化层析仪上用PH8.0的PB缓冲液1.0ml/min的流速平衡该 Q柱。柱子平衡后把复性后的蛋白溶液用0.5ml/min流速上样，记录穿透峰，并 用预实验筛选好的4mol/L的NaCl溶液进行洗脱，同时收集洗脱峰的层析液，该 层析液即为通过离子交换层析纯化的融合蛋白，大部分杂蛋白已经被去除，但还 有少部分杂蛋白存在，纯化的波峰图和电泳图见图5和图6。
3.3GST亲和柱纯化
将GE公司的GST胶装柱后，用相应的蛋白上样缓冲液PH值为7.2的Buffer A以1.0ml/min的流速平衡柱子，同时对以上用离子交换层析纯化的融合蛋白进 行脱盐处理并以1:50的比例用BufferA稀释。待GST柱平衡好后把稀释后的蛋 白溶液用0.2ml/min流速上样，记录穿透峰，并用1mol/L的还原型谷胱甘肽溶 液进行洗脱，同时收集洗脱峰的层析液，该层析液即为通过GST亲和纯化的融合 蛋白，融合蛋白的纯度明显提高，二次纯化的波峰图和电泳图见图7和图8。
实施例4
hFGF21融合蛋白的WesternBlot活性鉴定
取二次纯化后的融合蛋白液，上样总蛋白量约20ng，加5xSDS-PAGE上样 缓冲液，100℃煮沸10min；制胶，上样，跑蛋白胶；转膜；转膜结束后用5％ 脱脂奶粉封闭液在平皿中室温低频率摇床封闭2小时，将一抗用封闭液稀释，稀 释比例1:2000，将膜放入槽中加入稀释抗体室温下孵育1小时，取出膜用1xTBS 洗膜三次每次5min；将用红色荧光标记的WB二抗用封闭液稀释，稀释比例 1:10000，将膜放入槽中加入稀释抗体室温下孵育1小时，取出膜用1xTBS洗 膜三次每次10min；将膜放入红外活体成像仪进行扫膜。结果表明所诱导表达和 纯化的hFGF21融合蛋白能与hFGF21抗体特异性结合，证明该融合蛋白是hFGF21 的融合蛋白，见图9。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳 实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均 等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。