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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410478959.6 (22)申请日 2014.09.18 (73)专利权人 中国农业科学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市武昌区徐东二 路2号中国农业科学院油料作物研究 所 (72)发明人 单志慧陈海峰杨中路邱德珍 赵胜陈李淼张婵娟袁松丽 张晓娟陈水莲万乔周新安 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅白艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 曲凯。
2、 (54)发明名称 一个与大豆抗锈病基因位点紧密连锁的分 子标记GmSSR18-40及其应用 (57)摘要 本发明公开了一个与大豆抗锈病基因位点 紧密连锁的GmSSR18-40及其应用。 本发明提供的 鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的方法， 包括如下步 骤： 分别以待鉴定大豆和SX6907的基因组DNA为 模板， 用由序列表中序列1和序列表中序列2所示 的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增， 电泳检测扩增产物， 按照标准确定所述待鉴定大 豆的抗病性， 本发明利用高抗锈病大豆SX6907材 料与2个非抗锈病大豆材料杂交， 构建遗传群体， 定位抗锈病基因， 开发紧密连锁的分子标记， 并 进行。
3、分子标记辅助选择， 可提高选择效率， 加快 育种进程。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图1页 CN 104232775 B 2016.08.24 CN 104232775 B 1.鉴定或辅助鉴定大豆锈病抗性的方法， 包括如下步骤： 分别以待鉴定大豆、 SX6907的 基因组DNA为模板， 用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成的PCR引 物对进行PCR扩增， 通过电泳检测扩增产物， 按照如下方法确定所述待鉴定大豆对锈病的抗 性： 如果待鉴定大豆的PCR扩增产物电泳条带有与SX6907带型相同的条带， 则待鉴定大豆 为抗锈病大豆或候选为抗锈病大豆， 如果待鉴定大豆。
4、的PCR扩增产物电泳条带没有与 SX6907带型相同的条带， 则待鉴定大豆为非抗锈病大豆或候选为非抗锈病大豆； 所述待鉴 定大豆为天隆一号和SX6907的杂交后代。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3.权利要求1或2所述方法的用途， 所述用途为1)、 2)或3)： 1)权利要求1或2所述方法在大豆育种中的应用； 2)权利要求1或2所述方法在大豆抗锈病早期预测中的应用； 3)权利要求1或2所述方法在筛选抗锈病大豆中的应用。 4.鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的引物对， 由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两 条单链DNA组成。 5.含有权利要求4所述的引。
5、物对的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的试剂或试剂盒。 6.根据权利要求5所述的试剂， 其特征在于： 所述引物对中的各条引物在所述试剂中的 终浓度为2.5ng/ l。 7.权利要求4所述的引物对、 权利要求5所述的试剂或试剂盒的用途， 所述用途为a)、 b) 或c)： a)权利要求4所述的引物对、 权利要求5所述的试剂或试剂盒在大豆育种中的应用； b)权利要求4所述的引物对、 权利要求5所述的试剂或试剂盒在大豆抗锈病早期预测中 的应用； c)权利要求4所述的引物对、 权利要求5所述的试剂或试剂盒在筛选抗锈病大豆中的应 用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104232775 B 2 一个与大豆抗锈病。
6、基因位点紧密连锁的分子标记GmSSR18-40 及其应用 技术领域 0001 本发明属于大豆分子生物学及遗传育种技术领域。 更具体涉及一个与大豆抗锈病 基因位点紧密连锁的分子标记GmSSR18-40及其应用， 同时还涉及该分子标记在大豆抗锈病 育种中的应用。 背景技术 0002 大豆是一种重要农作物， 起源于中国， 在美国、 巴西、 阿根廷、 中国和印度等国家广 为种植。 大豆富含蛋白质和脂肪以及对人体有利的活性成分如皂贰、 异黄酮、 磷脂等， 是世 界上植物性蛋白和油分的主要来源之一。 目前我国大豆种植面积、 总产及单产均居世界第 四位， 生产水平落后于世界大豆生产。 2012年中国大豆种植。
7、面积685万公顷， 总产量1220万 吨， 而进口大豆达创记录的6340万吨， 占据我国六分之五的大豆市场。 造成我国大豆生产滞 后、 供给严重不足、 国内大豆产业遭受进口转基因大豆严重冲击的原因是多方面的， 但主要 原因之一是综合抗病虫害和抗逆能力差， 单产低， 种植效益低下， 国际竞争力弱。 0003 大豆锈病是一种气传病害、 一种多循环病害， 是大豆上最具破坏性的病害之一。 它 的寄主主要是豆类作物， 还有野葛、 栽培葛等， 在南方主要的越冬寄主是野葛， 野葛冬天不 落叶， 一年四季都能被锈菌侵染， 冬季最严重， 锈菌可寄生在上面成为第2年的初侵染来源。 20世纪60年代前主要发生在东半。
8、球， 70年代后西半球的大豆也有发生。 由于大豆锈病是气 传病害， 严重危害时产量损失达80， 因此世界上许多大豆生产国都关注该病害的研究。 2004年,大豆锈菌正式登陆美国大陆,并迅速传至北部,由于目前还没有有效的抗病品种和 防治方法,每年造成的损失高达70亿至100亿美元。 随着全球气候的逐渐变暖,大豆锈病开 始向高纬度地区蔓延,锈病对大豆生产的危害已经引起全球大豆生产者的高度重视。 0004 中国农业科学油料作物研究所大豆研究室采用离体叶片接种方法对1000余份大 豆种质资源进行抗性筛选， 获得1份高抗锈病材料SX6907(单志慧等， 一个大豆锈病新抗源 的筛选与鉴定， 中国油料作物学报。
9、， 2012， 34： 188-192)， 该材料在接种锈菌后20天不产生侵 染病斑， 在接种高浓度锈菌时， 产生少数红褐色病斑， 但无孢子堆破裂现象， 无孢子产生。 组 织学观察表明， SX6907在接种部位造成细胞坏死， 侵染点无孢子形成， 其抗性表现为抗锈菌 扩展。 发明内容 0005 本发明一个目的是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的方法及其在育种中的运用。 0006 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的方法， 包括如下步骤： 分别以待鉴 定大豆和SX6907的基因组DNA为模板， 用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单 链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增， 通过电泳检测。
10、扩增产物， 按照如下方法确定所述待鉴 定大豆的抗病性： 0007 如果待鉴定大豆的PCR扩增产物电泳条带有与SX6907带型相同的条带， 则待鉴定 说明书 1/9 页 3 CN 104232775 B 3 大豆为抗锈病大豆或候选为抗锈病大豆， 如果待鉴定大豆的PCR扩增产物电泳条带没有与 SX6907带型相同的条带， 则待鉴定大豆为非抗锈病大豆为或为候选非抗锈病大豆； 所述待 鉴定大豆为天隆一号和SX6907的杂交后代， 上述方法中， 所述待鉴定大豆具体选自天隆一 号SX6907的杂种后代中的F2单株。 在本发明的一个实施例中， 所述待鉴定大豆具体选自 天隆一号SX6907的F2单株。 000。
11、8 上述方法中， 所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳， 在所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中， 所 述聚丙烯酰胺凝胶的浓度6。 0009 上述方法中， 所述PCR扩增中先进行10个第一个循环后再进行25个第二个循环， 所 述第一个循环的引物退火条件为5530s， 所述第二个循环的引物退火条件为5330s。 0010 其中， 所述第一个循环的温度程序是： 先9430s， 然后5530s， 最后721min； 所 述第二个循环的温度程序是： 先9430s， 然后5330s， 最后721min。 0011 上述方法中， 所述抗锈病(R)大豆是指接种后2周仅在接种部位有少量红褐色病 斑， 病斑周围组织不发生黄化， 无。
12、黄褐色病斑； 若无孢子堆形成为高抗， 若有孢子堆形成， 并 有少量孢子释放为中抗锈病(M)； 非抗锈病(S)大豆是指接种后3-5天出现侵染病斑， 为典型 黄褐色病斑， 5-7天后侵染点周围变黄， 侵染点逐步变大， 叶片上相邻的黄色部分连成片， 10 天后， 侵染点病斑破裂， 有大量孢子释放。 0012 上述方法可用于大豆育种、 大豆抗锈病的早期预测或筛选抗锈病大豆。 0013 在大豆育种中， 可利用上述方法鉴定出抗锈病大豆进行育种。 0014 本发明所要解决的另一个技术问题是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的引物对。 0015 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的引物对， 名称为GmSSR18。
13、-40， 由序 列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成。 0016 其中， 序列表中序列1由26个脱氧核苷酸组成， 序列表中序列2由24个脱氧核苷酸 组成。 0017 含有上述引物对GmSSR18-40的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的试剂或试剂盒也属 于本发明的保护范围。 0018 上述引物对GmSSR18-40、 含有上述引物对GmSSR18-40的试剂或试剂盒的下述a)、 b)或c)用途也属于本发明的保护范围： 0019 a)在大豆育种中的应用； 0020 b)在大豆抗锈病的早期预测中的应用； 0021 c)在筛选抗锈病大豆中的应用。 0022 本发明的引物对GmSSR18-40。
14、距抗锈病基因位点0.5cM， 是与抗锈病基因位点紧密 连锁的分子标记(P0.0007)， 是基于PCR技术的共显性SSR标记， 因而可靠且使用方便。 0023 本发明的引物对GmSSR18-40， 是与基因位点rpp.18-1紧密连锁的标记， 是基于PCR 技术的共显性SSR标记， 因而可靠且使用方便。 0024 实验证明， 利用引物对GmSSR18-40对大豆育种材料辅助鉴定的结果与抗病鉴定结 果完全一致， 这表明引物对GmSSR18-40用于大豆抗锈病育种的分子标记辅助选择是切实有 效的。 0025 本发明通过对大豆抗锈病基因的定位， 并开发与其紧密连锁的分子标记GmSSR18- 40， 。
15、该标记可用于分子标记辅助选择。 在常规育种方法中， 大豆的对锈病的抗性鉴定比较繁 说明书 2/9 页 4 CN 104232775 B 4 琐， 对鉴定技术要求比较高， 选择效率低下。 通过检测抗锈病基因位点来预测大豆对锈病的 抗性， 可以在苗期进行淘汰， 不仅节约生产成本而且大大提高选择效率， 从而加快育种进 程。 本发明中抗锈病基因位点位置明确， 基因位点的检测方法方便快速， 不受环境影响。 通 过检测与抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记， 即可确定大豆对锈病的抗性， 进而准确快 速筛选高抗锈病的材料。 0026 本发明利用高抗锈病大豆SX6907材料与2个非抗锈病大豆材料杂交， 构建遗传群。
16、 体， 定位抗锈病基因， 开发紧密连锁的分子标记， 并进行分子标记辅助选择， 可提高选择效 率， 加快育种进程。 附图说明 0027 图1为利用GmSSR18-40对1-28的F2代单株、 母本和父本的基因组DNA进行PCR得到 的PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 0028 其中， 1-28为材料编号， P1和P2分别代表母本天隆一号和父本SX6907 0029 图2为标记GmSSR18-40与抗锈病基因位点rpp.18-1的连锁分析 0030 其中， 括号内数据单位为cM 具体实施方式 0031 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0032 下述实施例中所用的材料。
17、、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0033 大豆天隆一号(陈李淼等， 利用农杆菌介导法转化大豆子叶节的影响因素研究， 大 豆科学， 2012， 1： 17-23)和SX6907(单志慧等， 一个大豆锈病新抗源的筛选与鉴定， 中国油料 作物学报， 2012， 34： 188-192)公众可从商业途径获得， 也可从中国农业科学院油料作物研 究所获得， 以重复本发明实验。 0034 在以下的实施方案中， 除非特别说明， 否则所有操作均按照 分子克隆实验指南 (第三版)(黄培堂等译， 北京:科学出版社， 2002)所提供的方法进行。 0035 实施例1、 利用引物对GmSSR18-4。
18、0鉴定天隆一号SX6907的F2单株对锈病的抗性 0036 一、 鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的PCR试剂 0037 本实施例的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的PCR试剂由PCR引物对GmSSR18-40、 10 Taq缓冲液， dNTP混合物， MgCl2溶液、 TaqDNA聚合酶和ddH2O组成。 0038 其中， PCR引物对GmSSR18-40由正向引物和反向引物这两条单链DNA组成， 其序列 如下： 0039 正向引物:5 -TTGACTTCTTTACAAACAAATGTTGA-3 (序列表中序列1)， 0040 反向引物:5 -CCAAGTCTAACTTTTTCCCTCAAA-3 (序列表中。
19、序列2)。 0041 二、 待鉴定大豆 0042 天隆一号SX6907的F2分离群体是按照如下方法获得： 天隆一号和SX6907杂交， 杂交后代自交， 即为F2分离群体。 0043 三、 田间实验和利用引物对GmSSR18-40鉴定待鉴定大豆对锈病的抗性 0044 天隆一号SX6907的杂种后代中的F2单株种植于中国农业科学院油料作物研究 所试验农场。 说明书 3/9 页 5 CN 104232775 B 5 0045 在本发明的一个实施例中， 待鉴定大豆具体选自天隆一号SX6907的F2单株。 0046 上述方法中， 抗锈病(R)大豆是指接种后2周仅在接种部位有少量红褐色病斑， 病 斑周围组。
20、织不发生黄化， 无黄褐色病斑； 若无孢子堆形成为高抗， 若有孢子堆形成， 并有少 量孢子释放为中抗锈病(M)； 非抗锈病(S)大豆是指接种后3-5天出现侵染病斑， 为典型黄褐 色病斑， 5-7天后侵染点周围变黄， 侵染点逐步变大， 叶片上相邻的黄色部分连成片， 10天 后， 侵染点病斑破裂， 有大量孢子释放。 0047 (二)利用引物对GmSSR18-40鉴定大豆的对锈病的抗性 0048 在步骤(一)编号为1-30的家系的F2单株、 母本天隆一号(P1)和父本SX6907(P2)的 3叶期分别采集大豆叶片提取其基因组DNA， 利用引物对GmSSR18-40进行PCR扩增， 对得到的 PCR扩增。
21、产物进行60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为5)电泳， 检测电泳条带大小。 0049 具体的实验方法如下： 0050 1、 用CTAB法(KeimP.ArapidprotocolforisolatingsoybeanDNA.Soybean genetnewslett,1988,15:147-148)提取叶片基因组DNA 0051 (1)取0.5g新鲜叶片放入1.5m1离心管中， 用玻璃棒磨为匀浆， 加入700 l经65预 热30min的CTAB溶液和20 l -巯基乙醇摇匀， 放入65的水浴锅中水浴30min。 0052 (2)取出离心管， 加入700 l氯仿-异戊醇(24： 1/v： v)。
22、轻摇几次， 静置30min后 12000rpm， 离心10min。 0053 (3)吸取上清液， 加入2倍体积的冰冻无水乙醇， 置于-20冰箱30min。 12000rpm离 心10分钟让DNA沉淀， 倒掉离心管中乙醇溶液。 0054 (4)用75(V/V)乙醇清洗2-3次， 倒乙醇溶液， 打开离心管盖置于通风橱内吹干。 0055 (5)加入200 l双蒸水溶解DNA， 用紫外分光光度计测定DNA的浓度， 并稀释成25ng/ l， 于-20冰箱中保存备用。 0056 2、 分别以步骤1提取的天隆一号和SX6907的F2单株1-30及亲本的基因组DNA为模 板， 利用引物对GmSSR18-40进。
23、行PCR扩增， 反应体系如表1: 0057 表1为反应体系 0058 成份体积终浓度 DNA模板(25ng/ l)2 l2.5ng/ l 正向引物(50ng/ l)1 l2.5ng/ l 反向引物(50ng/ l)1 l2.5ng/ l 10Taq缓冲液1 l MgCl2(25mM)1 l1.25mM/ l dNTPs混合物(10mM)0.2 l0.1mM/ l TaqDNA聚合酶(5U/ l)0.1 l0.025U/ l ddH2O13.7 l 总体积20 l 0059 PCR反应温度程序:先945min(预变性)； 然后进行10个如下循环： 先9430s(变 性)， 然后6030s(引物退。
24、火)， 最后721min(引物延伸)； 然后进行25个如下循环： 先94 30s(变性)， 然后5330s(引物退火)， 最后721min(引物延伸)； 最后7210min。 说明书 4/9 页 6 CN 104232775 B 6 0060 PCR反应完成后， 在扩增产物中加入等体积的上样缓冲液进行下述步骤3的60g/L 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 0061 3、 60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 0062 试剂配制: 0063 试剂1： 5TBE 0064 Tris-base 53.9克 0065 EDTA3.72克 0066 硼酸27.5克 0067 用超纯水定容至1升。 0068 试剂2。
25、： 60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶 0069 0070 试剂3： 粘剂 0071 无水乙醇500毫升 0072 冰醋酸5毫升 0073 反硅化剂(Me-T)5毫升 0074 试剂4： 不粘剂 0075 无水乙醇500毫升 0076 硅化剂14毫升 0077 试剂5： 50上样缓冲液 0078 甲酰胺200毫升 0079 二甲苯青2.5克 0080 溴酚蓝2.5克 0081 试剂6： 固定液 0082 冰醋酸150毫升 0083 纯水1.35升 0084 试剂7： 染色液 0085 硝酸银1.5克 0086 甲醛2.0毫升 0087 用纯水定容至1.5升。 0088 试剂8： 显影液 0089 碳。
26、酸钠45克 0090 硫代硫酸钠(10mg/ml)200微升 0091 甲醛(37)2.0毫升 0092 用纯水定容至1.5升。 说明书 5/9 页 7 CN 104232775 B 7 0093 胶板制备： 0094 短胶板在下， 放置胶条， 再放上长胶板。 然后用夹子对称地夹好两块胶板。 取70ml 的60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶， 加入200 l过硫酸铵和40 lTEMED迅速搅拌混匀。 缓慢把胶 液灌入胶板中， 待胶液灌满整个胶板时， 将齿状梳子平端插入胶板中适当距离。 0095 电泳： 0096 待胶液凝固后， 将齿状梳子取出， 用自来水冲洗凝胶顶部。 然后将胶板置入电泳槽 中， 并。
27、在上下槽中注入适量的1TBE电泳缓冲液。 打开电源， 2000伏特预热20分钟。 在PCR产 物中加入上样缓冲液10 l， 在95下加热变性5分钟， 然后迅速置于冰上。 用吸管吹打凝胶 顶部以吹出杂物。 将梳子齿端插入凝胶适当位置。 吸取样品2.5 l， 依次加入加样孔。 2000伏 特， 80瓦， 电泳70-80min。 电泳完毕后， 切开电源， 把胶板从电泳槽中取出。 0097 染色: 0098 浆胶板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色， 在蒸馏水盆中漂洗两 次， 每次2-3分钟。 取出胶板面向上放入染色液盆中染色30分钟。 取出胶板， 在蒸馏水盆中漂 洗10秒左右。 取出胶板。
28、面向上放入预冷(4)的显影液中， 轻轻摇动至条带清晰可见。 取出 胶板面向上放入固定液盆中， 以终止显影。 在蒸馏水盆中漂洗3分钟， 室温下自然凉干， 拍照 保存。 0099 5、 带型判读 0100 将显影后自然干燥好的玻璃板置于灯箱上， 肉眼观察各个单株与两亲本条带的位 置差异。 天隆一号的PCR产物是一个条带， 命名为条带A； SX6907的PCR产物是一个条带， 命名 为条带B； 条带A的大小明显小于条带B。 各个单株带型与天隆一号相同读作A， 带型与SX6907 相同读作B， 两条带型分别与天隆一号和SX6907相同读作H， 缺失和其它带型读作。 结果如 图1所示， 表明单株1、 2。
29、、 3、 16、 17、 18、 19、 21、 22、 23、 24、 25这12个单株与天隆一号带型相同， PCR产物均是大小相同的条带A。 单株12、 13、 14、 15、 26、 27、 28这7个单株与天隆一号和 SX6907带型相同， PCR产物均是大小相同的条带A和条带B组成， 即H型条带。 单株4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 20这9个单株与SX6907带型相同， PCR产物均是大小相同的条带B。 0101 根据PCR扩增产物凝胶电泳条带与母本天隆一号、 父本SX6907的异同鉴定预测F2 单株1-28对锈病的抗性： 如果待鉴定大豆PCR扩增产物凝胶电泳条。
30、带有与SX6907带型相同 的条带， 则待鉴定大豆为抗锈病大豆或为候选抗锈病大豆， 如果PCR扩增产物凝胶电泳条带 没有与SX6907带型相同的条带， 则待鉴定大豆为非抗锈病大豆或为候选非抗锈病大豆。 0102 本发明利用引物对GmSSR18-40鉴定大豆抗锈病的方法鉴定的结果是单株1、 2、 3、 16、 17、 18、 19、 21、 22、 23、 24、 25这12个单株单株以及天隆一号均为非抗锈病大豆或候选非 抗锈病大豆， 单株12、 13、 14、 15、 26、 27、 28这7个单株为中抗锈病大豆或候选中抗锈病大豆 (也属于抗锈病大豆)， 单株4、 5、 6、 7、 8、 9、。
31、 10、 11、 20这9个单株以及SX6907均为抗锈病大豆 或候选抗锈病大豆。 0103 人工接种鉴定的方法见实施例2中的抗锈病鉴定， 结果见表2。 0104 表2.天隆一号、 SX6907及天隆一号SX6907的F2单株1-30的抗锈病鉴定及利用引 物对GmSSR18-40得到的PCR产物带型 0105 家系编号带型抗锈病鉴定家系编号带型抗锈病鉴定 说明书 6/9 页 8 CN 104232775 B 8 1AS15HM 2AS16AS 3AS17AS 4BR18AS 5BR19AS 6BR20BR 7BR21AS 8BR22AS 9BR23AS 10BR24AS 11BR25AS 12。
32、HM26HM 13HM27HM 14HM28HM 天隆一号ASSX6907BR 0106 表2中， 带型A表示引物对GmSSR18-40PCR扩增产物凝胶电泳条带与天隆一号相 同， 带型B表示引物对GmSSR18-40PCR扩增产物凝胶电泳条带与SX6907相同， 带型H表示引 物对GmSSR18-40PCR扩增产物凝胶电泳条带分别与天隆一号和SX6907相同。 抗锈病鉴定S 表示该单株为非抗锈病大豆， M表示该单株为中抗锈病大豆， R表示该单株为抗锈病大豆。 0107 以上实验结果说明利用引物对GmSSR18-40鉴定大豆对锈病的抗性与人工接种鉴 定的结果一致， 说明本发明利用引物对GmSS。
33、R18-40鉴定大豆对锈病的抗性的方法准确性 高。 0108 实施例2、 引物对GmSSR18-40的获得 0109 使用的分离群体为非抗锈病大豆品种中豆40(张诚， 介绍6个国审大豆品种， 农家 顾问， 2012， 4： 35-37)与抗锈病大豆SX6907(单志慧等， 一个大豆锈病新抗源的筛选与鉴定， 中国油料作物学报， 2012， 34： 188-192)杂交， 杂交后代自交， 即为F2分离群体， 共116个单 株。 0110 对F2的116个单株进行SSR分子标记分析， 获得基因型数据， 利用Joinmap3.0构建 遗传图谱， 结合抗锈病接种鉴定数据， 利用WinQTLcartogr。
34、apher2.5进行抗锈病基因定 位， 在大豆18号染色体上定位到大豆抗锈病基因位点rpp.18-1， 属于完全显性遗传。 0111 其中， DNA提取、 PCR扩增、 电泳同上述实施例1。 0112 抗锈病鉴定： 0113 锈菌悬浮液制备： 大豆锈菌(单志慧等， 一个大豆锈病新抗源的筛选与鉴定， 中国 油料作物学报， 2012， 34： 188-192)从新鲜感病叶片上收集， 置于1ml0.1Tween-20溶液中 混匀， 除去孢子表面张力， 而后10000r/min离心2min， 去上清液， 孢子沉淀用清水悬浮制成 105/ml孢子悬浮液， 菌悬液于接种前1h内配制， 即配即用。 0114。
35、 锈菌接种： 将配好的锈菌孢子悬浮液接种于叶片背面， 每个接种点接种1 l， 每个 叶片接种2-6个点， 接种点分布于主叶脉两侧， 接种后的叶片于26下保持黑暗24h， 之后转 入26、 12h光周期、 RH100及光强80-100 mol/m2s条件下培养， 14天后记录病斑类型 说明书 7/9 页 9 CN 104232775 B 9 大小、 颜色、 孢子堆的形成及破裂等。 0115 抗锈病(R)大豆是指接种后2周仅在接种部位有少量红褐色病斑， 病斑周围组织不 发生黄化， 无黄褐色病斑， 若无孢子堆形成为高抗， 若有孢子堆形成， 并有少量孢子释放为 中抗锈病(M)； 非抗锈病(S)大豆是指。
36、接种后3-5天出现侵染病斑， 为典型黄褐色病斑， 5-7天 后侵染点周围变黄， 侵染点逐步变大， 叶片上相邻的黄色部分连成片， 10天后， 侵染点病斑 破裂， 有大量孢子释放。 0116 SSR分析： 0117 引物序列参照Song等(2004)公布的大豆SSR引物。 同时根据大豆基因组序列， 利用 SSRHunter软件搜索SSR(搜索条件为2-5个motif且重复数在5个以上)， 再根据Primer5软 件设计SSR引物。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。 其中， 抗锈病基因位点rpp.18-1 紧密连锁的分子标记为申请人自主开发的SSR标记GmSSR18-40， 引物序列为:GmSS。
37、R18-40- F： 5 -TTGACTTCTTTACAAACAAATGTTGA-3 (序列表中序列1)， GmSSR18-40-R： 5 - CCAAGTCTAACTTTTTCCCTCAAA-3 (序列表中序列2)。 遗传连锁图谱构建和抗锈病基因定位: 0118 运用Joinmap3.0软件进行连锁图谱的构建。 以LOD3.0进行标记间连锁分组。 Joinmap参数设置为:Rec0.40,LOD2.0,Jump5,用以决定多态性标记在连锁群中的顺 序。 采用Kosambi函数将重组率转换成图距单位(cM)。 采用复合区间作图法(CIM)对抗锈病 基因进行定位(图2),获得标记GmSSR18-。
38、40,该标记距抗锈病基因rpp.18-1仅0.5cM,位于抗 锈病基因rpp.18-1右侧。 在前期的研究中， 利用天隆一号与抗锈病大豆SX6907杂交构建的 F2群体， 开发了SSR标记GmSSR-22(正向引物:5 -ACCAAACCCGATGATGATGT-3 ， 反向引物:5 - CCAGATTCCAAACCCCTTCT-3 ),该标记距抗锈病基因位点rpp.18-1为2.9cM。 同时， 利用中豆 40与抗锈病大豆SX6907杂交构建的F2群体， 开发了SSR标记GmSSR-21(正向引物:5 - ACCTCCTCCTCTCCCTGAAG-3 ， 反向引物:5 -CGGTTCAATC。
39、TCAAAGGAGG-3 ),该标记距抗锈病基 因位点rpp.18-1为3.4cM。 利用WindowsQTLCartographerVersion2.5软件， 采用单标记 分析法进行标记与抗锈病基因的连锁分析， GmSSR18-40与抗锈病基因位点rpp.18-1紧密连 锁， 显著性水平P0.0007(即利用该标记辅助选择抗锈病大豆材料， 出错的概率为7/ 10000)， 与右侧其它标记相比连锁更为紧密(图2， 表3)。 在分子标记辅助选择抗锈病大豆材 料中， 抗锈病基因位点右侧标记GmSSR18-40与左侧标记GmSSR18-24的联合应用可提高辅助 选择抗锈病大豆材料的准确性。 0119。
40、 表3为SSR标记与抗锈病基因位点rpp.18-1的连锁分析 0120 标记名称P值 BARCSOYSSR_18_17810.029 BARCSOYSSR_18_17960.025 BARCSOYSSR_18_18270.024 BARCSOYSSR_18_18380.022 BARCSOYSSR_18_18430.021 BARCSOYSSR_18_18500.019 BARCSOYSSR_18_18560.011 BARCSOYSSR_18_18580.009 说明书 8/9 页 10 CN 104232775 B 10 GmSSR-220.003 GmSSR-400.0007 BARCSOYSSR_18_18610.011 BARCSOYSSR_18_18640.039 BARCSOYSSR_18_18700.088 BARCSOYSSR_18_18770.119 BARCSOYSSR_18_18860.144 说明书 9/9 页 11 CN 104232775 B 11 0001 序列表 1/1 页 12 CN 104232775 B 12 图1 图2 说明书附图 1/1 页 13 CN 104232775 B 13 。