《一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 102321578 B (45)授权公告日 2013.04.17 CN 102321578 B *CN102321578B* (21)申请号 201110195020.5 (22)申请日 2011.07.13 C12N 5/078(2010.01) (73)专利权人 中国水产科学研究院东海水产研 究所 地址 200090 上海市杨浦区军工路 300 号 (72)发明人 李子牛 来琦芳 么宗利 周凯 应成琦 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 谢文凯 CN 101846685 A,2010.09.29, 实施例 1. CN 1。
2、01899425 A,2010.12.01, 全文 . 刘东武， 等 . 菲律宾蛤仔、 中国蛤蜊、 文蛤和 紫石房蛤血细胞的分类研究 .水产科学 .2005, 第 24 卷 ( 第 10 期 ),5 7. (54) 发明名称 一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法 (57) 摘要 本发明涉及一种海洋双壳贝类血细胞的纯化 方法， 包括 ： (1) 将新鲜的海洋双壳贝类血液与抗 凝剂混合， 得混合液 ； (2) 将上述的混合液过滤， 自然沉降， 然后出除表层 ； 再进行离心， 去除上清 液， 最后用PBS洗两次， 重悬血细胞， 即得。 本发明 简单易行， 毋需增加仪器设备 ； 本发明改良了抗 凝剂的配方。
3、， 并对血液进行纯化， 解决了贝类血细 胞研究过程中血细胞杂质多的问题， 为贝类血细 胞的研究提供了切实有效的技术手段。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李振鹏 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 包括 ： （1） 将新鲜的海洋双壳贝类血液与抗凝剂混合， 得混合液 ； 其中， 抗凝剂的配方为将 NaCl 8g， Na2HPO42.9g， KCl 0.2g， KH2PO40.2g 溶于蒸馏水 1000ml 中， 然后加 EDTA 。
4、5g， 60 下加热搅拌即得 ； （2） 将上述的混合液过滤， 自然沉降， 然后除去表层 ； 再进行离心， 去除上清液， 最后用 PBS 洗两次， 重悬血细胞， 即得。 2.根据权利要求1所述的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的海洋双壳贝类为菲律宾蛤仔、 文蛤、 青蛤、 缢蛏、 泥蚶、 彩虹明樱蛤或扇贝。 3.根据权利要求1所述的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的海洋双壳贝类血液与抗凝剂混合为按照体积比 1:1 混合。 4.根据权利要求1所述的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述。
5、的过滤为经双层 300 目筛绢过滤。 5.根据权利要求1所述的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述的自然沉降的条件为于 4静置 12h。 6.根据权利要求1所述的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述的去除表层为用移液枪将表层 4ml 吸去。 7.根据权利要求1所述的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述的离心为于 4离心 20min， 转速为 300g。 8.根据权利要求1所述的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中PBS洗两次时于4离心5min， 转速为30。
6、0g ； 重悬血细胞中血细胞浓度为106cells/ml。 权 利 要 求 书 CN 102321578 B 2 1/3 页 3 一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法 技术领域 0001 本发明属于海洋生物免疫细胞的纯化领域， 特别涉及一种海洋双壳贝类血细胞的 纯化方法。 背景技术 0002 双壳贝类的循环系统属于开放式， 心脏被一个薄而透明的围心腔膜所包围， 静脉 窦中含有大量的血液， 在外套膜上有一个大的血管系统， 致密的血管网几乎布满于整个外 套膜上， 所以， 当刺破闭壳肌及外套膜后， 大量血液渗出汇集在外套腔内。贝类参与细胞免 疫的细胞为血细胞， 它是贝类体内抵御外来病原微生物侵袭的主要屏。
7、障， 血细胞通过参与 包埋、 吞噬、 结节形成， 细胞凝块和伤口修复等过程起到免疫防御作用。 0003 近年来， 随着贝类养殖规模的扩大， 贝类病害日益严重， 给中国的贝类养殖业造成 了重大经济损失。 所以研究贝类免疫学， 特别是贝类血细胞的研究， 以解决贝类养殖中发生 的病害问题已成为研究的热点， 这些研究需要获得大量纯净的贝类血淋巴。 0004 现有的采血方法是找到贝类的围心腔， 直接用一次性注射器插入围心腔抽取血 液， 但这种采血方法存在很多弊端 ： 其一， 取血量少 ； 其二， 所取血液中含有很多粘液和杂 质， 所获得的血细胞不纯。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一。
8、种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 该方法 操作简单， 对设备要求低， 可能获得大量纯净血细胞。 0006 本发明的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法， 包括 ： 0007 （1） 将新鲜的海洋双壳贝类血液与抗凝剂混合， 得混合液 ； 0008 （2） 将上述的混合液过滤， 自然沉降， 然后去除表层 ； 再进行离心， 去除上清液， 最 后用 PBS 洗两次， 重悬血细胞， 即得。 0009 步骤 （1） 中所述的海洋双壳贝类为菲律宾蛤仔、 文蛤、 青蛤、 缢蛏、 泥蚶、 彩虹明樱 蛤或扇贝等海洋双壳贝类。 0010 步骤 （1） 中所述抗凝剂的配方为将 NaCl 8g， Na2HPO42.9g， 。
9、KCl 0.2g， KH2PO40.2g 溶 于 1000ml 蒸馏水， 然后加 EDTA 5g， 60下加热搅拌即得。 0011 步骤 （1） 中所述的海洋双壳贝类血液与抗凝剂混合为按照体积比 1:1 混合。 0012 步骤 （2） 中所述的过滤为将混合液经双层 300 目筛绢过滤。 0013 步骤 （2） 中所述的自然沉降的条件为于 4静置 12h。 0014 步骤 （2） 中所述的去除表层为用移液枪将表层 4ml 吸去。 0015 步骤 （2） 中所述的离心为于 4离心 20min， 转速为 300g（该转速下， 大部分贝 类血细胞在不破碎的情况下均能沉降） 。 0016 步骤 （2） 。
10、中 PBS 洗两次时于 4离心 5min， 转速为 300g（低温能保证血细胞内 酶活， 离心 5min 后， 贝类血细胞基本沉降， 碎片及杂质悬浮于 pbs 中） ； 重悬血细胞中血细胞 说 明 书 CN 102321578 B 3 2/3 页 4 浓度约为 106cells/ml。 0017 本发明中所采用的新鲜海洋双壳贝类血液可以用多种方法采集， 其中一种优选的 采集方式为 ： 0018 a: 暂养 ： 根据不同双壳贝类的生活习性， 在其适宜温度和盐度的过滤海水中暂养 24h ； 0019 b: 消毒及开壳 ： 将贝类贝壳、 单面刀片用 75% 酒精消毒后再用消毒海水冲洗三次， 确定闭壳。
11、肌的位置， 用单面刀片插入两贝壳之间， 轻轻划贝类的闭壳肌， 使贝壳可自由开 合 ； 0020 c: 采血 ： 划开后血液汇集在贝壳的外套腔内， 用一次性滴管吸取贝类血液， 避免 吸到其它杂质， 持续吸取， 直至无大量血液留出。 0021 本方法简单易行， 毋需增加仪器设备， 可对海洋双壳贝类进行血细胞采集， 为贝类 血细胞的研究提供了切实有效的技术手段。 0022 本发明改良了抗凝剂的配方， 并对血液进行纯化， 解决了贝类血细胞研究过程中 血细胞杂质多的问题， 对获得大量纯净的血细胞有显著效果。 0023 有益效果 ： 0024 与现有技术相比较， 本发明的优点在于 ： 0025 （1） 本。
12、发明方法操作简单， 对设备要求低， 可能获得大量纯净血细胞 0026 （2） 本发明适用于所有海洋双壳贝类， 优选为菲律宾蛤仔、 文蛤、 青蛤、 缢蛏、 泥蚶、 彩虹明樱蛤、 扇贝 ； 0027 （3） 本发明中将吸取到的贝类血液与抗凝剂的混合液经过滤、 静置、 离心、 重悬后， 使所得到血细胞更加纯净 ； 0028 （4） 本发明采用改良的抗凝剂配方， 使获得的血细胞不出现凝集反应， 得到的血细 胞形态良好。 具体实施方式 0029 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域。
13、技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0030 实施例 1 0031 （1） 将新鲜的泥蚶血液与抗凝剂按照体积比 1:1 混合， 得混合液 ； 其中抗凝剂为将 8g NaCl， 2.9g Na2HPO4， 0.2g KCl， 0.2g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水， 之后加5g EDTA， 60加 热搅拌两小时溶解制得 ； 0032 （2） 将上述的混合液过滤， 自然沉降， 然后去除表层 ； 再进行离心， 去除上清液， 最 后用 PBS 洗两次， 重悬血细胞， 即得到纯净的贝类血细胞， 可于 -20存放备用。 0033 实施例。
14、 2 0034 （1） 将新鲜的青蛤血液与抗凝剂按照体积比 1:1 混合， 得混合液 ； 其中抗凝剂为将 8g NaCl， 2.9g Na2HPO4， 0.2g KCl， 0.2g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水， 之后加5g EDTA， 60加 热搅拌两小时溶解制得 ； 说 明 书 CN 102321578 B 4 3/3 页 5 0035 （2） 将上述的混合液经双层300目筛绢过滤后存放于5ml离心管中， 将过滤后的贝 类血液与抗凝剂的混合液4静置12h， 之后用移液枪将表层4ml吸去 ； 再在4离心20min （转速为 300g） ， 去除上清液， 最后用 PBS 洗两次 （300g， 4离心 5min） ， 重悬血细胞 （约 106cells/ml） ， 即得到纯净的贝类血细胞， 可于 -20存放备用。 说 明 书 CN 102321578 B 5 。