技术领域
本发明涉及一种寡糖的制备方法，尤其涉及一种聚合度在4-8之间的贻贝寡糖的制备方法。
背景技术
贻贝(Mytilus sp.)属于双壳类的一种贝类，是海洋贝类养殖中的重要种类，又名海红，俗称“海中鸡蛋”，味道鲜味，营养丰富。由于贻贝产量大，收获后不易保存，历来多煮熟后加工成干品——淡菜。淡菜营养价值很高，并有一定的药用价值，在《本草纲目》、《本草拾遗》及《日华子本草》中均有记载。现代药理学研究表明，贻贝具有提高免疫力、抗肿瘤、清除氧自由基、抗动脉粥样硬化、降血脂、抑制血栓的形成、改善心肌供氧及保护实验性心肌缺血、改善微循环和降血压等功效。其体内的多糖成分在贻贝的药用功效中起重要作用，贻贝多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、降血脂、预防心脑血管疾病等多种功效。
申请人在申请号为201710351379.4的发明专利申请中提供了贻贝多糖的结构：贻贝多糖是一种以(1→4)-α-D-Glc为主链，含有(1→2)-α-D-Glc分枝的α-吡喃型葡聚糖，且该多糖具有显著的降血脂功效。(1→4)-α-D-Glc主链与淀粉主链结构一致，贻贝多糖与淀粉的主要区别在于贻贝多糖含有(1→2)-α-D-Glc分枝，支链淀粉含有(1→6)-α-D-Glc分枝，直链淀粉没有分支。淀粉主链在体内可被α-淀粉酶水解，贻贝多糖的主链在体内也应该能被水解，从而生成以(1→2)-α-D-Glc分枝为核心的寡糖，该寡糖可能是贻贝多糖发挥降血脂功能的有效形式。然而，目前国内外尚没有任何有关贻贝寡糖的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、环保的贻贝寡糖的制备方法，能够实现快速、低耗、大量生产贻贝寡糖。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种贻贝寡糖的制备方法，采用以下步骤：
(1)贻贝多糖粉末溶于蒸馏水中，调pH得贻贝多糖溶液；
(2)向步骤(1)中加入水解酶进行酶解，再灭活水解酶得酶解液；
(3)将步骤(2)中酶解液过滤，收集滤液，得贻贝寡糖溶液I；
(4)向步骤(3)所述贻贝寡糖溶液I中加入酵母菌细胞培养，离心取上清，得贻贝寡糖溶液II；
(5)将步骤(4)制得的贻贝寡糖溶液II加入活性炭，室温搅拌，过滤去上清；加入乙醇，室温搅拌，过滤去上清；再次加入乙醇，室温搅拌，过滤，收集滤液；滤液干燥后，得到贻贝寡糖样品。
步骤(1)中，所述贻贝多糖的结构式为：多糖溶液浓度为10％w.t，pH为5.0-7.0。
步骤(2)中，所述酶为α-淀粉酶，优选为中温淀粉酶；加入量为0.1-10g/L；酶解温度为30-70℃；酶解时间为0.5-10h；灭活条件为100℃，15min。
步骤(3)中，所述滤膜孔径为0.22μm。
步骤(4)中，所述酵母菌为酿酒酵母，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号为1002；酵母菌细胞加入量为5-10％(w/v)；培养条件为30℃、150rpm条件下摇床培养24-36h；
所述酵母菌细胞通过如下方法制得：采用YPD培养基培养酵母细胞，28℃培养30-40h，10000rpm离心2-5min；
所述YPD培养基组分如下(质量百分数)：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，pH自然。
步骤(5)中，所述活性炭加入量为1-2mg/mL，搅拌时间为1-3h；第一次加入的乙醇浓度为3％w.t，加入量为贻贝寡糖溶液II的1倍体积；
第二次加入的乙醇浓度为20％-40％w.t，加入量为贻贝寡糖溶液II的1/2倍体积；搅拌时间为1h；滤膜孔径为0.22μm；
干燥方式为冷冻干燥或减压干燥。
所述贻贝多糖采用以下方法制备：
(1)原料处理：以冻煮贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过20-40目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入4-10体积倍的水，在80-100℃提取1-5h，搅拌桨转速20-100rpm；
(3)除渣：用50-100目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液调pH至8.0，加入0.05％-0.5％w.t的碱性蛋白酶，50℃酶解0.5-3h，酶解完成后在80-100℃条件下灭活10-20min，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5-3体积倍的90％-95％(v/v)的酒精进行多糖沉淀，静置3-10h，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1体积倍的90％-95％(v/v)的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品。
一种上述制备方法制得的贻贝寡糖，聚合度为4-8。
一种上述贻贝寡糖在制备调血脂药物或食品中的应用。
本发明通过加入α-淀粉酶将贻贝多糖降解为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和贻贝寡糖；再加入酿酒酵母细胞进行培养以除去葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖；最后通过活性炭吸附、乙醇洗脱除去未降解的多糖和其他杂质，获得纯度较高的贻贝寡糖。
本发明具有以下优点：本发明提供了一种贻贝寡糖的制备方法，该方法寡糖收率高，工艺简单，条件温和，易于放大。同时，本发明还提供了贻贝寡糖在制备调血脂药物或食品中的应用，贻贝寡糖有进一步研发成降血脂药物和保健食品的前景。
附图说明
图1是实施例3贻贝寡糖的薄层层析(TLC)图；
其中，M：葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖混合标准品；1：贻贝多糖；2：贻贝多糖酶解产物(贻贝寡糖溶液I)；3：酵母细胞处理后的寡糖溶液(贻贝寡糖溶液II)；4：贻贝寡糖。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1贻贝多糖制备
(1)原料处理：以浙江省幌泪县产冻煮厚壳贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过20目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入6倍体积的水，在100℃提取2h，搅拌桨转速60rpm：
(3)除渣：用50目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液：
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用NaOH调pH至8.0，加入质量比为0.2％的碱性蛋白酶，50℃酶解2h，酶解完成后在80℃条件下灭活15min，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量为2kg/m2；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5倍体积质量分数为93％的酒精进行多糖沉淀，静置6h，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为93％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为92％。
实施例2酵母菌细胞制备
(1)斜面培养
将酿酒酵母(CICC编号1002)接种至YPD培养基(质量百分数：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然)斜面上，28℃培养48h，以无菌水冲洗斜面，制得菌悬液，即种子液。
(2)摇瓶培养
将种子液接入YPD培养基(质量百分数：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，pH自然)，接种量为5％，28℃培养30h，10000rpm离心3min，弃上清，即得酿酒酵母菌细胞。
实施例3贻贝寡糖制备
(1)实施例1的贻贝多糖粉末溶于蒸馏水中，配制成10％多糖溶液，HCl调pH至5.5，得贻贝多糖溶液；
(2)向步骤(1)所述贻贝多糖溶液中加入中温α-淀粉酶使其浓度为0.5g/L，50℃保温0.5h，100℃灭活15min，得贻贝多糖水解液；
(3)步骤(2)所述贻贝多糖水解液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得贻贝寡糖溶液I；
(4)向步骤(3)所述贻贝寡糖溶液I中按照8％质量体积比加入实施例1的酵母菌细胞，30℃、150rpm条件下摇床培养30h，离心取上清，得贻贝寡糖溶液II；
(5)将步骤(4)制得的贻贝寡糖溶液II按每毫升1mg加入活性炭，室温搅拌1h，去上清；加入与贻贝寡糖溶液II等体积的质量百分比3％的乙醇，室温搅拌1h，去上清；加入贻贝寡糖溶液II二分之一体积的质量百分比25％的乙醇，室温搅拌1h，0.22μm滤膜过滤，收集滤液；滤液冷冻干燥，得到贻贝寡糖样品。
经硫酸-苯酚法检测，该寡糖纯度为92％。
对贻贝多糖、贻贝寡糖溶液I、贻贝寡糖溶液II和贻贝寡糖样品进行薄层层析(TLC)，结果如图1所示：贻贝多糖在TLC展层时集中在点样点附近；贻贝多糖经α-淀粉酶酶解后获得的贻贝寡糖溶液I中含有葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、聚合度4-8的寡糖及未降解的多糖；经酵母菌处理后，葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖被酵母菌利用，贻贝寡糖溶液II中含有聚合度4-8的寡糖及未降解的多糖；最后通过活性炭纯化去除未降解的多糖后，得到较纯净的聚合度4-8的寡糖样品。
实施例4贻贝寡糖降血脂实验
选雄性SD大鼠100只(由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(鲁)20140007。动物合格证号：No.37009200002065)，体重170±10g，随机分为5组，分别为空白组、模型组、贻贝多糖组(200mg/kg)、贻贝寡糖低剂量组(100mg/kg)、贻贝寡糖高剂量组(200mg/kg)，贻贝多糖采用实施例1中样品，贻贝寡糖采用实施例3中样品。全部大鼠喂养基础饲料观察1周，禁食12h后称重，眼内眦取血，室温25℃静置1h，3000rpm离心10min，取血清，用自动生化分析仪测定TC，TG，HDL-C和LDL-C水平。空白组始终基础饲料喂养，其余各组大鼠均用高脂饲料喂养(高脂饲料配方为胆固醇1％、胆盐0.1％、猪油10％、蛋黄粉与全脂奶粉分别为5％，购于北京华阜康生物科技有限公司)。4周后眼内眦取血(取血前禁食12h)，测定血清TC(总胆固醇)，TG(甘油三酯)，HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)和LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)水平。用高脂饲料喂养4周后各组大鼠血清总胆固醇水平和甘油三酯水平与空白组比较有显著性差异(p<0.05)，表明脂代谢紊乱模型成功建立。
脂代谢紊乱模型建立成功后，空白组与模型组每日灌胃蒸馏水1mL，贻贝多糖组和贻贝寡糖组分别按照相应的剂量每天灌胃给药1次，连续8周。给药8周后大鼠隔夜禁食12h，眼内眦取血，测定血清TC，TG，HDL-C和LDL-C水平。
检测结果均以x±SD表示，采用SPSS 13.0软件进行统计，并进行组间差异分析，数据如表1所示。
连续给药8周后，与模型组相比，贻贝多糖组和贻贝寡糖低剂量组能显著降低大鼠血清甘油三酯水平(P<0.01)，贻贝寡糖高剂量组能显著降低大鼠血清甘油三酯(P<0.01)、总胆固醇(P<0.05)和低密度脂蛋白胆固醇含量(P<0.05)(表1)。表明贻贝寡糖有一定的降血脂功能，且同等剂量贻贝寡糖降血脂效果优于贻贝多糖。
表1各组大鼠血清中血脂水平测定结果(x±SD，n＝15-20)
注：##P<0.01，与正常组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。
实施例5贻贝寡糖制备
(1)实施例1的贻贝多糖粉末溶于蒸馏水中，配制成10％多糖溶液，HCl调pH至5.0，得贻贝多糖溶液；
(2)向步骤(1)所述贻贝多糖溶液中加入中温α-淀粉酶使其浓度为0.1g/L，70℃保温5h，100℃灭活15min，得贻贝多糖水解液；
(3)步骤(2)所述贻贝多糖水解液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得贻贝寡糖溶液I；
(4)向步骤(3)所述贻贝寡糖溶液I中按照5％质量体积比加入实施例2的酵母菌细胞，30℃、150rpm条件下摇床培养36h，离心取上清，得贻贝寡糖溶液II；
(5)将步骤(4)制得的贻贝寡糖溶液II按每毫升1mg加入活性炭，室温搅拌2h，去上清；加入与贻贝寡糖溶液II等体积的质量百分比3％的乙醇，室温搅拌1h，去上清；加入贻贝寡糖溶液II二分之一体积的质量百分比20％的乙醇，室温搅拌1h，0.22μm滤膜过滤，收集滤液，减压干燥，得到贻贝寡糖样品；经硫酸-苯酚法检测，该寡糖纯度为92.1％。
实施例6贻贝寡糖制备
(1)实施例1的贻贝多糖粉末溶于蒸馏水中，配制成10％多糖溶液，HCl调pH至6.0，得贻贝多糖溶液；
(2)向步骤(1)所述贻贝多糖溶液中加入中温α-淀粉酶使其浓度为10g/L，30℃保温10h，100℃灭活15min，得贻贝多糖水解液；
(3)步骤(2)所述贻贝多糖水解液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得贻贝寡糖溶液I；
(4)向步骤(3)所述贻贝寡糖溶液I中按照10％质量体积比加入实施例2的酵母菌细胞，30℃、150rpm条件下摇床培养24h，离心取上清，得贻贝寡糖溶液II；
(5)将步骤(4)制得的贻贝寡糖溶液II按每毫升2mg加入活性炭，室温搅拌2h，去上清；加入与贻贝寡糖溶液II等体积的质量百分比3％的乙醇，室温搅拌3h，去上清；加入贻贝寡糖溶液II二分之一体积的质量百分比35％的乙醇，室温搅拌1h，0.22μm滤膜过滤，收集滤液，冷冻干燥，得到贻贝寡糖样品；经硫酸-苯酚法检测，该寡糖纯度为91.8％。
实施例7贻贝寡糖制备
(1)实施例1的贻贝多糖粉末溶于蒸馏水中，配制成10％多糖溶液，HCl调pH至7.0，得贻贝多糖溶液；
(2)向步骤(1)所述贻贝多糖溶液中加入中温α-淀粉酶使其浓度为5g/L，50℃保温3h，100℃灭活15min，得贻贝多糖水解液；
(3)步骤(2)所述贻贝多糖水解液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得贻贝寡糖溶液I；
(4)向步骤(3)所述贻贝寡糖溶液I中按照7％质量体积比加入实施例2的酵母菌细胞，30℃、150rpm条件下摇床培养32h，离心取上清，得贻贝寡糖溶液II；
(5)将步骤(4)制得的贻贝寡糖溶液II按每毫升2mg加入活性炭，室温搅拌2h，去上清；加入与贻贝寡糖溶液II等体积的质量百分比3％的乙醇，室温搅拌3h，去上清；加入贻贝寡糖溶液II二分之一体积的质量百分比40％的乙醇，室温搅拌1h，0.22μm滤膜过滤，收集滤液，冷冻干燥，得到贻贝寡糖样品，经硫酸-苯酚法检测，该寡糖纯度为92.3％。