一种利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其专用双链RNA.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101186629 B (45)授权公告日 2011.07.27 CN 101186629 B *CN101186629B* (21)申请号 200710187913.9 (22)申请日 2007.11.15 C12N 15/82(2006.01) C07H 21/02(2006.01) (73)专利权人 黑龙江省烟草科学研究所 地址 157011 黑龙江省牡丹江市西地明街 63 号 (72)发明人 颜培强 郭兆奎 万秀清 储成才 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 朱旭东等 .RNA 干涉的研究进展 .生物技术 通。

2、讯 .2001, 第 12 卷 ( 第 4 期 ),293-296. 颜培强等 . 应用 RNAi 技术培育抗 TMV 病 毒转基因烟草 .遗传 .2007, 第 29 卷 ( 第 8 期 ),1018-1022. 赵明敏等 . 瞬时表达靶向 TMV 外壳蛋白 基因的 siRNA 能干扰病毒侵染 .植物病理学 报 .2006, 第 36 卷 ( 第 1 期 ),35-40. (54) 发明名称 一种利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法 及其专用双链 RNA (57) 摘要 本发明公开了一种利用 RNAi 培育抗 CMV 和 TMV植物的方法及其专用双链RNA。 该双链RNA， 是 由正义。

3、链和反义链组成的双链 RNA ； 所述正义链 的序列是序列表中序列 3， 或在严格条件下可与 序列表中序列 3 限定的 RNA 序列杂交的核苷酸序 列 ； 所述反义链的核苷酸序列是序列表中序列 4， 或在严格条件下可与序列表中序列 4 限定的 RNA 序列杂交的核苷酸序列。该培育抗 CMV 和 TMV 植 物的方法， 是将含有上述双链 RNA 编码基因的重 组表达载体导入植物中， 得到抗 CMV 和 TMV 的植 物。该双链 RNA 可降解目的 RNA， 提高植物抗 CMV 和 TMV 的能力。通过 RNA 干扰来增强植物的抗病 性， 避免了其 mRNA 的翻译， 不产生病毒蛋白， 避免 了安。

4、全性方面的问题。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐赤 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 3 页 CN 101186629 B1/1 页 2 1. 一种双链 RNA， 是由正义链和反义链组成的双链 RNA ； 所述正义链的核苷酸序列是序 列表中序列 3 ； 所述反义链的核苷酸序列是序列表中序列 4。 2. 权利要求 1 所述双链 RNA 的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的基因， 其特征在于 ： 所述正义链的编码序列的核苷酸序列是 序列表中序列 5 ； 所述反义链的编码序列的核苷酸序列是序列表中序列 6。。

5、 4. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的重组表达载体。 5. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的转基因细胞系。 6. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的重组菌。 7. 一种培育抗 CMV 和 TMV 植物的方法， 是将权利要求 4 所述的含有所述双链 RNA 编码 基因的重组表达载体导入植物中， 得到抗 CMV 和 TMV 的植物。 8. 根据权利 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述植物为双子叶植物。 9. 根据权利 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述双子叶植物为烟草。 权 利 要 求 书 CN 101186629 B1/9 页 3 一种利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方。

6、法及其专用双链 RNA 技术领域 0001 本发明涉及一种利用 RNAi 培育抗 CMV 和 TMV 植物的方法及其专用双链 RNA。 背景技术 0002 烟草花叶病包括烟草普通花叶病 Tobacco mosaic virus(TMV) 和黄瓜花叶病 Cucumber mosaic virus(CMV)， 是我国烟区的主要病毒病害， 影响烟叶产量和品质， 造成 严重经济损失。由于对植物病毒病害还缺乏有效的防治药剂， 而且 TMV 病毒存活期长、 汁液 传毒易于病害的传播 ； 而 CMV 侵染寄主来源广泛， 有翅蚜虫传播利于病害的快速流行， 加之 烟草对两种病害的抗原狭窄， 且与劣质基因连锁， 。

7、常规育种手段很难育成优质、 多抗的烟草 品种。目前烟叶生产中所应用的主栽品种大多为中抗或感病品种， 更没有能够兼抗两种病 毒的品种， 所以应用现代生物技术手段挖掘新的抗病毒方法具有重要意义。 0003 利用双链 RNA(dsRNA) 介导的干扰机制可以将任何目的基因序列插入 RNA 干涉载 体， 并获得基因沉默效应。当 dsRNA 进入细胞后， 被一种 dsRNA 特异的核酶内切酶 Dicer 识 别， 切割成2123bp的小片段， siRNA与RNA诱导的沉默复合体结合， 并且作为模板识别目 的 mRNA ； 然后 mRNA 与 dsRNA 的正义链发生链互换， 原先 dsRNA 中的正义链。

8、被 mRNA 代替， 从 dsRNA 复合体中释放出来， 而 mRNA 则处于原先的正义链的位置 ； Dicer 在同样位置对 mRNA 进行切割， 这样又产生了 21 23bp 的 dsRNA 小片段， 与特异的核酶内切酶 RISC 结合， 再次 对目标 RNA 进行切割， 从而使目的基因沉默。从作用机制上也是细胞抵御外来基因的一种 手段。 0004 Powell 等 (Powell ABEL P， Nelson R S， De B， et al.Delay of disease development intransgenic plants that express the tobacco。

9、 mosaic virus coat protein gene.Science， 1986， 232 ： 738 743) 首次将 TMV 外壳蛋白 (Coatprotein， CP) 基 因转入烟草， 培育出能稳定遗传的抗病毒植株， 但后来研究发现外壳蛋白基因介导的抗病 性主要在病毒侵染早期起作用， 推迟发病， 在侵染基数较高、 有反复再侵染的情况下不能有 效地控制病害的危害。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种双链 RNA。 0006 本发明所提供的双链 RNA， 名称为 TMV-CMV-RNAi， 是由正义链和反义链组成的双 链 RNA ； 所述正义链为下述 1) 或 2) 的 。

10、RNA 片段 ： 0007 1) 其核苷酸序列是序列表中序列 3 ； 0008 2) 在严格条件下可与序列表中序列 3 限定的 RNA 序列杂交的核苷酸序列 ； 0009 所述反义链为下述 3) 或 4) 的 RNA 片段 ： 0010 3) 其核苷酸序列是序列表中序列 4 ； 0011 4) 在严格条件下可与序列表中序列 4 限定的 RNA 序列杂交的核苷酸序列。 说 明 书 CN 101186629 B2/9 页 4 0012 上述双链 RNA 的编码基因也属于本发明的保护范围。 0013 上述双链RNA的编码基因， 其特征在于 ： 所述正义链的编码序列为如下a)或b)的 DAN 片段 ：。

11、 0014 a) 其核苷酸序列是序列表中序列 5 ； 0015 b) 在严格条件下可与序列表中序列 5 限定的 DNA 序列杂交的核苷酸序列 ； 0016 所述反义链的编码序列为如下 c) 或 d) 的 DNA 片段 ： 0017 c) 其核苷酸序列是序列表中序列 6 ； 0018 d) 在严格条件下可与序列表中序列 6 限定的 DNA 序列杂交的核苷酸序列。 0019 含有上述双链 RNA 编码基因的重组表达载体、 转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。 0020 本发明的另一个目的是提供一种培育抗 CMV 和 TMV 植物的方法。 0021 本发明所提供的培育抗 CMV 和 TMV。

12、 植物的方法， 是将含有上述双链 RNA 编码基因 的重组表达载体导入植物中， 得到抗 CMV 和 TMV 的植物。 0022 本发明的培育抗 CMV 和 TMV 植物的方法， 适合于 CMV 或 TMV 能侵染的各种植物， 包 括单子叶或双子叶植物、 草本、 灌木或木本植物等， 如烟草。 0023 本发明将CMV和TMV各株系外壳蛋白基因的保守区作为靶序列设计了双链RNA， 实 验证明该双链 RNA 可降解目的 RNA， 提高植物抗 CMV 和 TMV 的能力。通过 RNA 干扰来增强植 物的抗病性， 避免了其 mRNA 的翻译， 不产生病毒蛋白， 避免了安全性方面的问题。 附图说明 002。

13、4 图 1 为重组表达载体 pUCCRNAi-2TC 的物理图谱 0025 图 2 为重组表达载体 pUCCRNAi-2TC 经 Pst I 酶切后的酶切鉴定结果 0026 图 3 为转基因植株的实时 PCR 扩增 CMV CP 片段曲线图及标准曲线图 0027 图 4 为转基因植株的实时 PCR 扩增 TMV CP 片段曲线图及标准曲线图 0028 图 5 为导入本发明的双链 RNA 编码基因的重组表达载体 pUCCRNAi-2TC 的转化材 料 (S3， S4， S5) 与对照材料 (S2) 攻毒后抗病性表型比较 0029 图 6 为表达载体 pUCC2300-35S-OCS 的物理图谱 。

14、0030 图 7 为获得的 TMV 和 CMV 外壳蛋白干涉靶序列片段的 PCR 产物 具体实施方式 0031 下述实施例中的实验方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0032 实施例1、 用于培育抗CMV和TMV烟草的双链RNA(TMV-CMV-RNAi)及其编码DNA的 合成 0033 1、 针对 RNA 干涉靶序列 DNA 的合成 0034 采集烟草的烟草普通花叶病病叶 (TMV) 和黄瓜花叶病病叶 (CMV)， 分别提取其总 RNA。 用Promega公司的反转录试剂盒(Reverse Transcription system)反转录合成cDNA 第一链。根据已报道的 TMV-cp 。

15、和 CMV-cp 序列设计阅读框引物， 分别进行 PCR。其中， 用于 扩增 TMV-cp 的引物 ： TMV1 ： 5 GTCTTACAGTATCACTACTC 3 和 TMV2 ： 0035 5 ACGTGCCTGCGGATGTATAT 3 ， 得到的序列如序列表中序列 1 ； 用于扩增 CMV-cp 的 说 明 书 CN 101186629 B3/9 页 5 引物 ： CMV1 ： 5 ATCAACCAGTGCTGGTCGTA 3 和 CMV2 ： 5 GATGGCGGCAACGGATAA3 ， 得到的序列 如序列表中序列 2。将得到的 TMV-cp 序列和 CMV-cp 序列输入 NC。

16、BI 进行不同株系序列比 对， 找出保守序列区域， 确定RNA干涉的靶序列， 其中， TMV干涉的靶序列如序列表中序列7， CMV 干涉的靶序列如序列表中序列 8， 设计其 PCR 扩增引物。其中， 扩增 TMV RNA 干涉靶序 列的引物为 TMV-F ： 5 -TAGTCGACGTGTTCTTGTCATCAGCGTG-3 和 TMV-R ： 5 ATGGATCCGTAGCAT CTAACGTTTCGGC-3 ， 上下游引物的5端各引入Sal I和BamH I ； 扩增CMV RNA干涉靶序列 的引物为 CMV-F ： 0036 5 GGAGATCTAACTTTAGAGTCCTGTCGC3 。

17、和 CMV-R ： 0037 5 GTGGATCCTTATCGAACTCAGTGACTG3 ， 上下游引物的 5端各引入 Bgl II 和 Bam HI 位点。以上述第一链 cDNA 为模板， 分别以 TMV-F 和 TMV-R、 CMV-F 和 CMV-R 为引物进行 PCR， 扩增得到的核苷酸序列命名为 TMV-cpi( 核苷酸序列如序列 7 所示 ) 和 CMV-cpi( 核苷 酸序列如序列 8 所示 )。扩增条件为 ： 94变性 1min， 65退火 40S， 72延伸 1min， 共 35 个循环。72后延伸 10min。4保温。其中， TMV-cpi 和 CMV-cpi 的 PCR。

18、 扩增结果如图 7 所示， 表明得到 302bp 的 TMV-cpi 和 213bp 的 CMV-cpi。图 7 中， 1-6 为 TMV-cpi 凝胶电泳 结果， 7-12 为 CMV-cpi 的凝胶电泳结果， M 为 DNA 分子量标准。 0038 2、 TMV-CMV-RNAi 干涉表达载体 pUCCRNAi-2TC 的构建 0039 (1)TMV-cpi 和 CMV-cpi 片段的连接 0040 将 TMV-cpi 和 CMV-cpi 的 PCR 产物分别插入到 pMD18-T( 购自大连 TaKaRa 公 司 ) 中得到重组载体 pMD18-TMV-cpi 和 pMD18-CMV-c。

19、pi。然后用 BglII 和 Eco RI 酶切 pMD18-CMV-cpi， 回收 213bp 的 CMV-cpi 片段 ； 用 Bam HI 及 Eco RI 酶切 pMD18-TMV-cpi， 回收含有 302bp 的 TMV-cpi 片段的载体片段， 与上述 CMV-cpi 片段连接， 得到重组载体 pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi。 用 SalI 和 Bam HI 酶 切 pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi， 回 收 含 有 TMV-cpi-CMV-cpi 的大小为 515bp 的片段。 0041 (2) 构建 RNA-TMV-cpi-CMV-cpi 干涉载体 00。

20、42 pUCCRNA 干涉载体用 XhoI 和 BglII 酶切， 回收载体， 将上述 515bp 片段正向连接 至酶切后的 pUCCRNA 干涉载体的 XhoI 和 BglII 位点间， 得到重组载体 pUCC-TMV-CMV。用 SalI 和 Bam HI 酶切 pUCC-TMV-CMV， 得到 515bp 的 TMV-cpi-CMV-cpi 片段。 0043 TMV-cpi-CMV-cpi 片段的核苷酸序列如序列表中的序列 5。 0044 (3) 将反向序列连接至 RNA 干涉载体 0045 用 Sal I 和 Bam HI 酶切 pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi， 回收含有 。

21、TMV-cpi-CMV-cpi 的 515bp 左 右 的 片 段， 用 SalI 和 BamHI 酶 切 pUCC-TMV-CMV， 回 收 酶 切 后 的 载 体， 将 TMV-cpi-CMV-cpi 反向连接至回收后的载体的 SalI 和 Bam HI 位点， 得到重组载体 pUCC-TMVcpi-CMVcpi。用 Pst I 酶切该载体， 酶切结果表明切出 1.4kb 左右的片段 ( 含有 TMV-cpi-CMV-cpi 反向重复序列 )。即为阳性克隆。 0046 (4) 构建 TMV-cpi-CMV-cpiRNA 干涉表达载体 0047 回收上述用 PstI 酶切 pUCC-TMVc。

22、pi-CMVcpi 得到的 1.4kb 的反向重复序列片段， 将其插入用 Pst I 酶切的表达载体 pUCC2300-35S-ocs( 物理图谱如图 6 所示 ) 的 Pst I 位 点， 得到重组质粒 pUCCRNAi-2TC， 如图 1 所示。对 pUCCRNAi-2TC 用 Pst I 进行酶切验证， 结 果如图 2 所示， 表明得到 1.4kb 的目的片段。图 2 中 M ： 2000bp ladder 分子量标记 ； 1 ： 重 说 明 书 CN 101186629 B4/9 页 6 组质粒 pUCCRNAi-2TC 经 PstI 酶切后的条带。 0048 pUCCRNAi-2TC。

23、 的测序结果表明， 插入的目的片段中含有 TMV-cpi-CMV-cpi 片段的 正向序列和反向序列， 该目的片段可编码 TMV-CMV-RNAi 的正义链 ( 核苷酸序列如序列 3 所 示 ) 和 TMV-CMV-RNAi 的反义链 ( 核苷酸序列如序列 4 所示 )。 0049 实施例 2、 培育抗 CMV 和 TMV 的转基因烟草 0050 1、 转基因烟草的获得 0051 pUCCRNAi-2TC 经热击转化法转入根癌农杆菌 LBA4404 中， 并在含有 100mg/L Kan( 卡那霉素 ) 和 50mg/L 利福平 (Rif) 的 YEB 培养基上筛选阳性菌株。 0052 利用与。

24、携带有重组质粒的农杆菌共培养方法进行烤烟 (Nicotiana tabacum L.) 品种 K326( 购自中国烟草北方育种中心 ) 转化。具体方法如下 ： 0053 (1) 无菌苗准备 ： 将烟草种子在 37浸泡过夜， 再用 30的次氯酸钠消毒 15min， 无菌水洗 3-5 次， 转移到装有 MS 固体培养基的玻璃高瓶中， 光照培养。 0054 (2) 预培养 ： 将无菌苗叶片切除边缘和中脉后切成 0.5cm0.5cm 的小块， 置于 MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L) 培养基上预培养两天。 0055 (3) 农杆菌的准备 ： 从平板上挑取新鲜单菌落或冻存的液体菌种， 。

25、接种到 2ml 附加 相应抗生素的 LB 液体培养基中， 28， 200rpm， 振荡培养至 OD600 0.6-0.8。 0056 (4) 侵染 ： 将农杆菌菌液于室温条件下， 4000rpm， 离心 10min， 沉淀悬浮于 10ml MS 液体培养基中， 将预培养的叶片放入菌液中浸泡 15min， 期间轻轻摇动。 0057 (5) 共培养 ： 取出叶片， 置于无菌滤纸上吸去附着的菌液 ； 放回 MS+BAP(1mg/ L)+NAA(0.1mg/L) 培养基上， 暗处共培养两天。 0058 (6) 选 择 培 养 ： 将 经 过 共 培 养 的 叶 片 转 移 到 MS+BAP(1mg/L。

26、)+NAA(0.1mg/ L)+Kan( 卡那霉素 )(200mg/L)+Cef( 羧苄霉素 )(500mg/L) 的分化培养基上， 光照培养 3-4 周左右。 0059 (7) 继代培养 ： 当叶盘分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织时， 将这些抗性材 料转移到新的分化培养基中上进行继代培养。 0060 (8) 生根培养 ： 待不定芽长到 1cm 左右时， 将其切下并转到 MS+Kan( 卡那霉素 ) (200mg/L)+Cef( 羧苄霉素 )(500mg/L) 生根培养基上， 2 周左右长出不定根， 当不定根长到 2-3cm 时， 取出植株， 彻底清除根部培养基， 移入土壤中培养。 0061。

27、 提取12株卡那霉素抗性苗的基因组DNA， 利用PCR方法进行扩增。 其中， 利用引物 TMV-F和TMV-R PCR扩增得到302bp TMV干涉靶序列， 并且利用引物CMV-F和CMV-R PCR扩 增得到 213bp CMV 干涉靶序列的植株为阳性植株。结果共得到 3 株阳性材料， 分别命名为 S3、 S4、 S5。 0062 同时， 按照上述方法将 pUCC2300-35S-ocs 转入烤烟 (Nicotiana tabacum L.) 品 种 K326， 获得 3 株转入 pUCC2300-35S-ocs 的烟草， 作为转空载体对照。 0063 2、 TMV 和 CMV 抗病鉴定 0。

28、064 将获得的 PCR 阳性植株移栽至温室管理。烟株团棵期称取各 50g 的实施例 1 步骤 1 中的经鉴定由 TMV 感染所致的烟草普通花叶病病叶和经鉴定由 CMV 感染所致黄瓜花叶病 病叶， 加适量石英砂一起研磨后用磷酸缓冲液 (pH7.0) 稀释制成汁液， 在转 pUCCRNAi-2TC 烟草 S3、 S4、 S5 和未转基因烟草 S2 的新叶上进行摩擦接种， 调查各植株 TMV 和 CMV 的发病 说 明 书 CN 101186629 B5/9 页 7 情况。 0065 1) 应用 RT-PCR 和荧光定量 PCR 方法进行干涉效果定量分析 0066 在本实验中， 对 TMV-cp 。

29、和 CMV-cp 基因的表达采用荧光定量 RT-PCR 来进行分析。 荧光定量 PCR 技术具有很高的灵敏度， 可以检测低于 100 个拷贝的 mRNA 的表达。而且操作 简便， 快速， 有利于对样本建立动态观测。由于 mRNA 采用 RT-PCR 进行定量分析， 还应该考 虑反转录效率和 mRNA 的降解等问题。该实验通过避免样品间操作方法的差异和模板间的 差异而减少试验结果的误差。通过稀释目的基因的 PCR 产物， 建立了稳定的， 相关性好的标 准曲线。这样， 可以保证检测的准确度。 0067 用 RNeasy Plant Mini 提 取 试 剂 盒， 分 别 提 取 接 种 TMV 和。

30、 CMV 病 毒 的 转 pUCCRNAi-2TC 烟草 (S3、 S4、 S5)、 接种 TMV 和 CMV 病毒的转 pUCC2300-35S-ocs 烟草 (S2) 和未转基因未感染 TMV 和 CMV 烟草 (S1) 的总 RNA， 反转录合成 cDNA 第一链。利用 TaKaRa RNA PCRKit 试剂盒， 以 cDNA 第一链为模板， 分别以 TMV-F、 TMV-R 和 CMV-F、 CMV-R 为引物 PCR扩增TMV-cpi和CMV-cpi序列。 利用Opticon TM 2荧光定量PCR检测系统进行TMV-cp 和 CMV-cp 的 mRNA 含量分析。以起始拷贝数分别。

31、为 105(T5)、 104(T4)、 103(T3)、 102(T2) 和 101(T1) 个 TMV-cpi 和 CMV-cpi 为标准品， 分别作标准曲线。 0068 通过测定 PCR 产物的 OD 值计算产物的拷贝数， 具体计算方法如下 ： 0069 拷贝数计算公式 ： 0070 (6.021023拷贝数 / 摩尔 )(DNA 浓度 g/ml)/(MWg/mol) 拷贝数 /ml. 0071 DNA 浓度 mg/ml (OD260)50mg/ml 0072 MW g/mol( 平均分子量 ) 片段碱基数 660 道尔顿 /bp 0073 荧光定量 PCR 扩增中以 SYBRGreen 。

32、I 为荧光染料， PCR 体系 (25l) ： 引物 (10pmol/l)各0.5l， dNTPS(10mM)1l， 10PCR Buffer 2.5l， Taq DNA聚合酶(5U/ l)0.5l， 模板 DNA 1l， SYBGREENI(10X)0.15l。PCR 反应条件为 ： 先 94预变性 5min ； 再94变性1min， 64退火1min， 72延伸1.5min， 32个循环 ； 最后72延伸10min。 0074 对 TMV-cpi( 图 3) 和 CMV-cpi( 图 4) 的实时 PCR 扩增曲线图、 标准曲线及拷贝数 (表1)进行分析。 TMV-cpi的标准曲线方程为y。

33、-0.22x+3.44， 偏相关系数为r20.990 ； CMV-cpi 的标准曲线方程 y -0.24x+8.70， 偏相关系数为 r2 0.995。两个标准曲线具有 很好的线性关系， 所以， 实验结果能够反映出不同样品之间的差异。从结果上看， 接种 TMV 和 CMV 病毒的对照材料 S2 的 TMV 和 CMV 的病毒 RNA 在烟株体内迅速积累， S2 的 TMV 和 CMV 的拷贝数都明显高于转化材料 S3， S4， S5。说明 TMV-CMV-RNAi 编码基因已经在烟草植株内 表达出本发明的双链 RNA， 侵入的病毒 RNA 靶序列大部分被烟株体内的 RNA 小片段降解。 007。

34、5 表 1. 各样品的 Ct 值及起始拷贝数 (TMV 和 CMV) 0076 样品 Ct 值 起始拷贝数 TMV CMV TMV CMV 说 明 书 CN 101186629 B6/9 页 8 S1 S2 S3 S4 S5 T1 T2 T3 T4 T5 34.50 20.9 24.19 24.84 26.04 16.02 20.21 23.49 28.34 33.18 0 13.89 24.09 25.23 25.02 15.17 19.45 22.56 27.63 33.04 3 6059 1021 719 375 105 104 103 102 101 0 167514 2592 419。

35、 421 105 104 103 102 101 0077 2) 发病情况 0078 接种病毒 15 天后 S2 出现轻微的花叶症状， 20 天时出现明显的叶片卷曲、 黄化症 状 ； 转化材料 S3 在 15 天时未见发病。一个月后对照烟株S2 出现全株花叶、 叶片呈蕨叶、 植 株严重矮化。而转化植株则只有一株 S5 出现花叶， 其余 S3、 S4 均未发病， 对 CMV 和 TMV 表 现免疫 ( 图 5)。说明 CMV 和 TMV 外壳蛋白的 RNA 干涉序列已经在 T0代转化材料中得到很 好的表达， 其 CMV 和 TMV 干涉序列已经转移到了烟草的基因组。 0079 序列表 0080 。

36、8 0081 1 0082 633 0083 DNA 0084 人工序列 0085 1 0086 gtcttacagt atcactactc catctcagtt cgtgttcttg tcatcagcgt gggccgaccc 60 0087 aatagagtta attaatttat gtattaatgc cttaggaaat cagtttcaaa cacaacaagc 120 0088 tcgaactgtc gttcaaagac aattcagtga ggtgtggaaa ccttcaccac aagtaactgt 180 0089 taggtttcct gacagtgact ttaag。

37、gtgta caggtacaat gcggtattag actcgctagt 240 0090 cacagcactg ttaggtgcat tcgacactaa aatagaataa tagatgttga aaatcaggcg 300 0091 aaccccacga ctgccgaaac gttagatgct acccgtagag tagatgacgc aacggtggcc 360 0092 ataaggagcg ctataaataa tttaatagta gaattgatca gaggaaccag atcttataat 420 0093 cggagctctt tcgagagctc ttatg。

38、gtttg gtttggacct ctggtcctgc aacttgaggt 480 0094 attcaagatg cataataaat aacggattgt gtccgtaatc acacgtgatg cgtacgataa 540 0095 cgcatagtgt ttttccctcc acttaaatcg aagggttgtg tcttggatcg cgcgggtcaa 600 0096 atgtatatgg ttcatataca tccgcaggca cgt 633 0097 2 0098 403 0099 DNA 0100 人工序列 0101 2 说 明 书 CN 101186629 。

39、B7/9 页 9 0102 atcaaccagt gctggtcgta accgtcgacg tcgtccgcgt cgtggttccc gctccgcccc 60 0103 ctcctccgcg gatgctaact ttagagtctt gtcgcagcag ctttcgcgac ttaataagac 120 0104 gttagcagct ggtcgtccaa ctattaacca cccaaccttt gtagggagtg aacgctgtag 180 0105 acctgggtac acgttcacat ctattaccct aaagccacca aaaatagacc gtgggtc。

40、tta 240 0106 ttacggtaaa aggttgttac tacctgattc agtcacggaa tatgataaga agcttgtttc 300 0107 gcgcattcaa attcgagtta atcctttgcc gaaatttgat tctaccgtgt gggtgacagt 360 0108 ccgtaaagtt cctgcctcct cggacttatc cgttgccgcc atc 403 0109 3 0110 515 0111 RNA 0112 人工序列 0113 3 0114 uaacuuuaga guccugucgc aacagcuuuc gcgac。

41、uuaau aagacguuag cagcuggucg 60 0115 uccaacuauu aaccacccaa ccuuuguggg uagugaacgc uguagaccug gguacacguu 120 0116 cacaucuaua acccuuaagc cuccgaaaau agaccguggg ucuuauuaug guaaaagguu 180 0117 gcugcuuccu gauucaguca cugaguucga uaacguguuc uugucaucag cgugggccga 240 0118 cccaauagag uuaauuaauu uauguauuaa ugccuu。

42、agga aaucaguuuc aaacacaaca 300 0119 agcucgaacu gucguucaaa gacaauucag ugaggugugg aaaccuucac cacaaguaac 360 0120 uguuagguuu ccugacagug acuuuaaggu guacagguac aaugcgguau uagacucgcu 420 0121 agucacagca cuguuaggug cauucgacac uaaaauagaa uaauagaugu ugaaaaucag 480 0122 gcgaacccca cgacugccga aacguuagau gcuac 。

43、515 0123 4 0124 515 0125 RNA 0126 人工序列 0127 4 0128 guagcaucua acguuucggc agucgugggg uucgccugau uuucaacauc uauuauucua 60 0129 uuuuaguguc gaaugcaccu aacagugcug ugacuagcga gucuaauacc gcauuguacc 120 0130 uguacaccuu aaagucacug ucaggaaacc uaacaguuac uuguggugaa gguuuccaca 180 0131 ccucacugaa uugucuuuga acg。

44、acaguuc gagcuuguug uguuugaaac ugauuuccua 240 0132 aggcauuaau acauaaauua auuaacucua uugggucggc ccacgcugau gacaagaaca 300 0133 cguuaucgaa cucagugacu gaaucaggaa gcagcaaccu uuuaccauaa uaagacccac 360 0134 ggucuauuuu cggaggcuua aggguuauag augugaacgu guacccaggu cuacagcguu 420 0135 cacuacccac aaagguuggg ugg。

45、uuaauag uuggacgacc agcugcuaac gucuuauuaa 480 0136 gucgcgaaag cuguugcgac aggacucuaa aguua 515 0137 5 0138 515 0139 DNA 0140 人工序列 说 明 书 CN 101186629 B8/9 页 10 0141 5 0142 gtagcatcta acgtttcggc agtcgtgggg ttcgcctgat tttcaacatc tattattcta 60 0143 ttttagtgtc gaatgcacct aacagtgctg tgactagcga gtctaatacc gc。

46、attgtacc 120 0144 tgtacacctt aaagtcactg tcaggaaacc taacagttac ttgtggtgaa ggtttccaca 180 0145 cctcactgaa ttgtctttga acgacagttc gagcttgttg tgtttgaaac tgatttccta 240 0146 aggcattaat acataaatta attaactcta ttgggtcggc ccacgctgat gacaagaaca 300 0147 cgttatcgaa ctcagtgact gaatcaggaa gcagcaacct tttaccataa ta。

47、agacccac 360 0148 ggtctatttt cggaggctta agggttatag atgtgaacgt gtacccaggt ctacagcgtt 420 0149 cactacccac aaaggttggg tggttaatag ttggacgacc agctgctaac gtcttattaa 480 0150 gtcgcgaaag ctgttgcgac aggactctaa agtta 515 0151 6 0152 515 0153 DNA 0154 人工序列 0155 6 0156 taactttaga gtcctgtcgc aacagctttc gcgacttaa。

48、t aagacgttag cagctggtcg 60 0157 tccaactatt aaccacccaa cctttgtggg tagtgaacgc tgtagacctg ggtacacgtt 120 0158 cacatctata acccttaagc ctccgaaaat agaccgtggg tcttattatg gtaaaaggtt 180 0159 gctgcttcct gattcagtca ctgagttcga taacgtgttc ttgtcatcag cgtgggccga 240 0160 cccaatagag ttaattaatt tatgtattaa tgccttagga。

49、 aatcagtttc aaacacaaca 300 0161 agctcgaact gtcgttcaaa gacaattcag tgaggtgtgg aaaccttcac cacaagtaac 360 0162 tgttaggttt cctgacagtg actttaaggt gtacaggtac aatgcggtat tagactcgct 420 0163 agtcacagca ctgttaggtg cattcgacac taaaatagaa taatagatgt tgaaaatcag 480 0164 gcgaacccca cgactgccga aacgttagat gctac 515 0165 7 0166 302 0167 DNA 0168 人工序列 0169 7 0170 cgtgttcttg tcatcagcgt g。