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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710673538.2 (22)申请日 2017.08.09 (71)申请人 中国农业科学院郑州果树研究所 地址 450009 河南省郑州市管城回族区港 湾路28号 (72)发明人 李娜马双武尚建立王吉明 李楠楠 (74)专利代理机构 河南科技通律师事务所 41123 代理人 张晓辉樊羿 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子 标记和应用 (57)摘要。
2、 本发明公开了一种西瓜肉色性状主效基因 位点及其InDel分子标记和应用。 结合肉色为粉 红色和红色的母本和父本杂交的F2群体遗传连 锁图谱和对父母本、 F1和F2群体进行肉色的表型 鉴定， 用Rqtl-IM-binary法进行QTL初定位； 结合 亲本的重测序设计InDel引物； 用InDel引物在父 母本、 F1进行多态性筛选， 用多态性的InDel引物 在F2群体中进行基因型鉴定； 用JoinMap4.0进行 图谱构建。 经上述技术措施， 得到西瓜肉色性状 主效基因位点FC6， 并制备了与肉色紧密连锁的 插入缺失分子标记InDel19_fc6。 可为鉴定西瓜 肉色提供新手段， 加速西瓜肉。
3、色的改良进程， 提 高育种的准确性和选择效率。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 107254542 A 2017.10.17 CN 107254542 A 1.一种西瓜肉色性状主效基因位点， 其特征在于， 所述位点为 FC6， 位于西瓜6号染色 体18-23.8Mb处。 2.一种西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记， 其特征在于， 所述分子标记的核 苷酸序列为AAATGAAACATGATATATTAAGG。 3.根据权利要求2所述西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记， 其特征在于， 所 述分子标记的上游引物为InDel19_fc6F， 核苷酸序列为CTT。
4、TAATGCCTAATAACCAA； 所述分子 标记的下游引物为InDel19_fc6R， 核苷酸序列为AAAGGAGGAAATTCAAATCA。 4.一种西瓜肉色基因型的鉴定方法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） DNA提取： 利用CTAB法提取西瓜植株总DNA； （2） PCR扩增： 反应体系： 100 ng/ L西瓜植株总DNA 1 L、 InDel19_fc6F （10 mol/L） 1 L、 InDel19_fc6R （10 mol/L） 1 L、 2Power Taq PCR MasterMix 12.5 L、 ddH2O 9.5 L； 反应程序： 94 5 min， 35个。
5、循环的94 20 s、 55 1 min、 72 30 s、 72 5 min； （3） 电泳图谱分析： 对所述扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、 显影、 染色和带型判 读， 找到目标条带， 根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型， 198bp的条 带代表粉红肉色基因型， 175bp的条带代表红肉色基因型。 5.权利要求1所述的西瓜肉色性状主效基因位点或权利要求2所述的西瓜肉色性状主 效基因位点的InDel分子标记在西瓜肉色基因图位克隆中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107254542 A 2 西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用 技术领域 0001。
6、 本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域， 具体涉及一种西瓜肉色性状主效基 因位点及其InDel分子标记和应用。 背景技术 0002 西瓜肉色是西瓜遗传育种的一个重要性状， 肉色的变异非常丰富。 根据2012年国 际葫芦科遗传协会年报中发表的 “西瓜基因目录2012” 所述， 利用传统的遗传学实验目前已 知控制西瓜肉色的基因有8个： B、 C、 i-C、 Wf、 Yscr、 Ycrl、 yo、 y。 传统的遗传学采用数理统计 的方法， 只能将控制肉色的一个或多个基因作为一个整体进行研究， 不能确定单个基因在 染色体上的位置和基因产生的效应。 0003 随着分子标记和测序技术的发展， 西瓜肉色基。
7、因的研究有了一定的进展， 国内有 学者利用白肉西瓜PI296341-FR和红肉西瓜97103分别在2号和4号连锁群定位到了肉色基 因， 并克隆了控制红肉的B基因(LCYB)， 同时将上位性Wf基因位置缩减到了2号染色体的较 小区域。 最新研究利用西瓜转录组筛选的方法发现基因CIPHT4； 2的高表达是西瓜肉色形成 所必需的。 但西瓜其他肉色基因的遗传研究相对很少或是没有， 现有标记的基因型和表型 的符合率比较低， 利用标记进行辅助选择西瓜肉色育种的选择效率和准确率都比较低。 发明内容 0004 本发明提供一种西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记， 并在西瓜肉色 育种中进行了应用， 可。
8、为鉴定西瓜肉色提供新手段， 加速西瓜肉色的改良进程， 提高育种的 准确性和选择效率。 0005 为实现上述技术问题， 本发明采用如下技术方案： 0006 设计一种西瓜肉色性状主效基因位点FC6， 位于西瓜6号染色体18-23.8Mb处。 0007 设计一种西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记， 其核苷酸序列为 AAATGAAACATGATATATTAAGG。 0008 西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记的上游引物为InDel19_fc6F， 核苷 酸序列为CTTTAATGCCTAATAACCAA； 分子标记的下游引物为InDel19_fc6R， 核苷酸序列为 AAAGGAGG。
9、AAATTCAAATCA。 0009 设计一种西瓜肉色基因型的鉴定方法， 包括以下步骤： 0010 DNA提取： 利用CTAB法提取西瓜植株总DNA； 0011 PCR扩增： 反应体系： 100ng/ L西瓜植株总DNA 1 L、 InDel19_fc6F(10 mol/L)1 L、 InDel19_fc6R(10 mol/L)1 L、 2PowerTaqPCRMasterMix 12.5 L、 ddH2O 9.5 L； 反应程 序： 945min， 35个循环的9420s、 551min、 7230s、 725min； 0012 电泳图谱分析： 对所述扩增产物进行8聚丙烯酰胺凝胶电泳、 显影。
10、、 染色和带 型判读， 找到目标条带， 根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型， 198bp 的条带代表粉红肉色基因型， 175bp的条带代表红肉色基因型。 说明书 1/7 页 3 CN 107254542 A 3 0013 西瓜肉色性状主效基因位点或西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记在西 瓜肉色基因图位克隆中的应用。 0014 本发明的有益技术效果在于： 0015 1.本发明首次在6号染色体定位了西瓜肉色的主效基因位点， 可解释90.36的表 型方差。 0016 2.本发明肉色紧密连锁的InDel分子标记变异稳定、 检测容易， 并且成本低廉， 该 标记的准确率达到96.。
11、7。 0017 3.本发明为鉴定西瓜肉色提供了快速、 便捷的新手段， 提高了西瓜肉色育种的选 择效率和准确率， 从而能加快育种进程。 附图说明 0018 图1是肉色形态学标记的连锁分析与QTL效应的对比图； 0019 图2是利用分子标记InDel19_fc6的引物在部分F2群体基因组DNA中的PCR结果电 泳图。 具体实施方式 0020 下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式， 但以下实施例只是用来详 细说明本发明， 并不以任何方式限制本发明的范围。 在以下实施例中所涉及的仪器设备如 无特别说明， 均为常规仪器设备； 所涉及的原料如无特别说明， 均为市售常规原料； 所涉及 的检测方法，。
12、 如无特别说明， 均为常规方法。 0021 实施例1： 0022 西瓜肉色性状主效基因位点的确定， 具体步骤如下： 0023 (1)西瓜肉色全基因组QTL定位 0024 依据文献Shang et al.,Construction of a high-density genetic map for watermelon(Citrullus lanatus L.)based on large-scale SNP discovery by specific length amplified fragment sequencing(SLAF-seq) .Scientia Horticulturae 2。
13、016,203:38-46.中利用母本 “ZXG01478” (粉红肉)和父本 “14CB11” (红肉) 杂交获得F2群体构建的高密度的遗传连锁图谱， 对父母本、 F1和F2群体的93个单瓜进行肉色 的直观鉴定； 结合遗传连锁图谱和F2群体表型鉴定结果， 利用Rqtl-IM-binary方法进行QTL 初定位， 仅在LG6鉴定到一个肉色的主效QTL(FC6)， 如图1所示， 其LOD峰值为23.65， 解释 90.36的表型变异， 对应的置信区间(2-LOD)为69-106cM， 对应的物理位置为6号染色体的 18-23.8Mb。 0025 (2)父母本的重测序 0026 利用母本和父本进行。
14、了22深度的高通量重测序。 两个亲本共检测到45134个小 的InDel。 0027 (3)QTL区域InDel标记的开发 0028 在QTL定位的峰值区域搜索插入缺失片段大于20bp的InDels。 利用Perl自编程序 提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列， 设计InDel引物。 0029 实施例2： 说明书 2/7 页 4 CN 107254542 A 4 0030 西瓜F2群体分子标记分析， 具体步骤如下： 0031 (1)利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA， 具体步骤如下： 0032 取1g新鲜西瓜叶片放入研钵， 加入液氮研成粉末状， 随即转入加有1mL CTAB抽 取液的离心。
15、管中， 使二者充分混匀， 然后置于65恒温水浴60min， 其间颠倒混合2-3次； 0033 从水浴锅取出后， 8000rpm离心1min； 0034 取上清液置于另一离心管中， 加与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液， 轻轻 颠倒使其充分混匀， 其中氯仿和异戊醇体积比为24： 1； 0035 10000rpm离心5min， 取上清液； 0036 加入0.7倍体积的提前预冷30min的异丙醇， 混匀后置于-20冷冻不超过30min 让DNA析出； 取出后10000rpm离心5min， 留沉淀弃上清液； 0037 用无水乙醇清洗沉淀数次， 倒掉浸泡液， 打开离心管盖子晾干； 0038 加入200 。
16、L的蒸馏水溶解DNA； 用紫外分光光度计测定DNA的浓度， 于-20冰箱 中保存备用。 0039 (2)PCR反应体系和程序 0040 PCR反应体系如下： 西瓜叶片总DNA(100ng/ l)1 L、 Forward primer(10 mol/L)1 L、 Reverse primer(10 mol/L)1 L、 2Power Taq PCR MasterMix 12.5 L、 ddH2O 9.5 L。 0041 PCR反应程序为： 945min， 35个循环的9420s、 551min、 7230s、 725min。 0042 (3)对PCR产物进行8聚丙烯酰胺凝胶电泳、 显影、 染色和。
17、带型判读。 0043 试剂配制： 0044 A.5TBE： 0045 Tris-base 53.9g； EDTA 3.72g； 硼酸27.5g； 用蒸馏水定容至1L。 0046 B.40聚丙烯酰胺溶液： 0047 聚丙烯酰胺193.34g； 甲叉双丙烯酰胺6.66g； 用蒸馏水定容至500mL。 0048 C.8聚丙烯酰胺凝胶： 0049 40聚丙烯酰胺溶液10Ml； 5TBE 5mL； 10过硫酸铵(APS)200 L； 四甲基乙二胺 (TEMED)80 L； 蒸馏水22mL 0050 D.银染液： 0051 硝酸银1g； 冰醋酸5mL； 无水乙醇50mL； 用去离子水定容至500mL。 0。
18、052 E.显影液： 0053 氢氧化钠15g； 甲醛(37)2.5mL； 用去离子水定容至500mL。 0054 凝胶板准备： 0055 玻璃板用蒸馏水洗净、 晾干后， 用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭， 晾干。 将凹板 和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子。 在洗瓶内配置8聚丙烯酰胺 凝胶溶液， 混匀后快速注入两板中间的缝隙内， 注满后插入有齿的梳子， 等待溶液充分凝 固。 0056 电泳： 0057 将制胶器支架从底座上取下， 直接放入配套的电泳槽中， 在电泳槽底部及支架上 两块玻璃板中间倒入适量的1TBE缓冲液。 在PCR产物中加入0.2倍体积的6DNA Loading B。
19、uffer， 混匀后取0.8 L加入点样孔内， 260V电泳35min。 说明书 3/7 页 5 CN 107254542 A 5 0058 染色和显影： 0059 电泳完成后， 从电泳槽中取出玻璃板， 撬去凹板， 凝胶会贴附于平板上， 凝胶面向 上将平板放入银染液中， 置于脱色摇床上轻摇15min， 凝胶会自动脱落下来； 银染完毕， 将凝 胶取出放入去离子水中清洗10s； 清洗完毕后将凝胶转入显影液中， 轻摇摇床， 待条带清晰 后取出凝胶， 放置在阅片器上观察并拍照保存。 0060 带型判读： 0061 将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上， 观察两亲本条带的位置差异。 0062 实施例3。
20、 0063 F2群体遗传连锁图谱的重新构建， 其步骤如下： 0064 将肉色表型归为一个形态学标记FC_P， 依据FC_P和LG6上的其它SNP标记利用 JoinMap4.0进行图谱构建和连锁分析， 发现FC_P位于主效QTL FC6的峰值区域， 如图1所示。 0065 至此， 我们制备了与肉色QTL(FC6)紧密连锁的共显性分子标记InDel19_fc6， 对应 于6号染色体21671788bp的一个23bp的插入缺失， 其序列为AAATGAAACATGATATATTAAGG， 其 引物序列为 ， InDel19_f c6F ： CTTTAATGCCTAATAACCAA ； InDel19_。
21、f c6R ： AAAGGAGGAAATTCAAATCA。 该引物在母本(粉红肉)中的扩增产物大小为198bp， 在父本(红肉) 中的扩增产物大小为175bp。 0066 实施例4 0067 InDel19_fc6分子标记在育种中的应用， 其应用步骤如下： 0068 (1)与实施例2不同之处在于， PCR反应体系中所用引物为InDel19_fc6F和 InDel19_fc6， 以鉴定InDel19_fc6分子标记在F2群体中的基因型， 电泳结果如图2所示， 父 母本方框中条带为目的条带， 名称皆为品种名称或代号的后两或三位。 0069 (2)检查InDel19_fc6分子标记的两种基因型在93。
22、个F2群体中的分布情况， 如表1 所示， 其中A代表母本带型， 扩增产物大小为198bp； B代表父本带型， 扩增产物大小为180bp； H代表杂合基因型。 0070 结果如表1所示， 分子标记InDel19_fc6的基因型在19份粉红肉株系中都为A。 而在 74份红肉株系中， 有2份为A， 30份为B， 42份为H。 0071 表1 InDel19_fc6在F2群体中的鉴定和验证 说明书 4/7 页 6 CN 107254542 A 6 0072 说明书 5/7 页 7 CN 107254542 A 7 0073 说明书 6/7 页 8 CN 107254542 A 8 0074 0075 。
23、分子标记InDel19_fc6的基因型为A的21个株系19个是粉红肉， 2个是红肉， 而在基 因型为B的30个株系都是红肉， 其基因型鉴定的准确率达到96.7。 0076 综上所述， 通过分子标记InDel19_fc6来预测西瓜肉色， 即区分粉红肉和红肉， 可 以提高肉色育种的选择效率， 从而加速育种进程。 0077 上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明， 但是， 所属技术领域的技术人 员能够理解， 在不脱离本发明宗旨的前提下， 还可以对上述实施例中的各个具体参数进行 变更， 形成多个具体的实施例， 均为本发明的常见变化范围， 在此不再一一详述。 说明书 7/7 页 9 CN 10725。
24、4542 A 9 SEQUENCE LISTING 中国农业科学院郑州果树研究所 西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用 2017 3 PatentIn version 3.2 1 23 DNA Citrullus lanatus 1 aaatgaaaca tgatatatta agg 23 2 20 DNA 人工序列 2 ctttaatgcc taataaccaa 20 3 20 DNA 人工序列 3 aaaggaggaa attcaaatca 20 序列表 1/1 页 10 CN 107254542 A 10 图1 说明书附图 1/2 页 11 CN 107254542 A 11 图2 说明书附图 2/2 页 12 CN 107254542 A 12 。