用于检测实蝇Idgf4基因表达量的引物对.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810721991.0 (22)申请日 2018.07.04 (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 (72)发明人 李志红顾欣悦柳丽君粟耘 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅魏少伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测实蝇Idgf4基因表达量的引物对 (57。

2、)摘要 本发明公开了用于检测实蝇Idgf4基因表达 量的引物对。 本发明公开的引物对由序列表中序 列3和序列4所示的两条单链DNA组成。 实验证明， 本发明提供的用于检测实蝇Idgf4基因表达量的 引物对可以特异、 快速、 准确地对橘小实蝇和番 石榴果实蝇的Idgf4基因进行定量检测， 可用于 实蝇Idgf4基因干扰效率的评价。 另外， 定量检测 解决了同一基因在不同实蝇之间表达量的比较 问题， 并且操作方便、 快捷、 成本低。 本发明还能 够为Idgf4基因的研究和实蝇的防治提供工具及 相关靶点， 对实蝇的防治具有重要的意义， 并为 有效控制危险性实蝇的扩散、 保护农业生产和生 态安全、 促。

3、进我国经济贸易发展提供潜在靶标基 因参考。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图5页 CN 108913782 A 2018.11.30 CN 108913782 A 1.引物对， 由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。 2.根据权利要求1所述的引物对， 其特征在于： 所述引物对用于检测实蝇Idgf4基因表 达量。 3.检测实蝇Idgf4基因表达量的系统， 包括权利要求1或2所述的引物对。 4.根据权利要求3所述的系统， 其特征在于： 所述系统还包括进行定量PCR检测基因表 达量所需的其他试剂和/或仪器。 5.根据权利要求4所述的系统， 其特征在于： 进行定量PCR检测基因。

4、表达量所需的其他 试剂为北京华博德亿生物技术有限公司的Takara Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒中试剂。 6.检测实蝇Idgf4基因表达量的方法， 包括： 利用权利要求1所述的引物对检测待测实 蝇的Idgf4基因表达量， 得到所述待测实蝇Idgf4基因表达量。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于： 所述待测实蝇为橘小实蝇和/或番石榴果 实蝇。 8.根据权利要求1或2所述的引物对， 或权利要求3-5中任一所述的系统， 或权利要求6 或7所述的方法， 其特征在于： 所述实蝇为橘小实蝇和/或番石榴果实蝇。 9.根据权利要求8所述的引物对、 系统或。

5、方法， 其特征在于： 所述实蝇为幼虫、 蛹和/或 成虫。 10.权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-5中任一所述的系统的下述任一应用： X1)在检测实蝇Idgf4基因表达量中的应用； X2)在制备检测实蝇Idgf4基因表达量产品中的应用； X3)在检测实蝇Idgf4基因中的应用； X4)在制备检测实蝇Idgf4基因产品中的应用； X5)在防治实蝇中的应用； X6)在鉴定实蝇中的应用； X7)在制备鉴定实蝇产品中的应用； X8)在检测实蝇Idgf4基因干扰效率中的应用； X9)在检测实蝇防治产品对实蝇Idgf4基因干扰效率中的应用； X10)在检测实蝇防治效果中的应用； X11)在检测实蝇防。

6、治产品对实蝇防治效果中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108913782 A 2 用于检测实蝇Idgf4基因表达量的引物对 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中， 用于检测实蝇Idgf4基因表达量的引物对。 背景技术 0002 橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)隶属双翅目Diptera、 实蝇科 Tephritidae、 果实蝇属Bactrocera， 该虫为多食性害虫， 可取食柑橘、 番石榴、 芒果等46科 250多种水果蔬菜。 以幼虫在水果、 蔬菜的果实内部取食以及成虫在果实表皮产卵形成孔 洞， 造成落果或整个果实腐烂为害， 这不仅给果蔬生产。

7、带来严重危害， 而且给进出口贸易带 来严重影响。 由于该虫寄主范围广， 繁殖力高， 适应能力强， 许多国家都将其列为重点检疫 对象(张彬等， 2008)。 0003 橘小实蝇原产于亚洲的热带地区， 现分布范围广， 涉及亚太地区和非洲地区的热 带、 亚热带和温带地域。 此虫的种群发生数量大， 往往对新入侵地的果蔬生产造成严重损失 (陈乃中， 2009)。 自2012年以来， 来自澳大利亚等国家和地区的实蝇工作者从形态测量学、 遗传学、 行为学、 化学生态学等方面研究了橘小实蝇复合体中的橘小实蝇、 木瓜果实蝇 B.papayae Drew&Hancock、 菲律宾果实蝇B.philippinens。

8、is Drew&Hancock、 入侵果实蝇 B.invadens Drew和杨桃果实蝇B.carambolae Drew&Hancock， 结果显示， 木瓜果实蝇、 菲律 宾果实蝇和入侵果实蝇均为橘小实蝇， 是其同物异名， 而杨桃果实蝇为另一物种(Schutze et al,2012； 2014a； 2014b)。 此研究已于2014年10月被FAO官方网站进行了报道。 这一 “四合 一” 的新发现， 使橘小实蝇的分布范围有了更大的拓展， 形成了全球性的扩散， 这对全球实 蝇类害虫的科学研究产生了重要影响， 对入侵防控工作也提出了进一步的要求。 0004 番石榴果实蝇B.correcta(B。

9、ezzi)原产于亚洲热带和亚热带地区(汪兴鉴及赵明 珠， 1989)， 现主要分布于泰国、 越南、 缅甸、 尼泊尔、 印度、 巴基斯坦等国家。 在国内仅发生于 云南省(梁广勤等， 1996)。 多食性害虫， 以热带和亚热带果蔬为主(梁广勤等， 1996)， 包括番 石榴、 芒果、 樱桃等30科60余种瓜果蔬菜(White IM et al,1992)。 其危害在于成虫产卵于 果皮内侧， 幼虫蛀果， 引发真菌感染并导致果实腐烂脱落。 该虫早在1992年就被列入 中华 人民共和国进境植物检疫危险性病、 虫、 杂草名录 ， 且在口岸检疫截获频率较高， 对番石榴 果实蝇的重要基因相关研究和有效检测存在。

10、重要的经济意义。 0005 昆虫表皮由几丁质和表皮蛋白组成， 其主要功能是保持身体结构， 抑制水分蒸发 和抵御外界不良环境的影响， 在抗药性方面， 昆虫表皮作为化学杀虫剂进入昆虫体内的第 一道防线， 发挥着不可忽视的重要作用。 CG5210基因(Idgf6基因)和Idgf4基因隶属于对表 皮发育起重要作用的糖苷水解酶18家族， 两个基因作为成虫盘生长因子(Imaginal-disc- growth-factor)对于实蝇的正常发育和羽化起着重要的作用。 在近似种果蝇Drosophila中 两个基因的沉默均被证明会造成果蝇幼虫时期的表皮损伤以及畸形发育， 甚至会造成发育 过程中的死亡。 在家蚕B。

11、ombyx mori翅芽发育的重要阶段一种Idgf基因一直呈现一个非常 高的水平， 并且Idgf基因与翅形成的细胞分化与发育相关。 在害虫防治的研究中， 鉴于两种 基因在昆虫类群中的保守性及其在生长发育中的重要作用， 两种基因均可为新杀虫剂的研 说明书 1/5 页 3 CN 108913782 A 3 究提供特异性靶标基因位点。 生产相应的双链产品或者制剂会使昆虫因上皮屏障受损而导 致过早死亡， 并且增加昆虫对于致病菌的感染率， 可作为开发害虫防治的新型农药的目标 基因。 0006 橘小实蝇和番石榴果实蝇作为重要经济性检疫害虫， 对果蔬生产贸易危害巨大。 且两种实蝇均具有较强的扩散能力与抗药性。

12、， 所以研究CG5210基因和Idgf4基因的表达水 平可以为两种重要经济实蝇的入侵防控提供重要参考。 发明内容 0007 本发明要解决的技术问题是提供橘小实蝇和番石榴果实蝇Idgf4基因的实时荧光 PCR定量检测方法。 0008 为解决上述技术问题， 本发明首先提供一种引物对， 所述引物对由序列表中序列3 和序列4所示的两条单链DNA组成。 0009 所述引物对可用于检测实蝇Idgf4基因表达量。 0010 所述引物对中的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。 两条单链DNA可独立包装。 0011 为解决上述技术问题， 本发明还提供了用于检测实蝇Idgf4基因表达量的系统， 所 述系统所述引物对。

13、。 0012 上述系统中， 所述系统还包括进行定量PCR检测基因表达量所需的其他试剂和/或 仪器。 0013 所述进行定量PCR检测基因表达量所需的其他试剂可为北京华博德亿生物技术有 限公司的Takara Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒中试剂。 0014 所述仪器可为Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System。 0015 所述可由所述引物对和进行定量PCR检测基因表达量所需的其他试剂和/或仪器 组成。 0016 所述系统可为仅包括试剂的试剂盒。 0017 为解决上述技术问题， 本发明还提供了检测实蝇Idgf。

14、4基因表达量的方法， 所述方 法包括： 利用所述引物对检测待测实蝇的Idgf4基因表达量， 得到所述待测实蝇Idgf4基因 表达量。 0018 上述方法中， 所述待测实蝇可为橘小实蝇和/或番石榴果实蝇。 0019 为解决上述技术问题， 本发明还提供了所述引物对或所述系统的下述任一应用： 0020 X1)在检测实蝇Idgf4基因表达量中的应用； 0021 X2)在制备检测实蝇Idgf4基因表达量产品中的应用； 0022 X3)在检测实蝇Idgf4基因中的应用； 0023 X4)在制备检测实蝇Idgf4基因产品中的应用； 0024 X5)在防治实蝇中的应用； 0025 X6)在鉴定实蝇中的应用； 。

15、0026 X7)在制备鉴定实蝇产品中的应用； 0027 X8)在检测实蝇Idgf4基因干扰效率中的应用； 0028 X9)在检测实蝇防治产品对实蝇Idgf4基因干扰效率中的应用； 0029 X10)在检测实蝇防治效果中的应用； 说明书 2/5 页 4 CN 108913782 A 4 0030 X11)在检测实蝇防治产品对实蝇防治效果评估中的应用。 0031 本发明中， 所述实蝇可为橘小实蝇和/或番石榴果实蝇。 所述实蝇具体可为所述实 蝇的幼虫、 蛹和/或成虫。 0032 实验证明， 本发明提供的用于检测实蝇Idgf4基因表达量的引物对可以特异、 快 速、 准确地对橘小实蝇和番石榴果实蝇的Id。

16、gf4基因进行定量检测， 可用于实蝇Idgf4基因 干扰效率的评价。 另外， 定量检测过程中的成本低、 操作简单， 解决了同一基因在不同实蝇 之间表达量的比较问题， 并且在实际生产中两种实蝇同一基因使用同一对引物检测更加方 便、 快捷、 成本低。 本发明还能够为Idgf4基因的研究和实蝇的防治提供工具及相关靶点， 对 实蝇的防治具有重要的意义， 并为有效控制危险性实蝇的扩散、 保护农业生产和生态安全、 促进我国经济贸易发展提供潜在靶标基因参考。 附图说明 0033 图1为内参基因(18s rRNA)在橘小实蝇(Bd)和番石榴果实蝇(Bc)中的检测结果。 0034 图2为CG5210-rt在橘小。

17、实蝇(Bd)和番石榴果实蝇(Bc)中的特异性检测结果。 0035 图3为Idgf4-rt在橘小实蝇(Bd)和番石榴果实蝇(Bc)中的特异性检测结果。 0036 图4为CG5210-rt在橘小实蝇(Bd)和番石榴果实蝇(Bc)1龄幼虫(L1)、 3龄早期幼虫 (L3-1)、 3龄末期幼虫(L3-3)、 早期蛹(P-E)、 中期蛹(P-M)、 末期蛹(P-L)、 刚羽化未性成熟成 虫(A1)和十日龄性成熟成虫(A10)中的表达量检测分析结果。 相同字母间表示无显著差异， 不同字母间表示由有显著差异(P0.05)。 0037 图5为Idgf4-rt在橘小实蝇(Bd)和番石榴果实蝇(Bc)1龄幼虫(L。

18、1)、 3龄早期幼虫 (L3-1)、 3龄末期幼虫(L3-3)、 早期蛹(P-E)、 中期蛹(P-M)、 末期蛹(P-L)、 刚羽化未性成熟成 虫(A1)和十日龄性成熟成虫(A10)中的表达量检测分析结果。 相同字母间表示无显著差异， 不同字母间表示由有显著差异(P0.05)。 具体实施方式 0038 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为 常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂、 仪器等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次技。

19、术重复实验和六组生物学重复实验， 结果取平均 值。 下述实施例中， 如无特殊说明， 序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5 末端核 苷酸， 末位均为相应DNA的3 末端核苷酸。 0039 实施例1、 用于检测实蝇CG5210和Idgf4基因表达量的引物对的制备 0040 本实施例提供了用于检测实蝇CG5210和Idgf4基因表达量的引物对， 分别记为 CG5210-rt和Idgf4-rt。 CG5210-rt由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成， 该引 物对中两条单链DNA的摩尔比为1:1， 且两条单链DNA均独立包装。 Idgf4-rt由序列表中序列 3和序列4所示的两条。

20、单链DNA组成， 该引物对中两条单链DNA的摩尔比为1:1， 且两条单链 DNA均独立包装。 0041 实施例2、 利用实施例1的引物对检测实蝇CG5210和Idgf4基因表达量 0042 待测实蝇： 采自云南的番石榴果实蝇和采自广州的橘小实蝇， 每种实蝇一龄幼虫 说明书 3/5 页 5 CN 108913782 A 5 50头、 二龄幼虫30头、 三龄早期幼虫(自卵孵化后5日龄幼虫)30头、 三龄末期幼虫(自卵孵化 后7日龄幼虫)20头、 早期蛹(自化蛹后1日龄蛹)6头、 中期蛹(自化蛹后5日龄蛹)6头、 末期蛹 (自化蛹后9日龄蛹)6头、 羽化后未性成熟成虫10头、 十日龄性成熟成虫10头。

21、。 0043 利用天根生化科技(北京)有限公司的RNAsimple总RNA提取试剂盒提取各实蝇的 总RNA， 然后反转录得到cDNA。 以橘小实蝇和番石榴果实蝇反转录得到的cDNA为模板， 采用 北京华博德亿生物技术有限公司的Takara Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus) 试剂盒， 分别利用实施例1的CG5210-rt和Idgf4-rt进行实时荧光PCR定量检测CG5210和 Idgf4基因表达量， 所用仪器为Applied Biosystems7500Real-Time PCR System仪器， 以 ddH2O代替模板作为阴性对照。 0044 实时荧光P。

22、CR的反应体系如下： 0045 0046 0047 其中， 序列1和序列3所示的单链DNA均为正向引物， 序列2和序列4所示的单链DNA 均为反向引物。 0048 实时荧光PCR的反应程序为： 预变性9530sec； 然后955sec， 5234sec循环40 次； 9515sec； 521min； 9530sec。 0049 内参基因为18s rRNA， 引物序列(Hu et al.,2014)为： 0050 正向引物18s rRNA-rt-F： 5 -GCGAGAGGTGAAATTCTTGG-3 ； 0051 反向引物18s rRNA-rt-R： 5 -CGGGTAAGCGACTGAGAG。

23、AG-3 。 0052 结果(图1-5)显示， 两个引物对均能在橘小实蝇和番石榴果实蝇中进行相关基因 的扩增定量， 并能有效针对包括幼虫、 蛹、 成虫等不同发育时期进行检测， 且结果稳定、 重复 性好、 特异性高。 结果表明两个基因均在两种实蝇的八个发育时期表达， CG5210-rt在橘小 实蝇中除三龄末期幼虫与性成熟成虫中有显著性提升外其余时期表达均没有显著性差异， 而在番石榴实蝇中表达量的显著性提升集中在中末期蛹以及性成熟成虫。 两种实蝇该基因 CG5210的表达量主要区别在蛹的中后期和性成熟成虫中。 Idgf4-rt在橘小实蝇中早期蛹与 性成熟成虫中有显著性提升， 其余时期表达均没有显著。

24、性差异， 而在番石榴实蝇中表达量 的显著性提升集中在蛹后期和成虫期。 两种实蝇该基因Idgf4的表达量主要区别在蛹的前 后期和早期成虫中。 以上结果表明， 这两个引物对可以检测比较两种实蝇三个不同虫态涉 及八个不同时期相关基因的表达。 0053 将成功进行扩增的扩增产物不同样品不同时期进行双向测序， 结果显示， CG5210- rt对橘小实蝇进行扩增得到的产物的序列为序列表中序列5， 对番石榴果实蝇进行扩增得 到的产物的序列为序列表中序列7； Idgf4-rt对橘小实蝇进行扩增得到的产物的序列为序 说明书 4/5 页 6 CN 108913782 A 6 列表中序列6， 对番石榴果实蝇进行扩增。

25、得到的产物的序列为序列表中序列8。 两种引物对 均能准确扩增到相应基因的DNA片段。 0054 实施例3、 实施例1的引物对所需模板量的优化 0055 将实施例2得到的cDNA分别进行10倍梯度稀释， 得到各实蝇特定发育时期的稀释 10倍、 100倍、 1000倍和10000倍的cDNA稀释液(cDNA的含量分别为100 g/ l， 10 g/ l， 1 g/ l和0.1 g/ l)， 然后以此为模板利用实施例2的反应体系与反应程序确定最佳模板量， 并利 用水设置阴性对照。 0056 结果显示， 以100 g/ l即稀释10倍后的cDNA为模板， 两种引物对均可以在橘小实 蝇和番石榴果实蝇中得。

26、到阳性扩增曲线， 并且内参基因和目标基因的扩增曲线为单峰同时 满足内参基因CT保持在10左右说明各个样品处理中cDNA质量达标并且重复性好， 检测目标 基因的CT值在2030的合理范围内； 而以10 g/ l， 1 g/ l和0.1 g/ l的cDNA为模板， 两种 引物对均不能在橘小实蝇和番石榴果实蝇中得到目标基因合理范围内的CT值， 即目标基因 CT30， 阴性对照中也无阳性扩增曲线。 表明， cDNA浓度为100 g/ l(即将实施例2的cDNA稀 释10倍)时的扩增效果最好； 引物对CG5210-rt和Idgf4-rt的灵敏度均为100 g/ l。 0057 对比例1、 其它引物对对C。

27、G5210和Idgf4基因表达量的检测 0058 1、 针对CG5210利用进行其他引物对进行扩增， 所用引物为： 0059 CG5210-rt-F-1： GGCTGAGGAACATAAGGAA； 0060 CG5210-rt-R-1： GCGGGCACATCATAGAA。 0061 扩增体系与扩增条件同实施例2。 0062 该引物对对橘小实蝇和番石榴果实蝇的cDNA中扩增效果均不好， 在部分样品与部 分时期CT值大于30， 溶解曲线不为单峰， 并且无法得到成功测序结果。 0063 2、 针对Idgf4利用其他引物对进行扩增， 所用引物对为Idgf4-rt-1和Idgf4-rt-2。 0064。

28、 Idgf4-rt-1的两条引物的序列如下： 0065 Idgf4-rt-F-1： CCAAATCCCGCCAATCA； 0066 Idgf4-rt-R-1： ATGCCGCCCAAACCTCT。 0067 Idgf4-rt-2的两条引物的序列如下： 0068 Idgf4-rt-F-2： TACCAAATCCCGCCAATC； 0069 Idgf4-rt-R-2： ATGCCGCCCAAACCTCT。 0070 这两个引物对对橘小实蝇和番石榴果实蝇的cDNA中扩增效果均不好， 在部分样品 与部分时期溶解扩增曲线不为单峰， 且CT值大于30， 并且无法得到成功测序结果。 说明书 5/5 页 7 。

29、CN 108913782 A 7 中国农业大学 用于检测实蝇Idgf4基因表达量的引物对 8 PatentIn version 3.5 1 17 DNA 人工序列 1 cggacgagaa gagcagc 17 2 17 DNA 人工序列 2 ggcacgcagt atgggat 17 3 17 DNA 人工序列 3 cgcataccgt tcataaatag 17 4 20 DNA 人工序列 4 20 atgttcctcc gccttct 5 序列表 1/2 页 8 CN 108913782 A 8 177 DNA 橘小实蝇 5 cggacgagaa gagcagcggt catggcttg。

30、t gggtgggcta tgaagatccc gacaccgcgg 60 ctgagaaggc cggctactgt gcgtcaattc aatttgggtg gcgtggccct gtttgatttg 120 tctttcgatg acttccgtgg ttcctgcact ggcgataaat atcccatact gcgtgcc 177 6 186 DNA 橘小实蝇 6 cgcataccgt tcataaatag tgcgcactct ttggtgaaga cttacggttt cgatggtctc 60 gatttggctt ggcaattccc caagaataag gccaaa。

31、aagg tgcatagcgg catcggtaaa 120 ttgtggaagg gtttcaagaa aattttctct ggcgactttg tggtcgatga gaaggcggag 180 gaacat 186 7 176 DNA 番石榴果实蝇 7 cggacgagaa gagcagcggc cacggcttgt gggtgggcta tgaagatccc gacaccgcgg 60 ctgagaaggc cggctacgtg cgtcaattca atttgggtgg cgtggctctg tttgatttgt 120 ctttcgatga cttccgtggt tcctgcac。

32、tg gcgataaata tcccatactg cgtgcc 176 8 186 DNA 番石榴果实蝇 8 cgcataccgt tcataaatag tgcgcattct ttggtgaaga cttacggttt cgatggtctc 60 gatttggctt ggcaattccc caagaacaag gccaaaaagg tgcatagcgg catcggtaaa 120 ttgtggaagg gtttcaagaa aattttctct ggcgactttg tggtcgatga gaaggcggag 180 gaacat 186 序列表 2/2 页 9 CN 108913782 A 9 图1 说明书附图 1/5 页 10 CN 108913782 A 10 图2 说明书附图 2/5 页 11 CN 108913782 A 11 图3 说明书附图 3/5 页 12 CN 108913782 A 12 图4 说明书附图 4/5 页 13 CN 108913782 A 13 图5 说明书附图 5/5 页 14 CN 108913782 A 14 。