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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810865712.8 (22)申请日 2018.08.01 (71)申请人 壹生科 （深圳） 有限公司 地址 518118 广东省深圳市坪山新区金牛 西路16号华瀚科技工业园2号厂房301 室 申请人 北京鼎持生物技术有限公司 (72)发明人 侯野张乾顺邵瑞华黄广达 王璐赵英杰韩丹张志豪 宋春雨 (74)专利代理机构 北京方安思达知识产权代理 有限公司 11472 代理人 陈琳琳武玥 (51)Int.Cl. C12N 5/00(2006.01) (54)发明名称 一种无血。
2、清培养基 (57)摘要 本发明公开了一种无血清培养基， 所述培养 基包含以下组分： DMEM/F12； 以及在DMEM/F12中 添加： 0.6-300ng/mL生长因子、 15-120g/L激 素、 3-150mg/mL蛋白质、 0.1-1.7g/L氨基酸及肽、 6.51-13.1mg/L脂质复合物、 22-220g/L微量元 素、 0.5-5.9mg/L维生素。 本发明涉及一种细胞培 养基， 特别是用于培养悬浮细胞的培养基， 其用 于重组蛋白的表达， 本发明培养基， 完全不含有 血清成份； 生产的抗体纯度大幅度提高； 该培养 基同时具有高扩增速度及高抗体表达能力； 该培 养基能长时间保持细。
3、胞活性， 细胞培养时间大大 延长， 可以大大延长生产时间， 提高抗体产量。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 108913646 A 2018.11.30 CN 108913646 A 1.一种无血清培养基， 其特征在于， 所述培养基包含以下组分： DMEM/F12； 以及在DMEM/F12中添加： 0.6-300ng/mL生长因子、 15-120 g/L激素、 3-150mg/mL蛋白质、 0.1-1.7g/L氨基酸及 肽、 6.51-13.1mg/L脂质复合物、 22-220 g/L微量元素、 0.5-5.9mg/L维生素。 2.如权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所。
4、述的生长因子包括如下组分： 成纤维细胞生长因子0.1-50ng/mL、 重组人表皮细胞生长因子0.1-50ng/mL、 神经生长 因子0.1-50ng/mL、 转化生长因子0.1-50ng/mL、 白血病抑制因子0.1-50ng/mL、 胰岛素样生 长因子-1 0.1-50ng/mL。 3.如权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述的激素包括如下组分： 氢化可的松12-60 g/L、 胰岛素2-20 g/L、 孕酮0-20 g/L、 地塞米松1-20 g/L。 4.如权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述的蛋白质包括如下组分： 血清白蛋白1-50mg/mL、 转铁蛋白1-。
5、50mg/mL、 胎球蛋白1-50mg/mL。 5.如权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述的氨基酸及肽包括如下组分： 谷氨酰胺0-0.1g/L、 还原型谷胱甘肽0.1-1.5g/L、 非必需氨基酸0-0.1g/L。 6.如权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述脂类复合物包括如下组分： 亚油酸0.5-1mg/L、 胆固醇0.01-0.1mg/L、 乙醇胺0.5-1mg/L、 -巯基乙醇0.5-1mg/L、 吐 温-80 5-10mg/L。 7.如权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述微量元素包括如下组分： 氯化锰1-10 g/L、 亚锡酸钠1-10 g/L、。
6、 柠檬酸铁10-100 g/L、 硫酸锌10-100 g/L。 8.如权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述维生素包括如下组分： 生物素0-0.2mg/L、 叶酸0.1-3mg/L、 核黄素0.1-0.3mg/L、 维生素B12 0.1-0.8mg/L、 维生 素C 0.1-0.8mg/L、 维生素E 0.1-0.8mg/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108913646 A 2 一种无血清培养基 技术领域 0001 本发明涉及一种细胞无血清培养基， 属于细胞培养技术领域。 背景技术 0002 无血清培养基是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的 合成培养基。
7、， 可以应用于培养哺乳动物细胞， 例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、 犬肾细胞 (MDCK)、 猴肾细胞(Vero)、 乳仓鼠肾细胞(BHK)等。 0003 目前已广泛采用细胞培养来生产多种生物活性制品， 如病毒疫苗、 单克隆抗体、 非 抗体免疫调节剂、 多肽生长因子、 激素、 酶、 肿瘤特异性抗原等。 这些产品可通过正常的或转 化的和经基因工程改造的细胞产生。 0004 以往， 用于细胞培养的培养基需要添加血清， 作为生产生物活性产品的所有哺乳 动物细胞系生长和维持所需的通用营养物质。 血清含有激素、 生长因子、 载体蛋白质、 粘附 和扩散因子、 营养成分、 微量元素等。 培养基通常含有高达约。
8、10的动物血清， 例如胎牛血 清(FBS)， 也称为胎犊血清(FCS)。 0005 虽然广泛采用了血清， 但是其有许多缺点， 如产物纯化难度加大、 来源限制、 批次 间生物活性差异(导致过程不稳定)、 生物污染(如疯牛病)等。 因此， 研究含已知成分的无血 清培养基成为细胞培养领域中一项重要工作。 0006 目前， 市售的培养基培养的细胞扩增倍数低、 存活时间短、 活性低、 产量不高、 且抗 体纯度低， 不能满足临床应用的问题。 发明内容 0007 本发明的目的是针对现有技术的不足， 开发出一种高效安全稳定的无血清培养 基。 0008 为了实现上述要求和目的， 本发明所采用的技术方案如下： 0。
9、009 一种无血清培养基， 所述培养基包含以下组分： 0010 DMEM/F12； 0011 以及在DMEM/F12中添加： 0012 0.6-300ng/mL生长因子、 15-120 g/L激素、 3-150mg/mL蛋白质、 0.1-1.7g/L氨基酸 及肽、 6.51-13.1mg/L脂质复合物、 22-220 g/L微量元素、 0.5-5.9mg/L维生素。 0013 本发明中， 在DMEM/F12中添加0.6-300ng/mL生长因子表示的是在1mLDMEM/F12中 添加0.6-300ng的生长因子， 其他添加组分所表达的含义与此相同， 即 g/L、 g/L、 mg/L中的L 均是。
10、指作为添加基础的DMEM/F12的量。 0014 优选地， 所述的生长因子包括如下组分及含量： 0015 成纤维细胞生长因子0.1-50ng/mL、 重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.1-50ng/mL、 神经生长因子0.1-50ng/mL、 转化生长因子0.1-50ng/mL、 白血病抑制因子0.1-50ng/mL、 胰 岛素样生长因子-1 0.1-50ng/mL。 说明书 1/4 页 3 CN 108913646 A 3 0016 优选地， 所述的激素包括如下组分及含量： 0017 氢化可的松12-60 g/L、 胰岛素2-20 g/L、 孕酮0-20 g/L、 地塞米松1-20 g/L。
11、。 0018 优选地， 所述的蛋白质包括如下组分及含量： 0019 血清白蛋白1-50mg/mL、 转铁蛋白1-50mg/mL、 胎球蛋白1-50mg/mL。 0020 优选地， 所述的氨基酸及肽包括如下组分及含量： 0021 谷氨酰胺0-0.1g/L、 还原型谷胱甘肽0.1-1.5g/L、 非必需氨基酸0-0.1g/L。 0022 优选地， 所述脂类复合物包括如下组分及含量： 0023 亚油酸0.5-1mg/L、 胆固醇0.01-0.1mg/L、 乙醇胺0.5-1mg/L、 -巯基乙醇0.5-1mg/ L、 吐温-80 5-10mg/L。 0024 优选地， 所述微量元素包括如下组分及含量：。
12、 0025 氯化锰1-10 g/L、 亚锡酸钠1-10 g/L、 柠檬酸铁10-100 g/L、 硫酸锌10-100 g/L。 0026 优选地， 所述维生素包括如下组分及含量： 0027 生物素0-0.2mg/L、 叶酸0.1-3mg/L、 核黄素0.1-0.3mg/L、 维生素B120.1-0.8mg/L、 维生素C 0.1-0.8mg/L、 维生素E 0.1-0.8mg/L。 0028 本发明中所用到的DMEM/F12培养基可以商业购买得到， 所购买的商业化培养基 DMEM/F12可包括如下组分及含量： 0029 无水氯化钙116.6mg/L、 L-亮氨酸59.05mg/L、 亚油酸0.。
13、042mg/L、 五水硫酸铜 0.0013mg/L、 L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L、 硫辛酸0.105mg/L、 九水硝酸铁0.05mg/L、 L-蛋氨 酸17.24mg/L、 酚红8.1mg/L、 七水硫酸亚铁0.417mg/L、 L-苯丙氨酸35.48mg/L、 1,4-丁二胺 二盐酸盐0.081mg/L、 氯化钾311.8mg/L、 L-丝氨酸26.25mg/L、 丙酮酸钠55mg/L、 氯化镁 28.64mg/L、 L-苏氨酸53.45mg/L、 维生素H0.0035mg/L、 无水硫酸镁48.84mg/L、 L-丙氨酸 4.45mg/L、 D-泛酸钙2.24mg/L、 氯化钠6。
14、999.5mg/L、 L-天门冬酰胺7.5mg/L、 氯化胆碱 8.98mg/L、 无水磷酸二氢钠54.35mg/L、 L-天门冬氨酸6.65mg/L、 叶酸2.65mg/L、 磷酸氢二钠 71.02mg/L、 L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L、 i-肌醇12.6mg/L、 七水硫酸锌0.432mg/L、 L-谷氨 酸7.35mg/L、 烟酰胺2.02mg/L、 L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L、 L-脯氨酸17.25mg/L、 盐酸吡哆 醛2mg/L、 L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L、 L-色氨酸9.02mg/L、 盐酸吡哆醇0.031mg/L、 L-谷氨酰 胺365mg/L、 L。
15、-酪氨酸38.4mg/L、 核黄素0.219mg/L、 甘氨酸18.75mg/L、 L-缬氨酸52.85mg/L、 盐酸硫胺2.17mg/L、 L-组氨酸盐酸盐31.48mg/L、 D-葡萄糖3151mg/L、 胸苷0.365mg/L、 L-异 亮氨酸54.47mg/L、 次黄嘌呤2mg/L、 维生素B12 0.68mg/L。 0030 本发明与现有技术相比， 具有如下的优点和有益效果： 0031 本发明涉及一种细胞培养基， 特别是用于培养悬浮细胞的培养基， 其用于重组蛋 白的表达。 本发明一种细胞无血清培养基， 完全不含有血清成份； 生产的抗体质量大幅度提 高； 该培养基同时具有高扩增速度及。
16、高抗体表达能力； 细胞不需要驯化， 可以直接从含血清 培养直接过渡到无血清培养基培养； 该培养基能长时间保持细胞活性， 细胞培养时间大大 延长， 可以大大延长生产时间， 提高抗体产量。 附图说明 0032 此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解， 构成本申请的一部 分， 并不构成对本发明实施例的限定； 说明书 2/4 页 4 CN 108913646 A 4 0033 图1为分别采用本发明的培养基与DMEM/F12+10FBS培养基培养CHO细胞生长曲 线对比图； 0034 图2为分别采用本发明的培养基与DMEM/F12+10FBS培养基培养CHO细胞蛋白产 量对比图。 具体实施方。
17、式 0035 本说明书中公开得任一特征， 除非特别叙述， 均可被其他等效或具有类似目的的 替代特征加以替换。 除非特别叙述， 每个特征只是一系列等效或者类似特征中的一个例子 而已。 所述仅仅是为了帮助理解本发明， 不应该视为对本发明的具体限制。 0036 下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 0037 实施例1 0038 一种无血清培养基， 包括如下浓度的原料： 0039 DMEM/F12； 0040 以及在DMEM/F12中添加： 0041 成纤维细胞生长因子0.1ng/mL、 重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.1ng/mL、 神经生 长因子0.1ng/mL、 转化生长因子。
18、0.1ng/mL、 白血病抑制因子0.1ng/mL、 胰岛素样生长因子-1 0.1ng/mL、 氢化可的松12 g/L、 胰岛素2 g/L、 孕酮1 g/L、 地塞米松1 g/L、 血清白蛋白1mg/ mL、 转铁蛋白1mg/mL、 胎球蛋白1mg/mL、 谷氨酰胺0.01g/L、 还原型谷胱甘肽0.1g/L、 非必需 氨基酸0.01g/L、 亚油酸0.5mg/L、 胆固醇0.01mg/L、 乙醇胺0.5mg/L、 -巯基乙醇0.5mg/L、 吐 温-80 5mg/L、 氯化锰1 g/L、 亚锡酸钠1 g/L、 柠檬酸铁10 g/L、 硫酸锌10 g/L、 生物素 0.01mg/L、 叶酸0.。
19、1mg/L、 核黄素0.1mg/L、 维生素B12 0.1mg/L、 维生素C 0.1mg/L、 维生素E 0.1mg/L。 0042 实施例2 0043 一种无血清培养基， 包括如下浓度的原料： 0044 DMEM/F12； 0045 以及在DMEM/F12中添加： 0046 成纤维细胞生长因子25ng/mL、 重组人表皮细胞生长因子(EGF)25ng/mL、 神经生长 因子25ng/mL、 转化生长因子25ng/mL、 白血病抑制因子25ng/mL、 胰岛素样生长因子-1 25ng/mL、 氢化可的松30 g/L、 胰岛素10 g/L、 孕酮10 g/L、 地塞米松10 g/L、 血清白蛋。
20、白 25mg/mL、 转铁蛋白25mg/mL、 胎球蛋白25mg/mL、 谷氨酰胺0.05g/L、 还原型谷胱甘肽0.75g/ L、 非必需氨基酸0.05g/L、 亚油酸0.75mg/L、 胆固醇0.05mg/L、 乙醇胺0.75mg/L、 -巯基乙醇 0.75mg/L、 吐温-80 7.5mg/L、 氯化锰5 g/L、 亚锡酸钠5 g/L、 柠檬酸铁50 g/L、 硫酸锌50 g/ L、 生物素0.1mg/L、 叶酸1.5mg/L、 核黄素0.15mg/L、 维生素B12 0.4mg/L、 维生素C 0.4mg/L、 维生素E 0.4mg/L。 0047 实施例3 0048 一种无血清培养基。
21、， 包括如下浓度的原料： 0049 DMEM/F12； 0050 以及在DMEM/F12中添加： 0051 成纤维细胞生长因子50ng/mL、 重组人表皮细胞生长因子(EGF)50ng/mL、 神经生长 说明书 3/4 页 5 CN 108913646 A 5 因子50ng/mL、 转化生长因子50ng/mL、 白血病抑制因子50ng/mL、 胰岛素样生长因子-1 50ng/mL、 氢化可的松60 g/L、 胰岛素20 g/L、 孕酮20 g/L、 地塞米松20 g/L、 血清白蛋白 50mg/mL、 转铁蛋白50mg/mL、 胎球蛋白50mg/mL、 谷氨酰胺0.1g/L、 还原型谷胱甘肽1。
22、.5g/L、 非必需氨基酸0.1g/L、 亚油酸1mg/L、 胆固醇0.1mg/L、 乙醇胺1mg/L、 -巯基乙醇1mg/L、 吐 温-80 10mg/L、 氯化锰10 g/L、 亚锡酸钠10 g/L、 柠檬酸铁100 g/L、 硫酸锌100 g/L、 生物素 0.2mg/L、 叶酸3mg/L、 核黄素0.3mg/L、 维生素B12 0.8mg/L、 维生素C 0.8mg/L、 维生素E 0.8mg/L。 0052 实施例4 0053 实验组： 采用本发明实施例1的细胞培养基； 0054 对照组： 采用DMEM/F12+10血清的培养基。 0055 用上述实验组与对比组的培养基培养CHO细胞。
23、， 并对细胞的生长曲线、 蛋白产量和 抗体质量进行对比。 0056 图1为分别采用本发明的培养基与DMEM/F12+10FBS培养基培养CHO细胞生长曲 线对比图。 如图1所示， 实施例1与对照例1均在第四天活细胞密度达到峰值， 但实施例1的活 细胞密度相比于对照例1的活细胞密度高2106cells/mL， 且实施例1中的细胞活率维持也 明显优于对照例1； 0057 图2为分别采用本发明的培养基与DMEM/F12+10FBS培养基培养CHO细胞蛋白产 量对比图。 如图2所示， 实施例1中的蛋白产量为3.58g/L， 对照例1中的蛋白产量为2.81g/L， 实施例中的蛋白产量明显高于对照例； 0。
24、058 表1为分别采用本发明的培养基与DMEM/F12+10FBS培养基培养CHO细胞抗体质 量对比表； 0059 0060 如表1所示， 用体积排阻色谱(SEC)来表征蛋白质量， 实施例1的主峰面积明显高于 对照例1， 且与标准品的主峰面积相似， 高聚体(HMW)较标准品略高， 但都在可接受范围之 内。 低聚体(LMW)与标准品基本一致。 从蛋白质量来看， 实施例1中的蛋白质量较优。 0061 本发明的工艺参数(如温度、 时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法， 在此不一一列举实施例。 0062 本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。 0063 最后所应说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。 尽管参 照实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应该理解， 对本发明的技术方 案进行修改或者等同替换， 都不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明 的权利要求范围当中。 说明书 4/4 页 6 CN 108913646 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 108913646 A 7 。