技术领域
本发明涉及一种培育抗蚜烟草和小麦的方法和技术体系。
背景技术
蚜虫是一种重要的世界性农业害虫。世界范围内每年因蚜虫造成的直接经济损失数以亿计。蚜虫种类繁多，包括约10个科4400多种蚜虫，在植物整各个生育期都可造成危害。蚜虫取食作物不仅可造成严重减产而且还是许多病毒的传播载体。蚜虫通过口刺吸食植物营养，影响植株正常生长；分泌的蜜露影响植物光合；许多蚜虫还是植物病毒的传播者，如小麦黄矮病毒。在报道的300多种昆虫病毒传播介体中，170多种为蚜虫。其中，麦长管蚜和桃蚜是多种经济作物的主要害虫，对农业生产造成了重大的经济损失。据统计，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积可高达0.17亿公顷，占小麦总种植面积的62％。桃蚜是广食性害虫，寄主约有350多种，主要危害烟草、桃、李、梅、梨等果树和白菜、萝卜、辣椒、菠菜等蔬菜，造成了很大的经济损失。近年来，随着大量氮肥的使用及CO2浓度的升高，耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。目前蚜虫防治以喷洒农药为主，但过多使用农药不仅造成环境污染，而且易使蚜虫产生抗药性，另外农药的使用对蚜虫天敌也可造成危害。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育作物抗蚜新种质具有重要意义。
植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。RNAi现象其作用过程是双链RNA(dsRNA)进入生物体内，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA与RNA诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer识别，造成靶基因表达量的下降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗蚜烟草和小麦的方法和技术体系。
本发明首先保护一种制备抗蚜转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植物中特异基因或特异基因片段的表达，得到抗蚜转基因植物；所述特异基因为具有序列表的序列1所示核苷酸序列的基因；所述特异基因片段如序列表的序列1所示。
所述“抑制出发植物中特异基因或特异基因片段的表达”的实现方法如下：在所述出发植物中导入干扰载体或干扰片段。
所述干扰片段中具有干扰RNA的编码基因；所述干扰RNA的编码基因由片段甲、间隔序列和片段乙组成；所述片段甲如序列表的序列1所示；所述片段乙与所述片段甲反向互补。所述干扰RNA的编码基因具体如序列表的序列4第2161-2768位核苷酸所示。所述干扰片段自上游至下游依次包括：启动子、干扰RNA的编码基因和终止子。所述启动子具体可为Ubi启动子。所述终止子具体可为NOS终止子。所述干扰片段具体可如序列表的序列4中第67-3044位核苷酸所示。所述干扰片段具体可如序列表的序列4所示。
所述干扰载体中具有干扰RNA的编码基因；所述干扰RNA的编码基因由片段甲、间隔序列和片段乙组成；所述片段甲如序列表的序列1所示；所述片段乙与所述片段甲反向互补。所述干扰RNA的编码基因具体如序列表的序列3第626-1233位核苷酸位核苷酸所示。所述干扰载体中包括特异表达盒。所述特异表达盒自上游至下游依次包括：启动子、干扰RNA的编码基因和终止子。所述启动子具体可为35S启动子，所述终止子具体可为NOS终止子。所述特异表达盒具体如序列表的序列3所示。所述干扰载体具体为序列表的序列2所示的环形质粒。
所述抗蚜为抗蚜虫。所述蚜虫具体可为桃蚜或麦长管蚜。
所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述出发植物具体可为小麦(例如小麦品种科农199)或烟草(例如烟草W38)。
本发明还保护一种DNA分子(干扰片段)，具有干扰RNA的编码基因；所述干扰RNA的编码基因由片段甲、间隔序列和片段乙组成；所述片段甲如序列表的序列1所示；所述片段乙与所述片段甲反向互补。所述干扰RNA的编码基因具体如序列表的序列4第2161-2768位核苷酸所示。所述干扰片段自上游至下游依次包括：启动子、干扰RNA的编码基因和终止子。所述启动子具体可为Ubi启动子。所述终止子具体可为NOS终止子。所述干扰片段具体可如序列表的序列4中第67-3044位核苷酸所示。所述干扰片段具体可如序列表的序列4所示。
本发明还保护一种重组质粒(干扰载体)，具有干扰RNA的编码基因；所述干扰RNA的编码基因由片段甲、间隔序列和片段乙组成；所述片段甲如序列表的序列1所示；所述片段乙与所述片段甲反向互补。所述干扰RNA的编码基因具体如序列表的序列3第626-1233位核苷酸位核苷酸所示。所述干扰载体中包括特异表达盒。所述特异表达盒自上游至下游依次包括：启动子、干扰RNA的编码基因和终止子。所述启动子具体可为35S启动子，所述终止子具体可为NOS终止子。所述特异表达盒具体如序列表的序列3所示。所述干扰载体具体为序列表的序列2所示的环形质粒。
本发明还保护所述干扰片段或所述干扰载体在培育抗蚜转基因植物中的应用。所述抗蚜为抗蚜虫。所述蚜虫具体可为桃蚜或麦长管蚜。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物具体可为小麦(例如小麦品种科农199)或烟草(例如烟草W38)。
本发明还保护具有序列表的序列1所示核苷酸序列的基因。
本发明还保护所述基因编码的蛋白质。
本发明还保护一种用于培育抗蚜转基因植物的系统，包括所述干扰片段或所述干扰载体。所述抗蚜为抗蚜虫。所述蚜虫具体可为桃蚜或麦长管蚜。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物具体可为小麦(例如小麦品种科农199)或烟草(例如烟草W38)。
本发明的发明人从蚜虫肠道中分离出蚜虫特异的靶标基因22544，前期体外饲喂结果表明，它是一个较好的RNAi靶标基因。将靶标基因22544作为被抑制表达的对象，导入干扰片段或干扰载体，转基因烟草和转基因小麦均表现出良好的抗蚜表型。本发明为挖掘和鉴定新型抗蚜基因,并通过植物介导的RNAi基因工程育种提高烟草、小麦等农作物的抗蚜特性提供了参考。本发明对于培育抗蚜转基因作物具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为实施例2中PCR鉴定结果。
图2为实施例2中Southern杂交鉴定的结果。
图3为实施例2中Northern杂交鉴定的结果。
图4为实施例2中死亡率的结果。
图5为实施例2中同一蚜虫的两个后代的照片。
图6为实施例2中蚜虫发育每一龄期的历经时间及世代历期的结果。
图7为实施例2中成蚜寿命、产蚜期、生活时长、日均产蚜量和总产蚜量的结果。
图8为实施例2中桃蚜中靶序列的相对表达水平的结果。
图9为实施例3中成蚜寿命、产蚜期、生活时长的结果。
图10为实施例3中日均产蚜量和总产蚜量的结果。
图11为实施例3中死亡率的结果。
图12为实施例3中蚜虫发育每一龄期的历经时间以及若蚜期、产蚜前期、历期的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
1龄若蚜期：从出生一刻开始到褪掉第一层皮为止的时间段。2龄若蚜期：从褪掉第一层皮开始到褪掉第二层皮为止的时间段。3龄若蚜期：从褪掉第二层皮开始到褪掉第三层皮为止的时间段。4龄若蚜期：从褪掉第三层皮开始到褪掉第四层皮为止的时间段。若蚜期：从出生一刻开始到褪掉第四层皮为止的时间段。产蚜前期：从褪掉第四层皮开始到产生第一只子蚜之前的时间段。历期：蚜虫从出生到产生第一只子蚜的时间段。生活时长：蚜虫从出生到死亡的时间段。日均产蚜量：蚜虫在开始生第一个蚜虫到生最后一个蚜虫期间的日均产蚜量。总产蚜量：蚜虫整个生命过程中产蚜总数。
根癌农杆菌AGL1：Y.He,H.D.Jones,S.Chen,X.M.Chen,D.W.Wang,K.X.Li,D.S.Wang and L.Q.Xia Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency.Journal of Experimental Botany,Vol.61,No.6,pp.1567–1581,2010。
桃蚜，Myzus persicae(Sulzer)：Christiaens O.,Swevers L.,Smagghe G.DsRNA degradation in the pea aphid(Acyrthosiphon pisum)associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay.Peptides,2014,53:307-314.。
麦长管蚜，Sitobion avenae(Fabricius)：Abdellatef E.,Will T.,Koch A.,Imani J.,Vilcinskas A.,Kogel K.H.Silencing the expression of the salivary sheath protein causes transgenerational feeding suppression in the aphid Sitobion avenae.Plant Biotechnology Journal,2015,13:849-857.。
烟草W38(Nicotiana tabacum L.cv W38)：Yu X.D.,Zhang Y.J.,Ma Y.Z.,Xu Z.S.,Wang G.P.,Xia L.Q.Expression of an(E)-β-farnesene synthase gene from Asian peppermint in tobacco affected aphid infestation.The Crop Journal,2013,1:50-60.。
小麦品种科农199(Kenong199)：闵东红,何莎,张彦,夏兰琴.基因枪转化小麦主要轰击参数的优化.作物学报,2013,1:60-67。
实施例1、基因片段的发现以及干扰载体/干扰片段的构建
一、功能蛋白及其编码基因的发现
从麦长管蚜中发现一个新蛋白，将其命名为蛋白甲。从桃蚜中发现一个新蛋白，将其命名为蛋白乙。蛋白甲的编码基因和蛋白乙的编码基因中均具有序列表的序列1所述的基因片段。
二、干扰载体和干扰片段的构建
构建重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544(干扰载体)。经测序，重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544为序列表的序列2所示的环形质粒。重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544中具有序列表的序列3所示的表达盒。序列表的序列3中，第1-543位核苷酸为35S启动子，第626-1233位核苷酸为干扰RNA的编码基因(第626-862位核苷酸为DNA片段甲，第997-1233位核苷酸为DNA片段乙，DNA片段甲和DNA片段乙之间为间隔序列，DNA片段甲和DNA片段乙反向互补)，第1251-1509位核苷酸为NOS终止子。
制备双链的DNA分子Ubi-22544-NOS(干扰片段)。DNA分子Ubi-22544-NOS如序列表的序列4所示。序列表的序列4中，第67-2078位核苷酸为Ubi启动子，第2161-2768位核苷酸为干扰RNA的编码基因(第2161-2397位核苷酸为DNA片段甲，第2532-2768位核苷酸为DNA片段乙，DNA片段甲和DNA片段乙之间为间隔序列，DNA片段甲和DNA片段乙反向互补)，第2786-3044位核苷酸为NOS终止子。
实施例2、转基因烟草的制备和鉴定
一、转基因烟草的制备
1、将重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌。用LB培养基悬浮重组农杆菌，得到OD600nm＝1.0的农杆菌菌液。
2、取烟草W38种子，用70％酒精水溶液灭菌1min，然后用消毒液消毒20min，然后用无菌水漂洗5次，然后置于MS固体培养基上培养至植株长出4-5片叶子。
消毒液：含10％(体积百分含量)NaClO和0.05％(体积百分含量)tween-20的水溶液。
3、完成步骤2后，剪取植株的新鲜叶子，用70％乙醇水溶液漂洗1min，然后用10％(体积百分含量)NaClO水溶液消毒10min，切除叶脉和叶片边缘，剩余部分用打孔器打孔，得到直径1cm2大小的圆片，即为外植体。
4、取步骤3得到的外植体，近轴面向上置于预培养培养基上，光照培养2天。
预培养培养基：含0.1mg L-1IAA和1mg L-1 6-BA的MS固体培养基。
5、完成步骤4后，取外植体，浸泡于步骤1得到的农杆菌菌液中，轻轻晃动，侵染3-5min。
6、完成步骤5后，取外植体，用滤纸吸除残留菌液，然后置于预培养培养基上，避光培养2天。
7、完成步骤6后，取外植体，置于诱导培养基上进行光暗交替培养(光照16小时/黑暗8小时)，直至芽长为1-2cm。
诱导培养基：含0.1mg L-1IAA、1mg L-1 6-BA、160mg-1Timentin、100mg L-1Kan的MS固体培养基。
8、完成步骤7后，转移到生根培养基上培养至生根，获得再生植株(T0代)。
生根培养基：含100mg L-1Kan的MS固体培养基。
二、分子鉴定
1、PCR鉴定
提取T0代再生植株的基因组DNA，采用22544F和22544R组成的引物对(靶序列为576bp)进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。采用重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544作为再生植株的基因组DNA的阳性对照。采用烟草W38的基因组DNA作为再生植株的基因组DNA的阴性对照。
22544F：5’-TTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTT-3’；
22544R：5’-TGTGAAACGGTGCATTATGATGGTGA-3’。
PCR鉴定结果见图1。图1中：M：100bp DNA Ladder；1：阳性对照；2：阴性对照；3-6：不同的再生植株。结果表明：泳道3对应的再生植株PCR鉴定为阴性，为非转基因植株；泳道4至6对应的再生植株PCR鉴定为阳性，为转基因植株。
2、Southern杂交
取T0代转基因植株，提取基因组DNA，用限制性内切酶Sac I进行单酶切后进行Southern杂交。Southern杂交的探针的制备方法：以重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544为模板，用P22544F和P22544R组成的引物对(靶序列为459bp)进行PCR扩增，然后取PCR扩增产物，用地高辛标记。采用重组质粒RNAi pBI 121-p35S-22544作为转基因植株的基因组DNA的阳性对照。采用烟草W38的基因组DNA作为转基因植株的基因组DNA的阴性对照。
P22544F:5′-ACCGTTTTTCATCATACGACCGCAT-3′；
P22544R:5′-CCATGCCATTGTGCAGCTTACCTG-3′。
Southern杂交鉴定结果见图2。图2中：P：阳性对照；CK：阴性对照；8：Tob8植株；11：Tob11植株；63：Tob63植株。结果表明，Tob8植株、Tob11植株和Tob63植株中导入的外源片段的拷贝数依次为3个拷贝、4个拷贝和3个拷贝，外源片段在植物基因组中成功整合。
3、获得纯合转基因株系
将T0代转基因植株自交获得后代，即为T1代植株。将T1代植株自交获得后代，即为T2代植株。将T2代植株自交获得后代，即为T3代植株。分别对各个T1代植株、T2代植株以及随机抽样的T3代植株进行PCR鉴定，方法同步骤1。
对于某一T0代转基因植株来说，如果该植株的所有T1代、T2代、T3代植株均为PCR鉴定阳性，该植株及其后代可视为一个纯合的转基因株系。
得到了三个纯合的转基因株系：Tob8株系、Tob11株系和Tob63株系。
4、Northern杂交
待测植株为：Tob8株系的T2代植株、Tob11株系的T2代植株、Tob63株系的T2代植株。提取待测植株的mRNA，进行Northern杂交。Northern杂交的探针的制备方法：以重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544为模板，用22544T7F和22544probeR组成的引物对(靶序列为256bp)进行PCR扩增，然后取PCR扩增产物进行体外反转录，然后用进行地高辛标记。采用烟草W38的mRNA作为转基因植株的mRNA的阴性对照。采用U6、28s rRNA和18s rRNA为内参。
22544T7F：5′-TAATACGACTCACTATAGGAATCCATCTACTTGGATAAATCTCG-3′；
22544probeR：5′-CTCAAGCAGACTCAGGCCCCTCGTG-3′。
22544T7F中，下划线标注T7启动子序列。
Northern杂交的结果见图3。图3中：CK：阴性对照；8：Tob8株系；11：Tob11株系；63：Tob63株系。结果表明：外源片段在转基因植株的转录水平有表达。
三、转空载体烟草的制备
与重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544相比，空载体的差异仅在于缺少了序列表的序列3中第626-1233位核苷酸。将空载体代替重组质粒RNAi pBI 121-p35S-22544，依次按照步骤一并参照步骤二进行操作，得到转空载体株系。
四、抗蚜效果鉴定
待测植株为：W38烟草(野生型)、转空载体株系的T2代植株、株系Tob8的T2代植株、株系Tob11的T2代植株、株系Tob63的T2代植株。
取1龄若蚜期的桃蚜，接种到待测植株上，19℃-22℃培养，每日观察记录蚜虫的存活情况，在观察到蜕皮发育和产蚜时，将蜕皮和若蚜小心的从叶片上移除。每个株系设置3组生物学重复，每植株上至少接种20只蚜虫作为技术重复。
从接种桃蚜开始计天数，每3天统计死亡率，培养至第18天的死亡率结果见图4。培养18天后，株系Tob8植株上蚜虫的死亡率平均为88％，株系Tob11植株上蚜虫的死亡率平均为65％，株系Tob63植株上蚜虫的死亡率平均为79％，野生型植株上蚜虫的死亡率平均为10％。
观察蚜虫及其后代的生长发育状况。转基因株系植株上一些新生蚜虫出现发育不正常现象，正常新生蚜虫会在出生后出于本能将蜷缩在一起的肢体展开，然后开始自由取食活动，但畸形发育的蚜虫似丧失了肢体展开的能力，最终蜷缩死亡。同一蚜虫的两个后代的照片见图5，其中1个后代正常发育，另一个后代畸形发育(无法展开肢体，最终虫体颜色变黄变暗，蜷缩死亡)。
从接种桃蚜开始计天数，统计蚜虫发育每一龄期的历经时间及世代历期，结果见图6。野生型植株上的蚜虫与各转基因株系植株上的蚜虫之间无显著性差异，说明在植株中导入重组质粒RNAi pBI121-p35S-22544，没有影响到蚜虫的发育历程。
从接种桃蚜开始计天数，统计蚜虫的成蚜寿命、产蚜期、生活时长、日均产蚜量和总产蚜量，结果见图7。与野生型植株上的蚜虫相比，转基因植株上的蚜虫日均产蚜量显著降低，总产蚜量显著降低，成蚜寿命显著缩短，产蚜期显著缩短，生活时长显著减少，使蚜虫种群数量明显降低。计算种群的平均世代历期(T)、内禀增长率(rm)、增殖率极限(λ)及净生殖率(R0)指数，以此进行个体数的估算和死亡因子的确定。净生殖率：R0＝∑Lx·mx。平均世代周期：T＝∑x·Lx·mx/R0。内稟增长率：rm＝LnR0/T。增殖率极限：λ＝erm。种群加倍时间：t＝Ln2/rm。x为代表性年龄(d)，Lx为x期的存活率，mx为每雌产雌数。结果见表1。实验数据显示：与野生型植株上的蚜虫相比，转基因株系上的蚜虫的内禀增长率、增殖率极限、种群加倍时间均无显著性差异,说明当排除其他物种，在任一特定的温度、湿度、实物质量等的组合下，所有株系上的测试蚜虫均有同等的最大增长率及增长潜能；与野生型植株上的蚜虫相比，转基因株系上的蚜虫的净生殖率和平均世代周期显著减小。
转空载体植株的各个结果数据，均与野生型植株无显著差异。
表1
野生型植株上的蚜虫 株系Tob8植株上的蚜虫 株系Tob11植株上的蚜虫 株系Tob63植株上的蚜虫 R0 36.59±0.33 7.02±0.39** 10.99±0.46** 11.14±0.28** rm(d-1) 0.17±0.03 0.12±0.04 0.15±0.01 0.16±0.01 λ(d-1) 1.18±0.04 1.13±0.04 1.16±0.02 1.17±0.01 T(d) 18.01±0.03 14.49±0.19** 15.41±0.37** 15.30±0.06** t(d) 4.71±0.24 7.37±0.27* 4.73±0.57 4.50±0.33
五、干扰RNA对靶序列的沉默效果
待测植株为：W38烟草(野生型)、株系Tob8的T2代植株、株系Tob11的T2代植株、株系Tob63的T2代植株。
取1龄桃蚜，接种到待测植株上，19℃-22℃培养，在观察到蜕皮发育和产蚜时，将蜕皮和若蚜小心的从叶片上移除。每个株系设置3组生物学重复，每植株上至少接种20只蚜虫作为技术重复。
从接种桃蚜开始计天数，每3天取蚜虫样本，提取总RNA并反转录为cDNA,采用My22544F和My22544R组成的引物对进行qRT-PCR，检测干扰RNA的靶序列的表达水平。内参基因为桃蚜Actin基因，ActinF和ActinR组成用于鉴定内参基因的引物对。
My22544F：5′-ACGTACCCGACTGTTTGGAA-3′；
My22544R:5′-GTGGTTCAGGCTCACAACGA-3′。
ActinF：5′-CGGTTCAAAAACCCAAACCAG-3′；
ActinR：5′-TGGTGATGATTCCCGTGTTC-3′。
桃蚜中靶序列的相对表达水平见图8。培养6天后，与野生型植株上的蚜虫相比，转基因植株上的蚜虫中的靶基因的相对表达水平下降,达到极显著水平。第12天时，转基因植株上的蚜虫中的靶基因几乎完全被沉默。
野生型植株上的蚜虫：培养6天后，蚜虫中的靶基因的表达量最高；培养9天后，蚜虫基本发育为4龄若蚜或成蚜前期，靶基因的表达量回落；培养12天后，蚜虫发育为成蚜，靶基因的表达量再次升高。转基因植株上的蚜虫：培养3天后，靶基因的表达量开始低于野生型植株上的蚜虫；培养6天后，靶基因的表达量低于野生型植株上的蚜虫，差异极显著；培养9天后和培养12天后，靶基因的表达量均显著低于野生型植株上的蚜虫。
实施例3、转基因小麦的制备和鉴定
一、转基因小麦的制备
1、取小麦品种科农199授粉后第14天的幼胚，作为外植体接种于诱导培养基，22-25℃条件下暗培养1-2天。
诱导培养基：MS+1mg/L VB1+150mg/L ASP+2mg/L 2,4-D。
2、取DNA分子Ubi-22544-NOS，采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪对完成步骤1的外植体进行轰击(Psi1100，27.5cm Hg柱)，然后将外植体转移到新的诱导培养基上，22-25℃黑暗培养2-3周。
3、完成步骤2后，取所述外植体，依次进行再生、筛选和壮苗，得到T0代再生植株。
二、分子鉴定
1、PCR鉴定
提取T0代再生植株的基因组DNA，分别采用UbiF和AdhR组成的引物对甲和AdhF和NosR组成的引物对乙进行PCR扩增，如果采用引物对甲得到524bp的扩增产物且采用引物对乙得到541bp的扩增产物，PCR鉴定为阳性。
UbiF：5’-TTTAGCCCTGCCTTCATACG-3’；
AdhR：5’-CAGATAAGCCGCCAAGAAGG-3’。
AdhF：5’-CCAAGGTATCTAATCAGCCATCC-3’；
NosR：5’-TATAATTGCGGGACTCTAATC-3’。
2、获得纯合转基因株系
将T0代转基因植株自交获得后代，即为T1代植株。将T1代植株自交获得后代，即为T2代植株。将T2代植株自交获得后代，即为T3代植株。分别对各个T1代植株、T2代植株以及随机抽样的T3代植株进行PCR鉴定，方法同步骤1。
对于某一T0代转基因植株来说，如果该植株的所有T1代、T2代、T3代植株均为PCR鉴定阳性，该植株及其后代可视为一个纯合的转基因株系。
得到了三个纯合的转基因株系：234-1株系、297-3株系和309-8株系。
三、抗蚜效果鉴定
待测植株为：小麦品种科农199(野生型)、234-1株系的T3代植株、297-3株系的T3代植株、309-8株系的T3代植株。
取待测植株，用正立方体生态盒(2.5×2.5×2.5cm)将叶片其夹住，接种24h内的麦长管蚜初产若蚜(接种量为15只/株)，进行培养。培养条件为：18-20℃光照16小时(400W钠灯，光强为750μEs-1m-2)/10-14℃黑暗8小时，湿度为50-70％。从接种开始，每天观察两次，记载麦长管蚜的生长发育情况(期间随时移去蚜蜕、仔蚜和死蚜，直到成蚜死亡为止)。每个株系设置2-10组生物学重复。
根据调查结果，统计麦长管蚜的如下生物学参数：死亡率(致死率)、各龄若虫的发育历期、若蚜期、产蚜前期、历期、成蚜寿命、产蚜期(产蚜时长)、生活时长、日均产蚜量和总产蚜量。
成蚜寿命、产蚜期、生活时长的结果见图9。日均产蚜量和总产蚜量的结果见图10。死亡率的结果见图11。各龄若虫的发育历期、若蚜期、产蚜前期、历期的结果见图12。与野生型小麦相比，转基因小麦株系上的蚜虫的死亡率显著增高，日均产蚜量和总产蚜量显著降低，若蚜期、历期、产蚜期和生活时长显著缩短，产蚜前期显著延长。结果表明，转基因小麦具有明显的抗蚜结果。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种培育抗蚜烟草和小麦的方法和技术体系
<130> GNCYX171816
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 237
<212> DNA
<213> Sitobion avenae
<400> 1
aatccatcta cttggataaa tctcgttgca cccatgccat tgtgcagctt acctgaagtg 60
ttaccagtat ctctcacaaa tcgaatcgac ccgcacgact gtcgtgatga atggttcaac 120
cgtttttcat catacgaccg catgattcgc gtcaccatca taatgcaccg tttcacaaac 180
cggtgccgtc gttgcaatct ggaaccactt cccacgaggg gcctgagtct gcttgag 237
<210> 2
<211> 9884
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctcc 60
gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 120
cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat 180
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aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg aattcactgg 3120
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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