优先权信息
本申请请求2016年12月19日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为CN201611177147.3的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及分子标记及其应用。
背景技术
镉(Cd)被视为最具毒性的环境污染物之一。土壤中的Cd一方面来源于矿质风化、铁锰共沉、大气干湿沉降等自然条件，另一方面来源于化肥、农药和土壤改良剂的施用及污水灌溉等人为因素[1]。据不完全统计，我国农田重金属Cd、Pb污染面积达2万公顷，而我国每年生产的Cd含量超标农产品达14.6亿kg，且呈现递增的趋势[2]。土壤-作物-食物间的迁移分配是土壤重金属影响人体健康的主要途径之一[3-5]。水稻是我国主要的粮食作物，全国60％以上的人口以稻米为主食。因此，水稻生产的安全关系到我国整个粮食安全的大环境。
多年来，国内外专家主要针对水稻不同器官对重金属富集的特征以及不同水稻品种对Cd富集能力差异等方面进行了大量的研究。Morishita等[6]研究发现，粳稻、籼稻、爪洼稻、杂交稻体内Cd含量为2—73μg·kg-1，其中籼稻和杂交稻对Cd的吸收积累较其它两种类型有明显优势。当土壤Cd浓度为100mg·kg-1，水稻不同品种茎叶内浓度变化范围是24—140mg·kg-1，积累量变化范围为1—14mg·pot-1[7]。基于部分水稻品种对Cd的吸收和积累能力较强，国外学者开始利用Cd富集水稻品种进行Cd污染农田修复。莫争等[8]认为水稻不同器官对土壤重金属Cd和Pb吸收规律为根＞茎叶＞籽粒。龚伟群等[9]研究表明，杂交水稻对外源Cd的吸收及其在籽粒中的富集受土壤类型的影响大于品种基因型。
同时，科研工作者对水稻镉富集能力的研究中发现，部分水稻品种在镉污染的土壤中生长，其籽粒中镉富集指标在安全范围内，也就是说，部分品种即使在镉污染的土壤中依然能够生产出安全的稻谷，我们定义此性状为拒镉性状，这种性状是由基因控制的。而国内外对此方面的研究极少，如果能够定位出与拒镉性状相关的基因，并开发与之紧密连锁的DNA分子标记，则可以利用分子标记辅助育种技术，指导水稻选育工作，大大提高拒镉水稻的选育水平以及选育效率，对水稻粮食安全方面意义重大。但是，现阶段与拒镉相关的基因以及与基因紧密连锁的DNA分子标记，仍有待挖掘。
参考文献：
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发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种与水稻拒镉性状相关，能够有效用于水稻选育的分子标记。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种水稻拒镉性状相关的分子标记。根据本发明的实施例，所述分子标记表现为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。根据本发明的实施例，SEQ ID NO：3所示核苷酸序列如下(43bp)：
TAACTATACCATTAAAACCCTATATTTGTGATATTTTAAGGCG(SEQ ID NO：3)。
根据本发明的实施例，具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列且在所述分子标记位点纯合的个体，表现为具有拒镉性状；缺失SEQ ID NO：3所示核苷酸序列且在所述分子标记位点纯合的个体，表现为不具有拒镉性状；具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列且在所述分子标记位点杂合的个体，表现为具有拒镉性状。
发明人发现，通过检测水稻基因组DNA是否具有上述分子标记，能够有效地确定其拒镉性状。具体地，如前所述，具有所述分子标记且在所述分子标记位点纯合的水稻种子不具有拒镉性状，不具有该分子标记且在所述分子标记位点纯合的水稻种子具有拒镉性状，具有该分子标记且在所述分子标记位点杂合的水稻种子具有拒镉性状，从而，检测到待测水稻不具有该分子标记时，则能够确定其种子具有拒镉性状；而当检测到待测水稻具有该分子标记且在该分子标记位点纯合时，则能够确定其种子不具有拒镉性状；而当检测到待测水稻具有该分子标记且在该分子标记位点杂合时，则能够确定其种子具有拒镉性状。进一步，当采用针对该分子标记的特异性引物对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，通过目的条带的条数和长度，能够有效地确定待测水稻的拒镉性状，具体地，当目的条带为一条，且所述目的条带长约450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状；当目的条带为一条，且所述目的条带长约500bp时，可以确定所述待测水稻不具有拒镉性状；当目的条带为两条，且所述目的条带的长度分别为500bp和450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状。由此，发明人确定，本发明的分子标记与水稻的拒镉性状紧密相关，能够有效用于水稻拒镉性状基因定位、水稻拒镉性状检测以及水稻的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种中对拒镉性状的需求，对水稻育种材料进行早期选择，进一步有效提高育种的效率和准确性，提高水稻繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出水稻优良品种。例如，利用该分子标记的特异性引物对待测水稻植株进行扩增、凝胶电泳，选择扩增产物目的条带为一条且长约450bp的水稻，即可容易地筛选获得具有拒镉性状的水稻植株，从而可以直接应用于分子育种实践。
此外，根据本发明的一些实施例，利用本发明的分子标记进行水稻分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的本发明的分子标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物对具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列。具体地，本发明的引物对的序列如下所示：
5’-GCAAGATGGAGGAATGGTTT-3’(SEQ ID NO：1)；
5’-AATGTGCTGCCATTCAAGCT-3’(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的实施例，利用所述引物对对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增片段的长度，当所述扩增片段长约450bp时，所述待测水稻缺失SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的插入，表现为具有拒镉性状；当所述扩增片段长约500bp时，所述待测水稻具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，表现为不具有拒镉性状；当所述扩增片段为500bp和450bp两种时，所述待测水稻的所述分子标记位点杂合，表现为具有拒镉性状。
根据本发明的实施例，利用凝胶电泳优选琼脂糖凝胶电泳，检测所述扩增片段的长度。
发明人惊奇地发现，利用本发明的引物对能够有效地对待测水稻的上述与拒镉性状相关的分子标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序或电泳能够有效实现对该分子标记的检测，确定待测水稻是否具有该分子标记。例如，通过电泳检测时，根据扩增产物目的条带的数量和长度，即能够有效确定待测水稻的拒镉性状。具体地，利用上述引物对，对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，当目的条带为一条，且所述目的条带长约500bp时，可以确定所述待测水稻不具有拒镉性状；当目的条带为一条，且所述目的条带长约450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状；当目的条带为两条，且所述目的条带的长度分别为500bp和450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状。而450bp的扩增产物与500bp的扩增产物相比缺失的序列即为本发明的分子标记(缺失序列的具体长度为43bp，在本文中，有时将该分子标记称之为“R112741”)，因而本发明的分子标记序列位于500bp的扩增产物中。由此，用于检测前面所述的本发明的分子标记的引物对，能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。
需要说明的是，本领域技术人员熟知，在上述SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～10个碱基，所增加的碱基类型可根据水稻基因组DNA上与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：2的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的5’端或3’端分别增加1～10个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。
根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的分子标记的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的分子标记的引物对。即本发明的试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测水稻的上述与拒镉性状相关的分子标记的检测，确定待测水稻是否具有该分子标记，进而能够有效确定待测水稻的拒镉性状。具体地，例如利用上述引物对对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，当目的条带为一条，且所述目的条带长约500bp时，可以确定所述待测水稻不具有拒镉性状；当目的条带为一条，且所述目的条带长约450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状；当目的条带为两条，且所述目的条带的长度分别为约500bp和450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的分子标记的试剂盒，能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。
根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种检测前面所述的分子标记的方法。根据本发明的实施例，利用前面所述的引物对或者试剂盒，对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增并判断扩增产物中是否存在该分子标记。由此，能够有效实现对待测水稻的上述与拒镉性状相关的分子标记的检测，确定待测水稻是否具有该分子标记，进而能够有效确定待测水稻的拒镉性状。
根据本发明的第五方面，本发明还提供了前面所述的分子标记、引物对或者试剂盒，在水稻拒镉性状基因定位、水稻拒镉性状检测或者水稻辅助育种中的用途。基于该分子标记与拒镉性状紧密连锁，则将该分子标记与其他与拒镉性状紧密连锁的分子标记联合应用，可以实现水稻拒镉性状相关基因的定位，也即该分子标记能够有效用于水稻拒镉性状基因定位；如前所述，基于本发明的分子标记与拒镉性状紧密连锁，对待测水稻进行该分子标记的检测，甚至直接利上述引物对或者包含该引物对的试剂盒检测待测水稻是否具有该分子标记，能够有效确定待测水稻的拒镉性状，实现对水稻拒镉性状的检测，进一步，能够根据实际水稻育种中对拒镉性状的需求，对水稻育种材料进行早期选择，进一步有效提高育种的效率和准确性，提高水稻繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出水稻优良品种。例如，当育种需要具有拒镉性状的水稻时，通过检测待测水稻种子是否具有该分子标记，即可容易地筛选出不具有该分子标记也即具有拒镉性状的水稻种子作为育种材料。
根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种水稻拒镉性状基因定位的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使用前面所述的分子标记的步骤。基于该分子标记与拒镉性状紧密连锁，将该分子标记与其他与拒镉性状紧密连锁的分子标记联合应用，可以实现水稻拒镉性状相关基因的定位，也即该分子标记能够有效用于水稻拒镉性状基因定位。具体地，例如在水稻拒镉性状相关基因的定位过程中，基于本发明与拒镉性状紧密连锁，使用本发明的分子标记的位置信息，再结合多个其他与拒镉性状紧密连锁的分子标记的位置信息，即可实现对拒镉性状相关基因的定位。
根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种检测水稻拒镉性状的方法。根据本发明的实施例，该方法对待测水稻进行前面所述的分子标记的检测，以便确定待测水稻的拒镉性状。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与水稻拒镉性状相关的分子标记的试剂，例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测水稻的基因组DNA进行PCR扩增、凝胶电泳，从而根据扩增产物目的条带的数量和长度，能够有效确定待测水稻的拒镉性状。其中，如前所述，利用上述引物对或试剂盒，对待测水稻植株进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，当目的条带为一条，且所述目的条带长约500bp时，可以确定所述待测水稻不具有拒镉性状；当目的条带为一条，且所述目的条带长约450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状；当目的条带为两条，且所述目的条带的长度分别为约500bp和450bp时，可以确定所述待测水稻具有拒镉性状。由此，本发明的检测水稻拒镉性状的方法，能够快速、高效、准确地检测水稻拒镉性状，进而能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。
另外，根据本发明上述实施例的检测水稻拒镉性状的方法还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，本发明的检测水稻拒镉性状的方法进一步包括：利用前面所述的引物对，或者试剂盒，对所述待测水稻基因组DNA进行PCR扩增；检测扩增片段的长度；以及基于所述扩增片段的长度，确定所述待测水稻的拒镉性状，其中，当所述扩增片段长约450bp时，所述待测水稻为具有拒镉性状；当所述扩增片段长约500bp时，所述待测水稻为不具有拒镉性状；当所述扩增片段为500bp和450bp两种时，所述待测水稻的所述分子标记位点杂合，具有拒镉性状。由此，能够高效准确的检测待测水稻是否具有本发明的分子标记，进而能够有效地基于检测结果确定待测水稻的拒镉性状。
根据本发明的实施例，提取获得待测水稻的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)抽提待测水稻的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。
根据本发明的实施例，利用凝胶电泳优选琼脂糖凝胶电泳，检测所述扩增片段的长度。由此，方便快捷。
发明人发现，本发明的检测水稻拒镉性状的方法能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。
根据本发明的第八方面，本发明还提供了一种水稻辅助育种方法。根据本发明的实施例，该方法包括检测前面所述的分子标记的步骤。如前所述，本发明的分子标记与拒镉性状紧密连锁，因而，检测待测水稻是否具有该分子标记，能够有效确定待测水稻的拒镉性状，进一步，能够根据实际水稻育种中对拒镉性状的需求，对水稻育种材料进行早期选择。例如，当育种需要具有拒镉性状的水稻时，通过检测待测水稻种子是否具有该分子标记，即可容易地筛选出不具有该分子标记也即具有拒镉性状的水稻种子作为育种材料，从而能够有效提高育种的效率和准确性，提高水稻繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出水稻优良品种。
根据本发明的实施例，利用前面所述的引物对或者试剂盒，进行所述检测，
根据本发明的实施例，该方法包括通过前面所述的检测水稻拒镉性状的方法，检测所述分子标记，以便确定所述待测水稻的拒镉性状。由此，利用本发明的水稻辅助育种方法，能够有效确定水稻的拒镉性状，进而能够实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。
需要说明的是，本发明的与水稻拒镉性状相关的分子标记及其应用具有如下优点：
(1)本发明提供的水稻拒镉性状相关的分子标记不受水稻的生长阶段的限制，可用于水稻的早期选育，可显著促进水稻的育种进程；
(2)检测水稻如SEQ ID NO：3所示的水稻拒镉性状相关的分子标记的方法，准确可靠，操作方便；
(3)水稻如SEQ ID NO：3所示的水稻拒镉性状相关的分子标记的检测，为水稻生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
根据本发明的一些实施例，从另一方面来说：
本发明提供了一种与水稻拒镉性状基因紧密连锁的分子标记R112741。
本发明所提供的一种扩增与水稻拒镉性状基因紧密连锁的分子标记的引物对，其引物1含有SEQ ID NO：1所示序列，引物2含有SEQ ID NO：2所示序列；优选地，引物1为SEQ ID NO：1所示序列，引物2为SEQ ID NO：2所示序列。
本发明还提供了另一种与水稻拒镉性状基因紧密连锁的分子标记，其是由上述引物对具有拒镉性状的水稻基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
本发明所提供的一种水稻拒镉性状基因定位的方法，其包括使用上述任一种分子标记或者上述引物对的步骤。
本发明所提供的上述分子标记的检测方法，其包括步骤：根据上述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。
进一步地，上述检测方法中的引物为上述引物对。
本发明还提供了上述分子标记或者上述引物对在水稻辅助育种或者水稻拒镉性状基因定位或检测中的用途。
本发明所提供的一种水稻辅助育种方法，其包括检测上述分子标记或者用上述引物对进行检测的步骤。
本发明所提供的一种筛选上述分子标记的方法，其包括以下步骤：
(1)获得纯合型父本、母本基因组；
(2)分别通过测序获得父本、母本基因组序列；
(3)比较父本、母本基因组序列，获得差异位点；
(4)构建遗传群体并收集表型数据；
(5)对群体中的个体进行基因型分析；
(6)结合基因型和表型数据，将水稻拒镉性状基因定位在基因组上；
(7)在靠近目标基因的区段选择候选的分子标记。
并且，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了基因工程技术领域的与水稻拒镉性状相关基因紧密连锁的分子标记及其扩增引物，将基因组DNA序列与水稻拒镉性状基因联系起来，更有利于水稻分子标记辅助育种体系的建立；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于水稻拒镉性状改良育种实践，以便缩短水稻新品种育种周期，加快育种进程。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，利用具有SEQ ID NO：1-2所示核苷酸序列的引物对亲本和杂交F1代的DNA进行PCR扩增的扩增产物的电泳检测结果图；
图2显示了根据本发明一个实施例，利用具有SEQ ID NO：1-2所示核苷酸序列的引物对F2代水稻植株的DNA进行PCR扩增的部分扩增产物的电泳检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1：水稻F2代分离群体的构建以及F2代籽粒镉含量表型数据采集
父本为籼型常规稻品种9311，在镉土壤背景值为4.3mg/kg的镉污染土壤中种植，其籽粒中镉含量超过0.8mg/kg，远远大于国家标准0.2mg/kg，为籽粒镉高积累品种，不具有拒镉性状。
母本为籼型光温敏不育系KT-27S，该品种属籼型两用核不育系。在镉土壤背景值为4.3mg/kg的镉污染土壤中种植，其籽粒中镉含量为0.073mg/kg，低于国家标准0.2mg/kg，为籽粒镉低积累品种，具有拒镉性状。
父本和母本杂交得到F1，F1代自交产生F2代群体，共237个单株。将F2群体种植在在镉土壤背景值为4.3mg/kg的镉污染土壤中，待结实后测定F2代中每个个体的籽粒镉含量，获得表型数据。
根据表型鉴定结果，计算分离比，使用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，使用SPSS17.0对结果进行卡方检测。
性状调查结果：在237个F2后代中，其中175个个体种子中镉含量低于0.1mg/kg，低于国家标准0.2mg/mg，具有拒镉性状；另外62个个体种子中镉含量高于0.8mg/kg，远远高于国家标准，不具有拒镉性状。
卡方检测表明，拒镉性状的分离比约为3:1，符合孟德尔的一对基因的分离规律。因此，拒镉性状为显性单基因控制的质量性状。
实施例2：基因组DNA的提取
用改良的CTAB法分别提取针对实施例1中的父母本、F1代、以及F2代个体的基因组DNA，具体方法如下：
1)取样：取幼嫩的叶片1g左右，置于2ml离心管中。
2)样品冷冻抽干：取好的样品家研磨珠，打开管盖放入真空冷冻抽干机，-50℃条件下持续冷冻抽干12小时以上(一般冷冻抽干过夜)。
3)样品研磨：将冷冻抽干的样品置于高通量机械研磨仪中，启动程序研磨，将样品粉碎。机械研磨仪程序运行需5分钟，通量为96份样品/5分钟。
4)样品研磨充分后，在管内加入65℃预热1h的CTAB提取液，混匀，65℃水浴40分钟，期间每隔5分钟颠倒混匀一次。
5)将水浴后的样品从水浴锅内拿出，冷却至室温后，加入与CTAB等体积的氯仿(三氯甲烷/异戊醇按照24:1比例混合)，轻轻混匀10分钟，至下层液体变为深绿色。(本步骤需在通风厨内操作)
6)混匀后将离心管转入高速离心机内离心，转速12000rpm，离心15分钟。离心后样品上层为清夜。
7)抽取适量的上清液于1.5ml离心管中，并加等体积的异丙醇，轻轻混匀(此时可以看到有絮状沉淀析出)，然后将样品置于-20℃的冰柜30分钟，以沉淀DNA。
8)样品冷冻30分钟后转移至高速离心机内离心，转速12000rmp，离心10分钟。
9)弃掉清夜，DNA沉淀用75％乙醇洗涤2次，洗涤后将乙醇倒掉，敞开管口放置于通风厨内晾干。
10)待乙醇完全挥发后，加入50微升TE缓冲液(加RNA酶)溶解DNA，并于-20℃保存。
实施例3：基因定位和分子标记开发
(1)遗传图谱构建
针对实施例2中获得的F2代个体的基因组DNA，基于RAD-seq的基因分型技术对F2群体的个体进行基因分型，获得F2群体的基因型数据。
用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0，S Lincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992，通过参照将其全文并入本文)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。
(2)基因定位
根据实施例1获得的F2群体的表型数据，结合群体基因型以及遗传连锁图，通过WinQTLCart 2.5软件进行QTL定位。
由于父母本在拒镉性状上有明显的差异(父本不具有拒镉性状，母本具有拒镉性状)，对F2个体进行性状分析，并根据性状和marker之间的连锁关系将拒镉性状基因定位在遗传图谱上。
具体地，针对实施例1中获得的F2群体，将F2群体的个体表型，与父本型性状相似的记为a，与母本型性状相似的记为b，性状居于父本和母本之间的记为h。得到全部个体的表型数据，将个体的表型数据与之前得到的基因型数据进行比较，从而将水稻拒镉基因定位在遗传连锁图谱上。结果显示，其中一个水稻拒镉基因定位在11号染色体26584352至27461103区间内，长度约876751bp。
(3)分子标记开发
对实施例2中获得的母本和父本的基因组DNA进行全基因组重测序(RAD-seq)，然后根据RAD-seq的测序结果，利用SOAP软件比对测序reads，然后用SOAPsv寻找两者基因组片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。
结果，选择靠近拒镉性状基因所在区段的标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)作为候选。
R112741的核苷酸序列如下(43bp)：
TAACTATACCATTAAAACCCTATATTTGTGATATTTTAAGGCG(SEQ ID NO：3)。
实施例4：分子标记的拒镉性状相关性验证
针对实施例3中确定的与水稻拒镉性状基因紧密连锁的分子标记R112741设计引物，以便对分子标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)进行验证，具体如下：
针对上述分子标记设计引物，引物序列如下所示：
R112741-F：GCAAGATGGAGGAATGGTTT(SEQ ID NO：1)；
R112741-R：AATGTGCTGCCATTCAAGCT(SEQ ID NO：2)。
利用上述引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该标记的多态性和扩增稳定性。
具体地，以实施例2中提取的父本、母本、F1代、或F2代的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，其中，
PCR反应体系如下：
无菌水 20.2μl 10×Buffer(含Mg2+) 2.5μl dNTPs(25mM) 0.15μl Taq酶(5U/μl) 0.15μl 正向引物R112741-F 0.5μl 反向引物R112741-R 0.5μl 模板 1.0μl 总体积 25μl
PCR反应程序如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。
接着，将各PCR扩增产物取部分进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1和图2。如图1所示，父本扩增产物约为500bp大小的扩增片段，母本扩增产物约为450bp大小的扩增片段，杂交F1代则同时含有这两个扩增片段。图2中显示了部分F2代个体的扩增产物的电泳检测结果，不具有拒镉性状(籽粒镉含量大于0.8mg/kg)的单株仅扩增出500bp的条带，部分具有拒镉性状(籽粒镉含量小于0.1mg/kg)的单株均仅扩增出450bp的条带，另外部分具有拒镉性状的单株(籽粒镉含量小于0.1mg/kg)含有两个扩增片段。由此，证明该分子标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)在父母本之间具有多态性，该分子标记与水稻拒镉性状紧密相关。
然后，利用3730测序仪对各扩增产物进行测序，结果，母本及F2代中具有拒镉性状的纯合单株扩增条带约450bp，与父本及F2代中不具有拒镉性状的纯合单株扩增条带约500bp相比缺失了一些序列，该序列即为分子标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)。该分子标记的引物可以直接应用于拒镉水稻分子育种实践，针对父本籼型常规稻9311的不具有拒镉性状进行定向改良。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因研究院
深圳华大三生园科技有限公司
深圳市华大农业应用研究院
<120> 分子标记及其应用
<130> PIDC1168375
<150> CN201611177147.3
<151> 2016-12-19
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> Artificial
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<223> 分子标记R112741
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taactatacc attaaaaccc tatatttgtg atattttaag gcg 43