《一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103614421 A (43)申请公布日 2014.03.05 CN 103614421 A (21)申请号 201310583223.0 (22)申请日 2013.11.20 C12P 7/48(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (71)申请人 广西科技大学 地址 545006 广西壮族自治区柳州市东环路 268 号 (72)发明人 程谦伟 孟陆丽 易弋 孙庭广 黄继伟 (74)专利代理机构 柳州市荣久专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 45113 代理人 韦微 (54) 发明名称 一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法 (57) 摘要 本发明涉及。
2、一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的 方法， 该方法以大豆糖蜜作为唯一碳源， 再添加所 需的培养基， 采用黑曲霉菌发酵生产柠檬酸 ； 采 用大豆糖蜜质量浓度 26%， 发酵温度 35， 起始 pH4.5， 发酵时间 96h， 接种量 5%， 在此条件下， 大 豆糖蜜发酵柠檬酸得到的总酸度为 9.02%。本发 明选用大豆糖蜜发酵生产柠檬酸， 充分利用了大 豆糖蜜这一宝贵资源， 对其开发和利用， 一方面可 减轻对环境压力， 另一方面也可以大大提高大豆 糖蜜的利用价值， 变废为宝。 另外由于大豆糖蜜价 格低廉， 采用其作为发酵底物可以明显降低生产 成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 。
3、3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103614421 A CN 103614421 A 1/1 页 2 1. 一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： （1） 培养基的制备 菌种活化培养基的制备 ： 取去皮土豆加蒸馏水煮沸 25-35 min， 土豆与蒸馏水的比例 为 ： 1g ： 3.8-4.2 mL， 过滤， 取滤液， 按1g土豆加入0.1-0.15g葡萄糖和0.09-0.095g琼脂计 加入葡萄糖和琼脂， 用蒸馏水定容， 土豆与定容后溶液的比例为 ：。
4、 1g ： 4.8-5.2 mL， 灭菌后铺 斜面， 制备成斜面培养基备用 ； 种子培养基的制备 ： 取 55-65g/L 的大豆糖蜜溶液， 按 1mL 大豆糖蜜溶液加入 0.05-0.06g 葡萄糖计加入葡萄糖， 用蒸馏水定容， 大豆糖蜜溶液与定容后溶液的体积比为 ： 1 ： 1.9-2.1， 灭菌后冷却备用 ； 发酵培养基的制备 ： 调节大豆糖蜜初糖质量浓度为 23-28%， 加入新制配的石灰乳 调 pH8.8-9.2， 加热煮沸， 过滤， 滤液用硫酸回调至 pH5.8-6.2， 再加草酸除去多余的 Ca2+, 在 2500-3500 r/min 的转速下离心分离 15-25 min， 取。
5、上清液， 按 1mL 上清液加入 0.005-0.006gKH2PO4和0.01-0.015尿素计， 先加入KH2PO4， 灭菌后， 再加入尿素， 再在无菌操 作条件下利用盐酸或者氢氧化钠溶液调节 pH4.3-4.8， 冷却备用 ； （2） 菌种活化 ： 以无菌操作方式用接种环取一环的黑曲霉菌菌种到菌种活化培养基中 划斜面， 放在 28-33恒温培养 65-80 h 后， 用无菌水将斜面上的孢子洗下制备孢子悬浊 液， 利用无菌水调节孢子悬浊液中孢子浓度 0.8106-1.2106spore/mL ； （3） 种子培养 ： 取孢子悬浮液接入种子培养基中， 孢子悬浮液与种子培养基的体积比 为 ： 。
6、1 ： 45-55， 于 32-38、 150-250 r/min 的摇床中培养 35-45h 得种子发酵液 ； （4） 糖蜜发酵产柠檬酸 ： 按 4-6的接种量将种子发酵液接种到发酵培养基中， 将接种 好的培养基放到 32-38、 150-250 r/min 的摇床上培养 90-100h。 2. 根据权利要求 1 所述的一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法， 其特征在于 ： 所述的 发酵培养基的制备步骤中， 所述的石灰乳的质量浓度为 10-20%， 所述的盐酸或者氢氧化钠 溶液的浓度为 1-2mol/L。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法， 其特征在于 ： 。
7、所 述的菌种活化培养基的制备和种子培养基的制备步骤中， 灭菌是指在121灭菌20 min， 所 述的发酵培养基的制备步骤中， 尿素是指在 108灭菌 5min 后的尿素， 盐酸或者氢氧化钠 溶液是指在 121灭菌 15min 后的盐酸或者氢氧化钠溶液。 权 利 要 求 书 CN 103614421 A 2 1/3 页 3 一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法。 背景技术 0002 柠檬酸又名枸橼酸， 是一种三元羧酸， 其学名为3羟基3羧基戊二酸。 柠檬酸 是生物体主要代谢产物之一， 在自然界中分布广泛， 主要存在于柠檬、 柑橘、 梅子。
8、等果实中。 柠檬酸被广泛地应用于食品、 医药和化学工业中。 0003 大豆糖蜜是醇法生产大豆浓缩蛋白过程中的副产物。1963 年 , Daniel Chajuss 把乙醇提取大豆蛋白质过程中产生的棕色粘稠的浆状物质命名为 “大豆糖蜜” 。 大豆糖蜜成 分较为复杂, 是多种植物性化合物的集合体。 在生产大豆浓缩蛋白的过程中产生的大豆糖 蜜是制约生产企业扩大生产规模的主要因素之一， 由于大豆糖蜜物料的特殊性， 目前只作 为价格低廉产品出售主要用作饲料， 有效成分得不到充分利用， 造成资源浪费。因此， 对大 豆糖蜜的开发和利用显得尤为重要， 若能充分利用这一宝贵资源， 对其开发和利用， 一方面 可减。
9、轻对环境压力， 另一方面也可以大大提高其利用价值。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是 ： 提供一种生产成本低的大豆糖蜜发酵生产柠檬酸 的方法， 该方法不仅充分利用了大豆糖蜜中的有效成分， 大大提高了其的利用价值， 变废为 宝， 而且减轻了大豆糖蜜对环境的压力。 0005 解决上述技术问题的技术方案是 ： 一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法， 包括以 下步骤 ： （1） 培养基的制备 菌种活化培养基的制备 ： 取去皮土豆加蒸馏水煮沸 25-35 min， 土豆与蒸馏水的比例 为 ： 1g ： 3.8-4.2 mL， 过滤， 取滤液， 按1g土豆加入0.1-0.15g葡萄糖和0.09-0。
10、.095g琼脂计 加入葡萄糖和琼脂， 用蒸馏水定容， 土豆与定容后溶液的比例为 ： 1g ： 4.8-5.2 mL， 灭菌后铺 斜面， 制备成斜面培养基备用 ； 种子培养基的制备 ： 取 55-65g/L 的大豆糖蜜溶液， 按 1mL 大豆糖蜜溶液加入 0.05-0.06g 葡萄糖计加入葡萄糖， 用蒸馏水定容， 大豆糖蜜溶液与定容后溶液的体积比为 ： 1 ： 1.9-2.1， 灭菌后冷却备用 ； 发酵培养基的制备 ： 调节大豆糖蜜初糖质量浓度为 23-28%， 加入新制配的石灰乳 调 pH8.8-9.2， 加热煮沸， 过滤， 滤液用硫酸回调至 pH5.8-6.2， 再加草酸除去多余的 Ca2+。
11、, 在 2500-3500 r/min 的转速下离心分离 15-25 min， 取上清液， 按 1mL 上清液加入 0.005-0.006gKH2PO4和0.01-0.015尿素计， 先加入KH2PO4， 灭菌后， 再加入尿素， 再在无菌操 作条件下利用盐酸或者氢氧化钠溶液调节 pH4.3-4.8， 冷却备用 ； （2） 菌种活化 ： 以无菌操作方式用接种环取一环的黑曲霉菌菌种到菌种活化培养基中 划斜面， 放在 28-33恒温培养 65-80 h 后， 用无菌水将斜面上的孢子洗下制备孢子悬浊 说 明 书 CN 103614421 A 3 2/3 页 4 液， 利用无菌水调节孢子悬浊液中孢子浓度。
12、 0.8106-1.2106spore/mL ； （3） 种子培养 ： 取孢子悬浮液接入种子培养基中， 孢子悬浮液与种子培养基的体积比 为 ： 1 ： 45-55， 于 32-38、 150-250 r/min 的摇床中培养 35-45h 得种子发酵液 ； （4） 糖蜜发酵产柠檬酸 ： 按 4-6的接种量将种子发酵液接种到发酵培养基中， 将接种 好的培养基放到 32-38、 150-250 r/min 的摇床上培养 90-100h。 0006 本发明的进一步技术方案 ： 所述的发酵培养基的制备步骤中 , 所述的石灰乳的质 量浓度为 10-20%， 所述的盐酸或者氢氧化钠溶液的浓度为 1-2mo。
13、l/L。 0007 所述的菌种活化培养基的制备和种子培养基的制备步骤中， 灭菌是指在 121灭 菌20 min， 所述的发酵培养基的制备步骤中， 尿素是指在108灭菌5min后的尿素， 盐酸或 者氢氧化钠溶液是指在 121灭菌 15min 后的盐酸或者氢氧化钠溶液。 0008 以干基计， 大豆糖蜜中碳水化合物占总固形物含量的 60% 左右， 是一种良好的天 然微生物发酵剂， 因大豆糖蜜价格低廉， 作为发酵底物可以明显降低生产成本， 使其有效地 转换为具有更高利用价值的生物能源和化工原料， 同时， 大豆糖蜜制备发酵产品的副产物 还是良好的饲料添加剂， 可达到物尽其用。 本发明选用大豆糖蜜发酵生产。
14、柠檬酸 （以大豆糖 蜜作为唯一碳源） ， 充分利用了大豆糖蜜这一宝贵资源， 对其开发和利用， 一方面可减轻对 环境压力， 另一方面也可以大大提高大豆糖蜜的利用价值。 因此， 选用大豆糖蜜发酵生产柠 檬酸， 无论是从经济角度还是从可行性角度， 都是值得考虑选择利用的。 本发明采用大豆糖 蜜发酵生产柠檬酸得到的总酸度为 9.02%。 0009 下面， 结合附图和实施例对本发明之一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法的技术 特征作进一步的说明。 附图说明 0010 图 1 ： 本发明工艺流程图。 具体实施方式 0011 实施例 1 ： 一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法， 包括以下步骤 ： （1） 培养基的。
15、制备 菌种活化培养基的制备 ： 50 g 去皮土豆加蒸馏水 200mL 煮沸 30 min， 过滤， 取滤液， 加 入 5 g 葡萄糖， 4.5 g 琼脂， 蒸馏水定容至 250 mL， 在 121灭菌 20 min 后倒入试管中铺斜 面， 制备成斜面培养基备用。 0012 种子培养基的制备 ： 于250 ml三角瓶加入60 g/L的大豆糖蜜溶液50 mL， 加入2.5 g 葡萄糖， 蒸馏水定容至 100 mL， 121灭菌 20 min， 冷却备用。 0013 发酵培养基的制备 ： 调节大豆糖蜜初糖含量为 26%（质量浓度） ， 加入新制配的 15% 石灰乳调 pH9.0， 加热煮沸， 过滤。
16、， 滤液用硫酸回调至 pH6.0， 再加草酸除去多余的 Ca2+, 在 3000 r/min的转速下离心分离20 min， 取上清液， 以每瓶50 mL分装到500 mL的三角瓶中， 添加 KH2PO4 0.3g， 在 121 下高压灭菌 20 min， 在无菌操作条件下加入尿素 0.5g（尿素事 先 108灭菌 5min） ， 再在无菌操作条件下利用 1mol/L 盐酸或者氢氧化钠溶液调节 pH4.5 （1mol/L 盐酸或者氢氧化钠事先 121灭菌 15min） ， 冷却备用。 0014 （2） 菌种活化 ： 以无菌操作方式用接种环取一环的黑曲霉菌菌种到菌种活化培养 说 明 书 CN 10。
17、3614421 A 4 3/3 页 5 基中划斜面， 把接好菌种的试管放在 30恒温培养 72 h 后， 用无菌水将斜面上的孢子洗下 制备孢子悬浊液， 利用无菌水调节孢子悬浊液中孢子浓度约 106spore/mL。 0015 （3） 种子培养 ： 吸取约 2 mL 孢子悬浮液接入已装有 100 mL 的种子培养基的 250 mL 的三角瓶中， 35 200 r/min 的摇床中培养 40 h 得种子发酵液。 0016 （4） 糖蜜发酵产柠檬酸 利用大豆糖蜜按照发酵培养基的制备方法制得发酵培养基， 按 5%（质量分数） 的接种 量将种子发酵液接种到发酵培养基中， 将接种好的培养基放到 35 ,200r/min 的摇床上培 养 96h。在此条件下， 大豆糖蜜发酵柠檬酸得到的总酸度为 9.02%。 说 明 书 CN 103614421 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103614421 A 6 。