技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种可应用于调节植物性状的转录因子。
背景技术
自然情况下，基因自发或诱发突变的频率低，有益突变则更少；并且，某种植物可利用的种质资源由于受生殖隔离等特性的制约，而局限在非常有限的范围内，使植物的遗传改良在很大程度上受到了限制。目前现有技术中，植物遗传改良是以基因突变和有性杂交为基础的。
随着分子生物学的发展，人们对外源基因导入细胞及导人细胞后转化子的再生，进行了探索和研究，建立了切实可行的遗传转化体系，使得植物基因工程技术日臻完善。人们把基因工程技术应用于植物遗传改良，解决了常规遗传改良中存在的一些难题，逐步发展成为一种新的遗传改良手段，给植物遗传改良注入了新的活力。现代生物技术的飞速发展，使植物基因工程的研究硕果累累，给人类的生存与发展带来了新的希望和曙光。尽管植物基因工程在遗传改良中的应用仍然存在许多问题，但其应用价值越来越受到重视。通过植物基因工程技术，将外源遗传物质插入、整合到受体植物的基因组中，使其在后代植株中稳定地遗传和表达，从而使受体植物获得新的性状。
利用植物基因工程技术进行遗传改良，能够打破物种间的生殖隔离，使不同物种间遗传交流成为可能，为拓宽植物可利用基因库创造了条件：植物基因工程提供了新的创造变异的技术手段，大大缩短了植物遗传改良周期：同时用于基因工程遗传改良的基因大多研究得较为清楚，改良的植物目的性状明确，选择手段有效，使引发植物产生定向变异和进行定向选择成为可能：另外通过改良植物的一些关键性状，使原品种(系)的重要农艺性状在很大程度上得到提高。
转基因作物的推广将会缓解主要作物品质差、产量徘徊不前、病虫害逐年加重、水资源短缺、土壤退化、盐碱地、铝离子毒害及大量使用农药引起的环境污染等问题，为保障粮食安全、生态安全和提高农产品国际竞争力提供了强力技术支撑。
随着基因工程研究的不断深入，能够克隆到更多的新基因并且转基因技术会得到进一步完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，这在常规遗传改良中是难以实现的。然而，鉴于植物基因的多样性，本领域有必要进一步地从诸多基因中找到对于改变植物性状有关的基因，以用于创造理想的植物株型、改善植物营养成分以及果实性状。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可应用于调节植物性状的转录因子。
在本发明的第一方面，提供一种调节植物性状的方法，所述方法包括：调节植物中SlZFP2多肽的表达。
在一个优选例中，所述方法还包括后续步骤：从调节SlZFP2多肽的表达后的植物中选择出相较对照植物而言性状获得调节的植物。
在另一优选例中，所述的植物选自：禾本科植物、茄科植物。
在另一优选例中，所述的禾本科植物选自：水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱。
在另一优选例中，所述的茄科植物选自：番茄、马铃薯、茄子、辣椒、烟草、枸杞。
在另一优选例中，所述的SlZFP2多肽选自下组：(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽序列有80%以上(较佳地85%以上，更佳地90%以上，如95%，98%，99%)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述方法包括：提高植物中SlZFP2多肽的表达；从而：促进植物开花时间提前；推迟植物果实成熟时间；增加植物分枝或分蘖的数量；增加植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量；降低植物植株的高度；降低植物种子的重量和/或减少植物种子数量(包括使植物不产生种子)；和/或促进植物叶片变小。
在另一优选例中，所述的方法包括：将编码SlZFP2多肽的多核苷酸转入植物(如细胞、组织、器官或种子)，获得转化入所述多核苷酸的植物(如细胞、组织、器官或种子)。
在另一优选例中，所述的编码SlZFP2多肽的多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1，或是SEQ ID NO:1的简并的核苷酸序列，或是编码的多肽与SEQ ID NO:1所编码的多肽功能相同的核苷酸变异体。
在另一优选例中，将编码SlZFP2多肽的多核苷酸转入植物的方法包括：
(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码SlZFP2蛋白；
(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；和
(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
在另一优选例中，所述的方法包括：
(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码SlZFP2多肽；
(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。
在另一优选例中，所述方法包括：降低植物中SlZFP2多肽的表达，从而：
减少植物分枝或分蘖的数量；和/或
降低植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量。
在另一优选例中，所述降低植物中SlZFP2多肽的表达包括：
将干扰所述SlZFP2多肽的编码序列表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，从而下调植物中SlZFP2多肽的表达。
在另一优选例中，所述降低植物中SlZFP2多肽的表达的方法包括：
(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：
(a)含有反方向启动的SlZFP2基因或基因片段(反义分子)的载体；
(b)含有可在植物体内形成特异性干扰SlZFP2基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；
(ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物细胞、组织或器官。
较佳地，所述方法还包括：(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
在本发明的另一方面，提供一种SlZFP2多肽或其编码基因用途，用于调节植物性状。
在一个优选例中，所述的SlZFP2多肽或其编码基因用于：促进植物开花时间提前；推迟植物果实成熟时间；增加植物分枝或分蘖的数量；增加植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量；降低植物植株的高度；降低植物种子的重量和/或减少植物种子数量(包括使植物不产生种子)；促进植物叶片变小；和/或作为鉴定植物性状的分子标记。
在另一优选例中，若经检测植物组织中SlZFP2多肽表达高于一个特定值(如野生型同一植物的平均SlZFP2表达量的值)，则相对而言，所述植物开花时间提前；果实成熟时间推迟；分枝或分蘖的数量增加；果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量增加；植株的高度降低；种子的重量和/或数量减少或不产生种子；或植物叶片变小。若经检测植物组织中SlZFP2多肽表达低于该特定值，则相对而言，所述植物的分枝或分蘖的数量减少；或果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量降低。
在本发明的另一方面，提供一种降低SlZFP2多肽表达的物质的用途，用于：减少植物分枝或分蘖的数量；和/或降低植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量。
在另一优选例中，所述的降低SlZFP2多肽表达的物质是干扰所述SlZFP2基因表达的干扰分子。
在本发明的另一方面，提供一种干扰所述SlZFP2基因表达的干扰分子，其含有式(I)所示的结构：Seq正向-X-Seq反向式(I)，
式(I)中，Seq正向为SlZFP2基因片段(较佳地为SEQ ID NO:1中第334-723位所示的核苷酸序列)，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，式(I)所示的结构在转入植物细胞后，形成式(II)所示的二级结构：
式(II)，
式(II)中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间的基本上互补的关系。
在另一优选例中，所述的间隔序列本身不构成互补双链结构。
在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的干扰分子。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1、过表达载体pWL007示意图。
图2、RNAi载体pWL009示意图。
图3、SlZFP2基因表达特征。其中A和E是SlZFP2正义RNA探针的杂交结果，无明显信号。B-D和F-H为SlZFP2反义RNA探针的杂交结果。标尺为200um。
图4、过量表达和表达抑制在株型、果实和种子的表型。
A-C、分别为三周小苗、45天小苗茎徒手切片和45天小苗根的照片。
D、pWL007转化株系103果实成熟过程照片，上排为非转基因对照，下排为103转基因植株果实。
E-F、分别pWL009转化植株小苗及对照。
G、RNAi植株花序坐果困难。
H、pWL007和pWL009的M82转基因植株。
J-H、四个pWL007转化株系果实成熟时间(从授粉到果实转色时的天数)和百粒种子重量(单位为毫克)，NonTrans为非转基因对照。
图5、基因调控脱落酸(ABA)合成的机理。
A：三个pWL007转基因LA1589株系及其非转基因对照的气孔大小。每个株系取3-5个单株共50-60个气孔在电子显微镜上观察测量，数据为株系气孔大小的均值±标准差。
B：种子发芽速率的统计。三个pWL007转基因LA1589株系及其非转基因对照种子在吸水纸上发芽，D0-D7时统计时间0-7天，3次重复，每个重复50粒种子。数据为平均发芽率±标准差。
C：在ABA突变体sit中过量表达SlZFP2(由源自pWL007的M82转基因通过杂交转育至sit突变体中，sit突变体来自美国番茄遗传资源中心，TGRC)。图片为成熟果实的纵切图。
D：三个pWL007转基因株系及其非转基因对照的ABA含量。叶片、花和成熟绿果三个时期的ABA含量测定方法参见参考文献Fu，X.，et al.，J Exp Bot，2012.63(1):p.341-54。
E：ABA合成酶和转运基因在pWL007转基因及非转基因对照植株叶片中的表达量变化。NOT、SIT、SlAO1、SlAO2和FLC为ABA合成的主要关键酶 编码基因，SlABCG40是番茄ABA转运的潜在载体基因。定量RT-PCR分析材料为转基因株系103及其对照在45天时叶片，结果示相对于SleIF4a基因的表达量均值±标准差。
F：ABA合成酶基因SIT和FLC在RNAi植株花中的表达变化。RNA提取自四个LA1589的RNAi植株(不同的独立转化植株)及LA1589对照的花(开花当天)。
G：免疫共沉淀分析(ChIP)分析SlZFP2与ABA合成酶基因SlAO1启动子的结合。所用材料为30天苗龄的转基因植株及其对照叶片，ChIP及定量PCR(qPCR)分析方法参见参考文献Ito，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2012.109(9):p.3582-3587。
H：凝胶阻止(EMSA)实验验证SlAO1启动子与SlZFP2的结合。探针来自ChIP实验(G图)的PCR产物，以细菌表达的GST-SlZFP2(全长)融合蛋白进行体外EMSA实验。EMSA方法参见参考文献Peng，H.，et al.，Cancer Res，2002.62(13):p.3773-81。
图6、SlZFP2基因调控植株开花的机理。图中的C、D和F所示的表达量均以番茄SleIF4a表达量作参照。
A：pWL007的LA1589转基因及非转基因植株在45天时的照片。
B：四个pWL007的LA1589转基因及非转基因植株的开花时间统计。开花时间以第一朵花序出现前的真叶数目表示，利用学生T-测验(student’s t-test)比较转基因植株和分离自同一转基因T0代的非转基因植株之间的差异。样本数N=15。
C：番茄开花基因SFT在转基因植株及非转基因对照不同年龄叶片的表达变化。用于定量RT-PCR的叶片取自45天植株，非转基因植株有16片看见叶，而转基因植株有12片可见叶。
D：SFT在四个RNAi植株花的表达变化。总RNA取自pWL009转LA1589当代(T0)的花组织(开花当天)。
E：ABA突变体及其野生型植株的开花时间统计。ABA合成突变体not、sit和flc由TGRC惠赠。开花时间统计方法同图4B。
F：SFT在ABA合成突变体及其野生型植株叶片中的表达变化。叶片取同一发育时期的叶片(自茎尖往下数的第5片叶，45天植株)。番茄sft的表达量做负对照。
G：免疫共沉淀分析(ChIP)分析SlZFP2与SFT启动子的结合。所用材料为 30天苗龄的转基因植株及其对照叶片，ChIP及定量PCR(qPCR)分析方法参见参考文献Ito，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2012.109(9):p.3582-3587。
H：凝胶阻止(EMSA)实验验证SFT启动子与SlZFP2的结合。探针来自ChIP实验(G图)的PCR产物，以细菌表达的GST-SlZFP2(全长)融合蛋白进行体外EMSA实验。EMSA方法参见参考文献Peng，H.，et al.，Cancer Res，2002.62(13):p.3773-81。
图7、SlZFP2的亚细胞定位。
图8、转基因番茄类胡萝卜素含量变化。
A：通过转录组分析，发现SlZFP2主要在番茄开花后表达；
B：利用半定量RT-PCR验证了SlZFP2表达受果实生长发育调控；
C：通过MEME软件进行蛋白序列分析表明SlZFP2多肽含有一个C2H2锌指结构域(结构域1)和一个可能参与转录抑制的结构域(结构域2)；
D-E：两个结构域的氨基酸保守性分析。
图9、过量表达SlZFP2改变番茄植株株型和果实成熟(T1代)。
A：四个pWL007转化LA1589的转化植株自交分离出来的转基因和非转基因植株在45天左右时的照片；
B：SlZFP2转基因在pWL007转化LA1589的转化植株叶片中的表达分析；
C：HA-SlZFP2在四个pWL007转化LA1589的转化植株中的蛋白质表达水平。Western blot是以HA单克隆抗体(Sigma)检测转基因植株叶片中的HA-SlZFP2蛋白水平；
D-G：四个pWL007转化LA1589的转化植株在T1代时的株高、分枝数、开花时间和果实成熟的表型统计。
每个基因型共观察了5株，果实成熟统计了每株至少15个果实，图示各基因型的性状均值±标准差。
图10、过量表达SlZFP2改变番茄植株株型和果实成熟(T2代)。
A：三个SlZFP2(pWL007)过表达株系果实成熟变化，DPA：days post anthesis(授粉后天数)；
B：四个SlZFP2(pWL007)过表达株系在45天时的株高；
C：四个SlZFP2(pWL007)株系在45天时分枝数目的变化；
D和E：四个转化株系果实大小和种子数目的统计。A中“-”和“+”分别示 不含和含有SlZFP2转基因片段；
B-E：NonTrans为非转基因对照；
数据来自5株/株系，每株统计15-20个果实。图中所有转基因均为纯合株系，所有植株均为LA1589背景。
图11、过量表达SlZFP2改变番茄植株叶片大小和侧芽生长。
图12、番茄M82的SlZFP2过量表达植株(401、402等表示过表达株系)表型。
A：SlZFP2(pWL007)转化M82的转基因植株。最下方的401和402植株和枝条照片来自3个月植株；
B：pWL007转M82植株的基因表达分析。自叶片提取的总RNA用于半定量RT-PCR分析；
C：五个pWL007转M82植株果实的横切图；
D：三个pWL007转M82植株(灰色柱形)与非转基因对照(黑框白底柱形)的果实重量比较。非转基因植株为分离自转基因T0代自交后代。
图13、不含HA标签的SlZFP2过量表达植株(502，503等)表型。每个小图下方的数字代表不同的株系编号，WT和LA1589是非转基因对照。后代性状考察时所用对照为从同一转基因T0代分离出来的非转基因植株(NonTrans)，每个株系分析了转基因和非转基因植株各3株。trSlZFP2/eIF4a6和endoSlZFP2/eIF4a6分别表示导入和内源SlZFP2的转录本与eIFA4a6转录本的比值，反映该基因的转录水平。显示显著性水平的P值是T测验(Student’s t-test)计算而来。
图14、SlZFP2转基因植株与非转基因植株之间的嫁接实验，103N和103分别表示非转基因和转基因植株。嫁接是在3周左右植株之间进行，横线上方为接穗，下方为砧木。
图15、RNAi干扰载体pWL009分别导入了番茄LA1589和M82。图中206、208、209和210株系为pWL009转化LA1589的RNAi转化植株，501、509、510和512为pWL009转化M82的RNAi转化植株。每个编号代表一个独立的转化株系。
图16、过量表达SlZFP2影响叶片气孔和种子萌发对ABA的敏感性。
A：三个SlZFP2转基因的LA1589植株(102、103、105)叶片的气孔比较；
B：不同ABA处理叶片对气孔开闭的影响；
C：ABA对三个SlZFP2转基因LA1589种子发芽的影响。
图17、在番茄LA1589中过量表达SlZFP2基因对开花基因SFT在花、发育果实(授粉后5和10天)以及成熟绿果的表达影响。图中未特异标注的黑柱形图为SlZFP2转LA1589的转基因植株，白色柱形图示非转基因对照。dpa，授粉后天数(day post anthessis)。LA0534和LA0535分别是not和sit，flc突变体的野生型对照(近等基因系)。
图18、SlZFP2在水稻中过量表达导致植株分蘖数目增加。其中，CK为不含SlZFP2转基因的水稻中花11，NO1-NO11为转SlZFP2基因水稻。
图19、在番茄LA1589中过量表达SlZFP2对叶片中ABA含量的影响，材料为pWL007转LA1589的纯合转基因植株，取样时非转基因植株有17片可见叶，转基因植株有12片可见叶，均为播种后45天植株。
图20、通过qRT-PCR定量分析各个ABA合成酶基因在LA1589的SlZFP2转基因植株叶片中的表达情况。
图21、ABA合成、转运和响应相关基因在几个RNAi(pWL009)转化株系花的表达水平，WT为非转基因LA1589对照。所用材料和qRT-PCR分析与图5F一样，均为同一批次实验。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，发现通过改变SlZFP2在植物体内的表达，可以显著改良植物的株型(侧枝数目，株高)、开花时间、收获器官如果实的成熟时间和大小。因此本发明的方法可应用于创造理想植物株型、获得高番茄红素、高β-胡萝卜素等营养物质的植物新品种，在植物产量和品质的遗传改良上具有良好的应用前景。
如本文所用，本发明的植物(或作物)是适合进行基因的转化操作的植物，如各种农作物、花卉植物或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：番茄、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、 大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。
作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：禾本科植物、茄科植物等。比如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、小麦、玉米、番茄、马铃薯、茄子、辣椒、烟草等。
如本文所用，选择合适的“对照植物”是实验设计的例行部分，“对照植物”可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
本发明还包括SlZFP2多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SlZFP2多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。较佳地，本发明所述的SlZFP2多肽包括一种融合蛋白，其是将HA标签与SlZFP2连接构成的融合蛋白；该融合蛋白在植物体内具有稳定SlZFP2多肽功能的作用。
任何一种SlZFP2多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，SlZFP2多肽的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的SlZFP2多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长SlZFP2多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长SlZFP2多肽的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
在本发明中，术语“SlZFP2多肽”指具有SlZFP2多肽活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与SlZFP2多肽相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较 佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SlZFP2多肽的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SlZFP2多肽DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗SlZFP2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SlZFP2多肽或其片段的融合蛋白。
任何与所述的SlZFP2多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性95%，98%或99%)的、且具有SlZFP2多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。
发明还提供SlZFP2多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然SlZFP2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
应理解，虽然本发明的SlZFP2多肽优选获自茄科植物(如番茄)，但是获自其它植物的与番茄SlZFP2多肽高度同源(如具有80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它多肽也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明还涉及编码本发明SlZFP2多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明 中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码SlZFP2多肽的多聚核苷酸。
本发明的SlZFP2基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或SlZFP2基因序列经基因工程产生的宿主细胞。
本发明中，SlZFP2多肽多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。
在本发明的具体实施例中，在茄科植物番茄中过量表达SlZFP2多肽，可以显著加快植株开花时间，以开花时植株的叶片数目为指标时，过量表达植株早3-5片叶开花，果实成熟推迟5-7天，植株芽休眠减弱、分枝增加，植株稍有矮化，植株叶片、花和果实中的ABA含量减少，果实中的番茄红素和β-胡萝卜素含量增加，种子休眠性有所降低。但抑制该转录因子在番茄中的内源表达，植株与野生型植株在营养期没有明显变化，但侧枝减少，坐果受到抑制，易落果。
体内免疫共沉淀实验证明，SlZFP2多肽可以结合在多个ABA合成酶基因和开花基因SFT的启动子上，体外EMSA实验也确证了其结合的特异性。一系列实验从遗传、生化等多个方面证明了该转录因子是一个调控ABA合成酶基因表达的新成员，直接参与调控植物开花途径。
因此，本发明提供了所述的SlZFP2多肽或其编码基因的用途，用于调节植物的性状；或用于筛选对于调节植物性状有用的物质(即：所述物质通过调节SlZFP2多肽的表达来调节植物性状)。作为一种优选方式，所述的SlZFP2多肽可用于：促进植物开花时间提前；推迟植物果实成熟时间；增加植物分枝 或分蘖的数量；增加植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量；降低植物植株的高度；降低植物种子的重量和/或减少植物种子数量(包括使植物不产生种子)；和/或促进植物叶片变小。
本发明还涉及SlZFP2的激动剂或拮抗剂及其用途。由于SlZFP2的激动剂或拮抗剂可调节SlZFP2的表达和/或调节SlZFP2的活性等，因此，所述的SlZFP2的激动剂或拮抗剂也可通过对SlZFP2的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。
任何可提高SlZFP2多肽的活性、提高SlZFP2多肽的稳定性、促进SlZFP2多肽的表达、延长SlZFP2多肽有效作用时间、或促进SlZFP2的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物性状，特别是促进植物开花时间提前；推迟植物果实成熟时间；增加植物分枝或分蘖的数量；增加植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量；降低植物植株的高度；降低植物种子的重量和/或减少植物种子数量(包括使植物不产生种子)；和/或促进植物叶片变小。任何可降低SlZFP2多肽的活性、降低SlZFP2多肽的稳定性、抑制SlZFP2多肽的表达、减少SlZFP2多肽有效作用时间、或降低SlZFP2的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为SlZFP2的下调剂、拮抗剂或抑制剂(即：下调SlZFP2多肽表达的物质)，如抗所述SlZFP2多肽的抗体，干扰所述SlZFP2多肽的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调节植物性状，特别是减少植物分枝或分蘖的数量；和/或降低植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。
本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中SlZFP2多肽的表达。
一方面，本发明提供了一种调节植物性状的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达SlZFP2多肽，从而：促进植物开花时间提前；推迟植物果实成熟时间；增加植物分枝或分蘖的数量；增加植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量；降低植物植株的高度；降低植物种子的重量和/或减少植物种子数量(包括使植物不产生种子)；和/或促进植物叶片变小。
另一方面，本发明还提供了一种调节植物性状的方法，所述的方法包括：：降低所述植物中SlZFP2多肽的表达(包括使SlZFP2多肽不表达或低表达)，从 而：减少植物分枝或分蘖的数量；和/或降低植物(较佳地为果浆类植物)果实中类胡萝卜素和/或番茄红素含量。
在得知了所述的SlZFP2多肽的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的SlZFP2多肽的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带SlZFP2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的SlZFP2多肽。
此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低SlZFP2多肽的表达或使之缺失表达，比如将携带反义SlZFP2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达SlZFP2多肽。
作为本发明的一种实施方式，将编码SlZFP2多肽的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述SlZFP2多肽的植物细胞中，使所述的植物细胞表达SlZFP2多肽。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达SlZFP2多肽的植物。
优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的SlZFP2多肽的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入SlZFP2多肽的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源SlZFP2多肽的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SlZFP2多肽的编码基因；
(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使SlZFP2多肽的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入SlZFP2多肽的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
其它增加SlZFP2基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强SlZFP2基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该SlZFP2基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。
优选的，还提供了一种降低植物中SlZFP2多肽的表达的方法，所述的方法包括：
(1)将干扰SlZFP2基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：
(a)含有反方向启动的SlZFP2多肽的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；
(b)含有可在植物体内形成特异性干扰SlZFP2多肽的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；
(ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物细胞、组织或器官。
较佳地，所述方法还包括：
(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和
(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
基于SlZFP2基因的核苷酸序列，可以设计出在导入植物体后可形成特异性干扰SlZFP2基因表达的分子的多核苷酸。设计时要考虑到特异性以及干扰的效率。本发明对干扰分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了SlZFP2基因与植物性状的相关性以后，可以以各种途径制备出所述的干扰分子，从而用于调节植物性状。所述的干扰分子可通过转基因技术被输送到植物体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到植物体内。
作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果优异的干扰分子，所述的干扰分子可特异性的干扰SlZFP2基因的表达；并且经验证，其具有良好的干扰SlZFP2基因表达的效果。所述的干扰分子是含有SEQ ID NO:1中第334-723位所示的核苷酸序列的分子。当其被转入到植物体内后可形成具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的干扰分子。
本发明还提供了一种干扰分子，所述干扰分子含有以下结构：Seq正向为SlZFP2基因片段(较佳地为SEQ ID NO:1中第334-723位所示的核苷酸序列)， Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
所述的干扰分子在导入到植物体内后，可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。也即，形成如下所示的二级结构：
其中，‖表示在Seq正向和Seq反向之间的基本上互补的关系。所述的茎环结构可被植物体内的各种物质进一步作用、加工或剪切，并且形成双链RNA(dsRNA)。
通常，所述的干扰分子位于表达载体上。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了SlZFP2基因或其同源基因的转基因植物；或者SlZFP2多肽表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
此外，本发明还涉及利用SlZFP2多肽或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用SlZFP2多肽或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中SlZFP2多肽的表达情况，鉴定植物的性状。还可利用SlZFP2基因相关的植物特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。
此外，本发明还提供筛选可调节植物性状的潜在物质的方法。在得知了所述的SlZFP2多肽的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节植物性状的潜在物质。在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选调节植物性状的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达SlZFP2多肽的体系接触，检测候选物质对SlZFP2多肽的影响；若所述候选物质可提高或降低SlZFP2多肽的表达，或促进或抑制SlZFP2多肽的活性，则表明其是可用于调节植物性状。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节植物性状有用的物质。
作物的生长周期是决定作物产量、种植适应性的极为重要因素，作物的开花时间受多种环境因素和内在的遗传因子所控制，通过遗传改良作物的开花时间，在农业生产上具有重要的经济价值。本发明发现的转录因子SlZFP2作用于在各个物种中保守的开花时间控制基因，因此在利用遗传改良作物的开花时 间上可能具有普遍性，能应用于不同作物。利用本发明所涉及的转录因子还可以有效增加或减少植株的分枝数，应用于作物的株型育种，获得理想株型。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1、基因的分离、载体构建及转基因方法
基因分离和载体构建
SlZFP2基因分离自番茄品系LA1589(Solanum pimpinefolium)。利用Trizol抽取的总RNA经逆转录酶合成cDNA，首先用引物XP0034：5’-ATGTTCCAGATTACGCTCTCGAGATGAGTTATGAACCAAACACGG-3’和XP0036：CGGGATCCAACATAATCGCCCTTGAGTAGA扩增出SlZFP2编码序列，克隆到pMD18-T载体(购自Takara公司)，然后再用XP0035：GCCACCATGGTTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTCTCGAG和XP0036从上述经测序无误的质粒中扩增目标片段，并将PCR产物连接到pMD18-T载体。引物XP0035含HA标签序列，用于构建HA-SlZFP2融合蛋白。测序确定无误后，利用限制性内切酶BamHI切出HA-SlZFP2片段，并连接到同样用BamHI酶切的农杆菌双元载体pHX20上，pHX20改造自pZH01(pZH01改造自pCAMBIA1300，详见文献Xiao，H.，et al.，Functional analysis of the riceAP3homologue OsMADS16by RNA interference.Plant Mol Biol，2003.52(5):p.957-66)。pHX20是通过限制性内切酶SalI消化pZH01后回收含有载体骨架的大片段，用T4DNA连接酶进行载体自连而成，该载体去除了花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶NOS终止子之间的GUS连接区。获得过表达质粒pWL007即p35S:HA-SlZFP2，其中HA-SlZFP2连接在组成型启动子CaMV35S下游，NOS终止子的上游。质粒通过热激法导入到农杆菌GV3101菌株，用于植物转化。
过表达载体pWL007示意图如图1，其中，p35S，花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；HA，源自流感病毒血凝素表面抗原(Human influenza hemagglutinin)的 蛋白标签，氨基酸序列为YPYDVPDYA，序列为人工合成；Nos-t，根癌农杆菌胭脂碱合成酶NOS终止子。除HA-SlZFP2外，其它DNA序列来自质粒骨架pHX20。pHX20含有35S驱动的潮霉素抗性基因HygR(用于转基因筛选时的选择标记)和细菌选择标记卡那霉素抗性基因KanR。
RNAi干扰载体pWL009的构建是以pFGC5941RNAi双元载体(购自拟南芥资源中心ABRC)为骨架，将SlZFP2序列片段(SEQ ID NO:1中第334-723位)分别以正反向方式连接到pFGC5941上的AscI/SwaI位点(正向连接)和BamHI/XbaI位点(反向连接)，该质粒信息和详细的克隆步骤参见文献Kerschen，A.，et al.，Effectiveness of RNA interference intransgenicplants.FEBS Lett，2004.566(1-3):p.223-8，该401bp的SlZFP2片段是利用引物XP0028：GCTCTAGAGGCGCGCCGAGTTGAGTTCAACCCTACG和XP0029：CGCGGATCCATTTAAATAATCGCCCTTGAGTAGAATC通过PCR自LA1589cDNA扩增而来，下划线序列为人为添加的限制性内切酶识别位点，用于载体构建。质粒通过热激法导入到农杆菌GV3101菌株，用于植物转化。
RNAi载体pWL009示意图如图2所示。pWL009是基于RNAi干扰载体pFGC5941构建的。pFGC5941含有植物筛选标记Bar基因和细菌选择标记KanR基因。CHSA Intron，矮牵牛查尔酮合酶A基因(chalcone synthase A)内含子。OCS3’，章鱼碱合成酶基因(OCS)的3’ploy A区。
RT-PCR引物如表1。
表1、RT-PCR引物
植物转化
利用子叶的农杆菌介导的转化方法，分别将pWL007和pWL009导入到番茄 品系LA1589(栽培番茄的近源野生种，获自美国番茄遗传资源中心TGRC)和M82(加工型番茄，获自以色列Hebrew University ofJerusalem)。pWL007也利用农杆菌介导法转入水稻品种中花11。番茄农杆菌转化参见McCormick，S.，Transformation of tomato with Agrobacterium tumefaciens.In Plant Tissue Culture Manual，Lindsey，K.，ed.(Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands，1991).B6:p.1-9方法进行，水稻转化方法采用Hiei，Y.，et al.，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994.6(2):p.271-82方法。pWL007转基因植株通过潮霉素B筛选，pWL009利用草甘膦(PPT)筛选。
实施例2、SlZFP2基因表达特征及亚细胞定位
1、基因表达特征
利用SlZFP2的DNA序列，对番茄近缘野生种LA1589植株进行原位杂交检测SlZFP2在不同组织中的表达。方法见参考文献Coen，E.S.，et al.，Cell，1990.63(6):p.1311-22。
结果如图3。表明SlZFP2主要在幼叶(A)、侧芽(B)、花原基(D)、花药及胚珠(F)、种子(G和H)表达。
2、SlZFP2的亚细胞定位
荧光蛋白基因YFP来自Clontech公司，对照载体p35S:YFP的构建是通过PCR扩增将YFP基因克隆到pHX20上，p35S:SlZFP2-YFP融合表达载体是将SlZFP2的全长编码序列利用PCR扩增后经NotI酶切连接到p35S:YFP上YFP序列上游相应位点，形成融合蛋白。p35S:SlZFP2-YFP和p35S:YFP分别导入农杆菌菌株GV3101。
结果如图7。图示分别含这两个载体的农杆菌侵染本氏烟草N.benthamiana叶片3天后的表达情况，激光共聚焦显微镜观察到SlZFP2-YFP信号位于细胞核内，说明SlZFP2编码一个核定位蛋白。详细的农杆菌感染和荧光检测步骤参见文献Tsai，C.W.，et al.，J Virol，2005.79(9):p.5304-14。
实施例3、过量表达和表达抑制在番茄株型、果实和种子的表型
1、番茄根系、果实的表型变化分析
如实施例1制备转基因的番茄，观察SlZFP2过量表达和抑制表达在株型、果实和种子的表型。如图4，图中除了H来自M82转基因外，其余均来自LA1589转基因株系。OE表示由质粒pWL007转化而来的过量表达SlZFP2的植株，RNAi为pWL009而来的SlZFP2表达抑制植株。#102，103，104和105分别为四个独立转化来源的植株，纯合后称为株系。每个株系统计了5株上的15-20个果实的成熟变化和10个果实中的种子重量，数据为5株平均值±标准差。结果表明，过量表达SlZFP2导致根系减少，植株分枝增加，茎秆变细，果实成熟推迟，种子变轻；而通过RNAi干扰SlZFP2的表达则影响植株坐果。
2、转基因番茄(转化LA1589)类胡萝卜素含量变化
通过转录组分析，发现SlZFP2主要在番茄开花后表达(图8A)，进一步利用半定量RT-PCR验证了SlZFP2表达受果实生长发育调控(图8B)。通过MEME软件进行蛋白序列分析表明SlZFP2含有一个C2H2锌指结构域(图8C中结构域1)和一个可能参与转录抑制的结构域(图8C中的结构域2)，图8D和E示这两个结构域的氨基酸保守性。图8B图中的根、子叶、下胚珠取自7-10天LA1589幼苗，开花前花苞、花和各个时期的果实取自2个月左右的植株。图8C图中的各物种ZFP2蛋白名称的前两个字母代表该物种拉丁名的第一个字母。MEME分析见参考文献Bailey，T.L.，et al.，Nucl.Acids Res.，2006.34(suppl2):p.W369-W373。
SlZFP2转基因番茄果实的类胡萝卜素含量变化如表2。
表2
胡萝卜素类代谢物的测定参见参考文献Fu，X.，et al.，J Exp Bot，2012.63(1):p.341-54。Mature Green和Turning代表果实处于成熟绿果期和转色期。103N和208N分别是pWL007过量表达和pWL009RNAi转基因株系的非转基因对照 (NonTrans)，它们各自从同一转基因T0植株自交分离而来，作为对照它们与转基因植株相比具有同一遗传背景，因为经历相同的组织培养过程。
结果表明：过量表达SlZFP2增加类胡萝卜素和番茄红素含量，而抑制SlZFP2表达则降低类胡萝卜素和番茄红素含量，说明可以通过调控SlZFP2的表达量来提高果实的番茄红素等类胡萝卜素物质含量。
3、T1代转基因番茄植株株型(转化LA1589)和果实成熟
观察pWL007转化LA1589的转化植株(102、103、104、105)分离出来的T1代转基因和非转基因植株(NonTrans)；对SlZFP2转基因在pWL007转化植株叶片中的表达情况进行分析；检测转基因植株叶片中的SlZFP2蛋白水平；观察pWL007转化LA1589的转化植株在T1代时的株高、分枝数、开花时间和果实成熟的表型统计。
结果如图9，说明过量表达SlZFP2的番茄LA1589转基因植株具有明显分枝数目的增加，植株变矮，开花时间提前，以及果实成熟明显推迟，且存在剂量效应，即纯合的转基因植株效果更明显。
4、T2代转基因番茄植株株型(转化LA1589)和果实成熟
观察pWL007转化LA1589的转化植株(SlZFP2(pWL007))过表达T2代株系(102、103、104、105)果实成熟变化，株高，分枝数目的变化，果实大小和种子数目。结果如图10，说明与非转基因对照(NonTrans)相比，过量表达SlZFP2的LA1589转基因第二代植株果实成熟推迟5-10天，植株高度明显降低和分枝数增加，有些株系的果实重量有所降低。
5、LA1589中过量表达SlZFP2改变番茄植株叶片大小和侧芽生长
观察pWL007转化LA1589的转化植株的叶片和侧芽，结果发现过量表达SlZFP2导致叶片变小、侧芽休眠性降低，如图11。
6、番茄M82的SlZFP2过量表达植株表型
观察pWL007转化M82的转基因植株的表型，进行半定量RT-PCR基因表达分析(B)，将植株果实的横切观察横切面，转基因植株(灰色柱形)与非转基因对照(黑框白底柱形)的果实重量比较。结果如图12，在栽培番茄品种M82中过 量表达SlZFP2导致植株分枝明显增加(A)，并影响果实中种子的形成，产生无籽或种子少的果实(C-D)。
7、不含HA标签的SlZFP2过量表达植株表型
构建不含HA标签的过表达载体p35:SlZFP2，由SlZFP2全长cDNA序列克隆到pHX20上的35S启动子和Nos终止子之间(利用内切酶BamHI/SalI连接到启动子和终止子之间)。质粒p35S:SlZFP2通过农杆菌介导导入番茄LA1589。
结果如图13，说明番茄LA1589中过量表达不含HA标签的转基因植株也能够明显增加植株分枝数目和使得植株提前开花。
8、SlZFP2转基因植株的嫁接实验
番茄SlZFP2过量表达植株与非转基因植株之间的嫁接实验结果如图14，表明SlZFP2过量表达导致的分枝数目增加主要是通过影响地上部分，即侧芽的形成，而与地下部分没有明显关系，说明SlZFP2过量表达可以减弱了侧芽的休眠，促进侧芽的生长。103嫁接到103后，接穗生长恢复很慢，所以虽然仍具有103叶片较小的表型，但分枝数目不如未经嫁接和嫁接到非转基因砧木的植株。
9、抑制SlZFP2表达对番茄生长和果实发育的影响
RNAi干扰载体pWL009分别导入了番茄LA1589和M82。结果如图15，分枝数和开花时间统计于45天左右植株，每个株系比较了分离自同一转基因T0植株的3个转基因和3个非转基因植株。发芽率统计了7天内各个材料的出芽数目，平均萌发率是在PCR鉴定确定基因型(是否含有转基因)后种子平均发芽所需天数。同时比较了第6天时各个株系中含有转基因(pWL009)和不含转基因的发芽种子数目。因RNAi植株坐果困难，种子数目很少，每个株系仅分析了15-20粒。结果说明，通过RNAi方法抑制番茄LA1589和M82中SlZFP2基因表达，减少植株分枝数目和延迟种子的萌发速率，但对开花时间果实大小没有影响。
10、SlZFP2促进开花基因SFT的在不同组织中的表达
在番茄LA1589中过量表达SlZFP2基因，观察开花基因SFT在花、发育 果实(授粉后5和10天)以及成熟绿果(果实达到最终大小，将进入成熟阶段的绿色果实)中表达情况。结果如图17，过量表达SlZFP2基因降低与SFT结合的SPGB基因表达，SPGB在番茄ABA合成突变体not、sitflc和开花突变体sft(各突变体均获自美国番茄遗传资源中心TGRC)中表达也低于野生型，说明SlZFP2调控SFT和SPGB的表达是通过ABA合成途径。
实施例4、SlZFP2发挥调控作用的机理研究
1、基因调控脱落酸(ABA)合成的机理
分析SlZFP2过量表达和抑制表达的植株，研究SlZFP2发挥调控作用的机理。如图5，表明过量表达SlZFP2导致叶片气孔变大，种子萌发速率提高，减少花和果实等组织中的ABA含量，ABA合成酶基因在过量表达植株叶片中的表达降低，而通过RNAi干扰SlZFP2的表达，则降低了花组织中ABA合成酶基因SIT和FLC的表达，SlZFP2通过结合ABA合成酶基因SlAO1等基因的启动子上负调控ABA的合成。
分析SlZFP2过量表达和抑制表达的植株，研究SlZFP2基因调控植株开花的机理。结果如图6。表明过量表达SlZFP2导致番茄开花提前，SlZFP2促进植株开花是通过直接结合在SFT启动子区增加SFT的表达。
2、过量表达SlZFP2对叶片ABA含量的影响
比较SlZFP2转基因LA1589番茄植株叶片的气孔，分析ABA处理(萌发20天左右叶片，取下后正面朝上，放在含5mM KCl、50μM CaCl2、10mMMES-Tris(pH6.15)培养液中，在人工气候室光照条件下培养2小时，使气孔开启，然后将叶片放入含不同浓度(0，1.0，2.5，5.0μM)ABA的培养液中，继续放置2小时，然后覆膜，电镜观测，测量气孔大小，观察不同浓度的ABA对转基因植株气孔关闭的影响)叶片对气孔开闭的影响，及ABA对三个SlZFP2转基因LA1589植物种子发芽的影响。结果如图16，表明转基因叶片气孔比非转基因植株叶片气孔大(A)，且对ABA更不敏感(B)，过量表达植株上收获的种子在发芽时对ABA的敏感性也有所降低(C)。
3、过量表达SlZFP2对叶片ABA含量的影响
测定过量表达SlZFP2对叶片ABA含量的影响，ABA的测定方法见图5 说明。结果如图19，在番茄LA1589中过量表达SlZFP2降低叶片中的ABA含量，尤其是老叶片中的ABA。材料为pWL007转LA1589的纯合转基因植株，取样时非转基因植株有17片可见叶，转基因植株有12片可见叶，均为播种后45天植株。
4、SlZFP2参与调控ABA合成酶基因的表达水平
通过qRT-PCR定量分析各个ABA合成酶基因在LA1589的SlZFP2转基因植株叶片中的表达情况，结果如图20。材料和方法与图5E一致，为同一批次实验结果，图5E仅示部分基因在其中一个时期(转基因的L6和非转基因的L10)数据。结果表明，番茄LA1589的SlZFP2过量表达植株中，ABA合成酶基因NOT、SIT、SlAO1、SlAO2和FLC在不同发育时期叶片中的表达表现不同程度的下降，与此对应的是ABA运输载体SlABCG40基因的表达也受到抑制。
5、抑制SlZFP2基因在番茄中的表达对ABA合成、转运和响应基因的表达影响
研究ABA合成、转运和响应相关基因在几个RNAi(pWL009)转化株系花的表达水平。结果如图21，通过RNAi方法抑制番茄LA1589中的SlZFP2表达，对ABA合成酶基因NOT和SlAO1的表达影响不明显，主要影响SIT和FLC的表达，对ABA转运载体SlABCG40的表达也影响不明显，但ABA响应基因Le16和Le25则明显上升。
实施例5、SlZFP2对于水稻的性状的影响
将质粒pWL007导入水稻品种中花11，水稻转化参见参考文献Hiei，Y.，et al.，Plant J，1994.6(2):p.271-82。
转基因植株T0代开花期的分蘖数目统计结果如图18所示。10个独立转化株系在转基因当代均表现为分蘖数增加。
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