技术领域
本发明属于诊断领域，具体涉及CST1mRNA和CST4mRNA或其编码的蛋白质Cystatin SN和Cystatin S在制备肾癌标志物中的应用，还涉及诊断肾癌的试剂盒。
背景技术
肾细胞癌(简称肾癌)在成人恶性肿瘤中约占2％-3％，是我国第二常见的泌尿系统恶性 肿瘤，仅次于膀胱癌。手术切除是局限性肾癌最有效的治疗方法，但是很多患者最终仍会复 发。绝大部分肾癌早期无临床症状，一些患者初诊断时已局部进展或远处转移，无法通过手 术根治性切除，且这部分患者预后不佳。所以，对肾癌的早期诊断变得尤为必要。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin SN和Cystatin S是人类Cystatin家族成员，分别由CST1 基因和CST4基因编码，在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移起重要作用，可作为肿瘤诊 断和预后估计的标志物。公开号为103667444A中国发明专利中，公开了CystatinSN(CST1)， CystatinS(CST4)在正常组织中不表达，而在胰腺癌患者组织中高度表达，两组结果差异非 常明显，可以胰腺癌相关的肿瘤标记物，并且诊断胰腺癌方面具有非常高的特异性、准确率 和应用价值。但迄今为止，未见CystatinSN(CST1)和CystatinS(CST4)与肾癌相关性的 报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供CST1mRNA和CST4mRNA在制备诊断和预示 肾癌标志物中的联合应用，通过CST1mRNA和CST4mRNA联合检测，提高诊断和预示肾 癌的特异性；本发明的目的之二在于提供CST1mRNA和CST4mRNA联合检测试剂盒，该 试剂盒具有特异性高，使用方便等优点；本发明的目的之三在于提供Cystatin SN和Cystatin S在制备诊断和预示肾癌标志物中的联合应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1.CST1mRNA和CST4mRNA在制备诊断和预示肾癌标志物中的联合应用，所述CST1 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
优选的，CST1mRNA和CST4mRNA联合应用的判断公式为 P＝exp(-1.715+0.004a+0.001b)/[1+exp(-1.715+0.004a+0.001b)]，其中a＝CST1mRNA浓度， b＝CST4mRNA浓度。
优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
2、CST1mRNA和CST4mRNA联合检测试剂盒，包括CST1mRNA和CST4mRNA的 定量检测试剂；所述CST1mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的 检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的TaqMAN探针；所述CST4mRNA定量检测 试剂包括如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22 所示的TaqMAN探针。
优选的，所述试剂盒还包括RPN1mRNA定量检测试剂，所述RPN1mRNA定量检测 试剂包括如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.24 所示的TaqMAN探针。
优选的，所述试剂盒还包括特异捕获CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1mRNA的磁 珠，所述特异捕获CST1mRNA的磁珠上结合有如SEQ ID NO.4所示的探针，所述特异捕获 CST4mRNA的磁珠上结合有如SEQ ID NO.5所示的探针，所述特异捕获RPN1mRNA的磁 珠上结合有如SEQ ID NO.6所示的探针。
更优选的，靶序列捕获液中磁珠的浓度为500μg/mL，特异捕获探针的浓度为2μM。
优选的，所述试剂盒还包括10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、 逆转录酶和RNA酶抑制剂。
3、Cystatin SN和Cystatin S在制备诊断和预示肾癌标志物中的联合应用，编码Cystatin SN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码Cystatin S的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，Cystatin SN和Cystatin S联合应用的判断公式为 P＝exp(-6.838+0..026a+0.023b)/[1+exp(-6.838+0.026a+0.023b)]，其中a＝Cystatin SN浓度， b＝Cystatin S浓度。
优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
本发明的有益效果在于：本发明公开了诊断和预示肾癌的新标志物，即CST1mRNA 和CST4mRNA或其所编码的蛋白质，利用两个标志物联合检测的特异性和灵敏度高于使用 其中一个标志物；本发明还公开了诊断和预示肾癌标志物的试剂盒，该试剂盒使用方便，能 够直接收集尿液进行检测，不需要采集血清，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵 敏度高的特点，其诊断结果与临床诊断结果一致，在监控过程中还可以及早发现转移复发情 况，为医生提前进行干预提供指导。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为磁珠法从尿液中特异性富集mRNA原理图。
图2为特异性探针和非特异性探针富集CST1基因比较结果。
图3为特异性探针和非特异性探针富集CST4基因比较结果。
图4为特异性探针和非特异性探针富集RPN1基因比较结果。
图5为肾癌组织与癌旁组织CST1相对表达量的比值结果图(C/T表示肾癌组织/癌旁组 织)。
图6为肾癌组织与癌旁组织CST4相对表达量的比值结果图(C/T表示肾癌组织/癌旁组 织)。
图7为CST1绝对定量标准曲线。
图8为CST4绝对定量标准曲线。
图9为受试者CST1基因和CST4基因联合检测ROC曲线。
图10为ELISA检测Cystatin SN在肾癌组织及癌旁组织表达情况(1-T和2-T表示肾癌 组织，1-N和2-N表示癌旁组织)。
图11为ELISA检测Cystatin S在肾癌组织及癌旁组织表达情况(1-T和2-T表示肾癌组 织，1-N和2-N表示癌旁组织)。
图12为Cystatin SN蛋白标准曲线。
图13为Cystatin S蛋白标准曲线。
图14为Cystatin SN和Cystatin S标志物单独检测及联合检测的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、磁珠法从尿液中特异性富集CST1、CST4和RPN1基因的mRNA
根据CST1、CST4和RPN1(核糖体结合蛋白1，ribophorin1)的mRNA序列设计捕获 CST1、CST4和RPN1基因的mRNA的特异探针(CST1mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，RPN1mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3)，具体如下：捕获CST1mRNA的探针为5’-aaagagcacaactgtttcttctgca(dA)30-3’(SEQ ID NO.4)，捕获CST4mRNA的探针为5’-taccaggtctattagaagca(dA)30-3’(SEQ ID NO.5)，捕获 内参基因RPN1mRNA的探针为5’-gatgagcttctcattctcaatgtacg(dA)30-3’(SEQ ID NO.6)。上 述特异探针能够与磁珠(GE，货号为3815-2103-010150)的olig(dT)互补结合，得结合特 异探针的磁珠。
富集CST1、CST4和RPN1基因的mRNA，具体步骤如下：将新鲜尿液与样本运输保 存液按照体积比为2：1的比例混合，得处理后的尿液样本，该处理后的尿液样本4℃条件下 可保存一周，-20℃条件下可保存1年；然后分别将200μL含有磁珠的靶序列捕获液加入到 200μL处理后的尿液中，于75℃条件下处理5分钟；涡旋混匀后，室温静置15分钟；然后 将样品置于磁性分离器上，5分钟后，吸弃上清，加入1mL漂洗液，涡旋混匀，上磁性分离 器，5分钟后，吸弃上清；最后室温(18～25℃)静置5分钟，加入洗脱液20μL，枪头吹打 混匀，上磁力架5分钟，将上清转移至新的EP管中，富集原理如图1所示。
富集过程中，样品运输保存液中各组分浓度如下：110mM LiDS(十二烷基硫酸锂)， 10mM NaH2PO4，10mM Na2HPO4，5mM EDTA，7mM EGTA，pH7.5；靶序列捕获液中各组 分浓度如下：135mM HEPES，1.25M LiCl，110mM LiOH，10mM EDTA，pH7.0，500μg/mL 磁珠，2μM捕获探针；漂洗液中各组分浓度如下：100mM HEPES，350mM NaCl，10mM NaOH， 2mM EDTA，3％乙醇，0.2％羟基甲酯，0.1％羟基丙酯，0.1％SDS，pH7.5；洗脱液中各组 分浓度如下：20mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA。
同时以非特异性探针oligo(dT)以上述相同的方法非特异性富集mRNA。
将上述富集获得的mRNA通过定量PCR分别检测CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1 mRNA的相对含量，检测所使用的引物如下：
CST1检测引物：上游引物：5’-agagccaggcaacagacc-3’(SEQ ID NO.7)
下游引物：5’-gttcatggaaggcacagg-3’(SEQ ID NO.8)
CST4检测引物：上游引物：5’-atgaacagccagaactgca-3’(SEQ ID NO.9)
下游引物：5’-caagaaggaaggagggag-3’(SEQ ID NO.10)
RPN1检测引物：上游引物：5’-gtgcgacagagtgagcgaaat-3’(SEQ ID NO.11)
下游引物：5’-tgagcttgccagccaccag-3’(SEQ ID NO.12)
然后构建如下检测体系：SYBR Green2×Mix10μL(购于东洋纺(上海)生物科技有限公 司)，终浓度分别为250nM的上游引物和下游引物，模板2μL，加ddH2O将体积补充至20μL。
并按如下条件检测：先预变性5分钟，然后在95℃变性10秒、60℃退火15秒、72℃ 延伸20秒，进行45个循环；最后熔解：95℃，1分钟；40℃，1分钟；65℃，1秒；95℃， 1分钟，冷却50℃，30sec。
同时以oligo(dT)非特异性富集的mRNA为对照，检测引物、体系和检测条件按上述 方法进行，然后比较CST1、CST4和RPN1基因mRNA CP值(Cross Point)，结果如图2-4 所示。
由图2-4可知，使用特异探针富集到的CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1mRNA的 CP值更小，表明其富集的浓度更高，具有背景低，信噪比高的特点，优于使用非特异探针 富集的mRNA。
实施例2、检测CST1和CST4在肾癌组织中表达情况
从上海第五人民医院泌尿外科收集肾癌、癌旁配对组织样本30例，切至米粒大小，放 至RNAlater保存液中-80℃贮存，使用前平衡至室温。然后按照实施例1的方法分别富集肾 癌和癌旁配对组织的CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1mRNA，再分别以CST1检测引物、 CST4检测引物和内参基因RPN1检测引物检测30例样本肾癌和癌旁配对组织中CST1基因 和CST4基因相对表达量，检测体系和检测条件与实施例1相同。检测结果采用2-ΔΔCP法计 算相对表达量，然后统计肾癌与癌旁配对组织相对表达量的比值(C/N)，统计结果如图5 和图6所示。由图5和图6可知，CST1基因和CST4基因在肾癌组织中明显上调，明显高 于癌旁组织的表达量，上述结果预示检测CST1mRNA和CST4mRNA含量可以用于诊断肾 癌。
实施例3、构建肾癌检测试剂盒
1、构建CST1重组质粒
以肾癌细胞株A498为材料提取肾癌细胞株T24总mRNA，然后以提取的mRNA为模 板合成cDNA，并根据CST1基因序列设计构建CST1重组质粒的引物，上游引物为 5’-ctggagccccaaggagga-3’(SEQ ID NO.13)，下游引物为5’-accagtccaggggtggga-3’(SEQ ID NO.14)，以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行 PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1 分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建 CST1重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CST1重组质粒用甘油保种，作为检测 CST1基因的标准品。
2、构建CST4重组质粒
根据CST4基因序列设计构建CST4重组质粒的引物，上游引物为5’-tctgaggagaccatggcc-3’ (SEQ ID NO.16)，下游引物为5’-tgtaccaggtctattagaagcaag-3’(SEQ ID NO.17)，然后以SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为： 94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环； 72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CST4重组质粒，并将重 组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。该序列与 理论扩增子序列相同，然后将CST4重组质粒用甘油保种，作为CST4基因的标准品。
分别将CST1重组质粒和CST4重组质粒，通过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切线性化目标序 列，割胶回收得到纯的线性化片段。使用体外转录试剂盒，以线性化的序列为模板，在T7RNA 聚合酶的作用下，制备得到RNA，经RNA纯化试剂盒纯化后，得到RNA标准品贮液，测 定浓度。经Agilent2100作RNA完整性分析，电泳图谱显示除目标序列外无其他明显的杂带 及RNA降解带，则可以作为RNA标准品贮液，以备下游使用。
实施例4、绘制CST1和CST4的标准曲线
将实施例3获得的mRNA标准品作如表1和表2的梯度稀释，具体如下：
表1、CST1RNA标准品稀释梯度
标准品编号 浓度(copy/μL) STD1 100000 STD2 10000 STD3 1000 STD4 100
表2、CST4RNA标准品稀释梯度
标准品编号 浓度(copy/μL) STD1 100000 STD2 10000 STD3 1000 STD4 100
设计定量检测CST1基因和CST4基因的引物和探针，具体如下：
CST1定量检测引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，扩增子序列如SEQ ID NO.19 所示，探针为：FAM-5’-tacttcttcgacgtagaggtgggcc-3’-TAMRA(SEQ ID NO.20)；
CST4定量检测引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，扩增子序列如SEQ ID NO.21 所示，探针为FAM-5’-aacagttgtgctctttcgagatcta-3’-TAMRA(SEQ ID NO.22)。
RPN1定量检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，扩增子序列如SEQ ID NO.23所示，探针为FAM-5’-tggtgctgaagtcggcggtggaggct-3’-TAMRA(SEQ ID NO.24)。
然后采用一步法RT-PCR分别表1和表2中CST1mRNA和CST4mRNA的浓度，检测 体系为2μL10×Buffer，3μL2.5mM dNTP，2μL25mM MgCl2，0.75μL浓度为10μm的CST1 或CST4的上、下游引物，0.5μL浓度为10μm的SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.22探针，DMSO 分析纯1μL；10mMDTT1μL；0.1μLRoche HS TAQ(货号12032953001)，0.1μL UDG(购自 NEB公司，货号EN0362)；0.1μL逆转录酶和0.1μL RNA酶抑制剂(其成分使用Thermo逆 转录试剂盒，货号K1622)，灭菌纯化水8.6μL，反应条件为：37℃，5分钟；50℃，15分钟； 94℃，5分钟；94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，最后50℃冷却30秒，然后根据检测 结果绘制标准曲线，结果如图7和图8所示。由图7和图8可以看出，CST1和CST4定量 检测引物特异性好，在100～100000copy/μL范围内且相关性好，R2>0.99。
实施例5、CST1或/和CST4基因检测的特异性和灵敏度
从北京协和医院泌尿科收集尿液样本100例，其中肾癌患者尿液50例，肾炎症等良性 病变患者尿液50例。按照实施例1的方法分别富集CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1 mRNA，然后按实施例4的一步扩增法对富集RPN1mRNA的样本进行检测，以RPN1扩增 曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于结果分析。分析结果显示100例样本中可用 样本97例，肾癌49例，良性病变48例。再继续用实施例4的一步扩增法检测97例可用样 本的CST1mRNA和CST4mRNA含量，其检测方法与实施例4相同。然后根据检测结果绘 制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，如图9所示。结果显示，CST1基因和CST4基因单独 检测时，曲线下面积分别为0.809和0.711，应用Logistic回归统计方法得出CST1mRNA和 CST4mRNA联合检测的判断公式：P＝exp(-1.715+0.004a+0.001b)/[1+ exp(-1.715+0.004a+0.001b)]，(a＝CST1mRNA浓度，b＝CST4mRNA浓度)，当P大于或等于 0.75，为阳性；当P小于0.75，为阴性，联合诊断的曲线下面积为0.813。因此，采用CST1 与CST4联合检测肾癌的特异性更高。为了获得更高的特异性，将CST1mRNA和CST4 mRNA作为诊断肾癌的标志物，并以此构建CST1和CST4联合检测试剂盒，其包括如下组 分：
CST1mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
CST4mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
RPN1mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
还包括定量检测的其他常规试剂，包括：10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq 酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂以及磁珠法富集CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1 mRNA的试剂。
实施例6、CST1和CST4联合检测试剂盒诊断肾癌
从上海市第五人民医院收集肾癌尿液样本30例，良性病变样本30例。将尿液采用实施 例1的方法富集CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1mRNA，以RPN1扩增曲线呈现“S” 型，且CP值小于35的样本采用CST1与CST4联合检测试剂盒检测CST1mRNA和CST4 mRNA相对表达量，并根据CST1和CST4联合检测的判断公式判断阳性和阴性，同时根据 临床分析诊断，结果如表3所示。
表3、CST1和CST4联合检测试剂盒诊断肾癌结果
用χ2统计检测结果与临床诊断结果相关性，结果显示，P＜0.05，表明CST1和CST4 联合检测肾癌与临床诊断结果有相关性，且一致性较好，Kappa值为86.7％。
实施例7、CST1和CST4联合检测试剂盒评估肾癌疗效
从江苏省肿瘤医院取10例肾癌患者治疗前尿液，用实施例1的方法富集CST1mRNA、 CST4mRNA和RPN1mRNA，以RPN1扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于检 测尿液中CST1mRNA和CST4mRNA的浓度，治疗结束后再取患者尿液，用实施例1的方法 富集CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1mRNA后检测CST1mRNA和CST4mRNA浓度。然 后利用CST1和CST4联合检测的判断公式P＝exp(-1.715+0.004a+0.001b)/[1+ exp(-1.715+0.004a+0.001b)](a代表CST1浓度，b代表CST4浓度)计算P值，然后根据治疗前 和治疗后P值变化评估疗效，判断标准为：P值与治疗前相比下降小于30％，判断为治疗无效； P值与治疗前相比下降大于或等于30％，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降大于或等于 70％，判断为治疗效果显著，其评估结果如表4所示，同时根据临床症状评估疗效，结果如表 4所示。
表4、CST1和CST4联合检测试剂盒评估肾癌疗效结果
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评价 1 下降6％ 无效 2 升高5％ 疗效显著 3 降低69％ 改善 4 降低53％ 改善 5 升高9％ 无效 6 降低70％ 疗效显著 7 降低48％ 改善 8 降低40％ 无效 9 降低18％ 无效 10 降低35％ 改善
由表4可知，使用CST1和CST4联合检测试剂盒对10例肾癌患者疗效评估结果是有1例疗 效显著，5例治疗后病情得到改善，其余4例无疗效。而临床诊断结果为2例疗效显著，4例治 疗后病情得到改善，其余4例无疗效。因此采用CST1和CST4联合检测的判断结果与临床判断 结果一致性达90％。
实施例8、CST1和CST4联合检测试剂盒监控肾癌转移复发
对6例疗程结束后的肾癌早期患者进行跟踪随访，治疗后6周首次取尿液，将尿液用实 施例1的方法富集CST1mRNA、CST4mRNA和RPN1mRNA，以RPN1扩增曲线呈现“S” 型，且CP值小于35的样本用于检测尿液中CST1和CST4mRNA浓度，以后每三个月检测 一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果，利用联合检测的判断公式 P＝exp(-1.715+0.004a+0.001b)/[1+exp(-1.715+0.004a+0.001b)](a代表CST1浓度，b代表CST4 浓度)计算P值，当P大于或等于0.75时，为转移复发；当P小于0.75时，表明未发生转 移复发，为无进展生存，其结果如表5所示；同时根据临床症状监控肾癌转移复发情况，结 果如表5所示。
表5、CST1和CST4联合检测试剂盒监控肾癌移转复发情况
患者编号 6周 3个月 6个月 9个月 临床评价
1 0.13 0.15 0.11 0.10 无进展生存 2 0.26 0.42 0.58 0.77 转移复发 3 0.58 0.61 0.66 0.85 转移复发 4 0.39 0.45 0.50 0.55 无进展生存 5 0.41 0.33 0.55 0.65 无进展生存 6 0.24 0.26 0.29 0.27 无进展生存
由表5可知，在跟踪第9个月时6例患者中有2例出现转移复发，其余4例未发生转移复发， 为无进展生存，与临床评价结果一致，但是在监控过程中CST1和CST4联合检测能够预测肾 癌移转复发的趋势，可以为医生提前进行干预提供指导。
综上所述，CST1mRNA和CST4mRNA可以联合应用，作为诊断和预示肾癌的标志物， 并且同时检测CST1mRNA和CST4mRNA2个标志物的灵敏度和特异性高于检测单一标志 物，能够提高诊断的准确性。
实施例9、构建Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒
为探究肾癌组织中Cystatin SN和Cystatin S的表达情况，构建检测Cystatin SN和Cystatin S 的ELISA检测试剂盒。试剂盒中抗Cystatin SN单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为： MAB1285)；兔抗人Cystatin SN多克隆抗购自北京义翘神州生物技术有限公司；抗Cystatin S 单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为：MAB1296)；兔抗人Cystatin S多克隆抗(货号为： 11542-RP02)，购自北京义翘神州生物技术有限公司，其各组分及其浓度如表6所示。
表6、检测Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒
实施例10、Cystatin SN和Cystatin S在肾癌组织中的表达情况
取2例肾癌及配对的癌旁组织样本，进行15％的SDS-PAGE。电泳完毕后，将蛋白电转移 至硝酸纤维素膜上，用含有质量分数为5％的脱脂奶粉和质量分数为0.1％Tween-20的PBS于 室温(18-25℃)下封闭2小时，分别加入抗Cystatin SN单克隆抗体和抗Cystatin S单克隆抗体 于4℃温育过夜，用含有0.15％Tween-20的PBS洗涤3次，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标 记的山羊抗兔IgG于37℃温育1小时，用含有0.15％Tween-20的PBST洗涤4次，再用PBST洗涤 1次，之后用TMB过氧化物酶底物显色检测。同时以β-actin为内参蛋白，按照上述方法进行 检测，结果分别如图10和图11所示。结果表明，在肾癌组织中Cystatin SN和Cystatin S表达量 高于癌旁组织中的表达量。
实施例11、Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒的特异性和灵敏度评价
将构建的Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒分别检测浓度为0pg/mL，50 pg/mL，100pg/mL，250pg/mL，500pg/mL和1000pg/mL的Cystatin SN蛋白和Cystatin S蛋白， 并在450nm条件下检测OD值，然后根据检测结果绘制标准曲线，Cystatin SN蛋白标准曲线如 图12所示，Cystatin S蛋白标准曲线如图13所示。由图12和图13可知，Cystatin SN和Cystatin SN的ELISA检测试剂盒的线性范围为50～1000pg，在线性范围内相关系数r≥0.990。
利用Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒对北京协和医院泌尿科收集尿液样本 100例，其中肾癌患者尿液50例，肾炎症等良性病变患者尿液50例。应用Cystatin SN和Cystatin S ELISA检测试剂盒进行检测，根据检测结果进行Logistic回归统计分析，给出联合检测的判 断公式：具体为：P＝exp(-6.838+0..026a+0.023b)/[1+exp(-6.838+0..026a+0.023b)]，(a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度)，并根据P值判断是否患病，当P大于或等于0.75为阳性；当P小 于0.75为阴性。根据检测结果绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，结果如图14所示。结果 显示Cystatin SN和Cystatin S标志物单独检测曲线下面积分别为0.902和0.876，及联合检测的 检测曲线下面积为0.983。由此可知，利用Cystatin SN和Cystatin S为标志物联合检测的效果更 优。
实施例12、Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒诊断肾癌
从上海市第五人民医院收集肾癌尿液样本30例，良性病变样本30例。应用Cystatin SN和 Cystatin S ELISA检测试剂盒检测上述60例样本，然后根据Cystatin SN和Cystatin S联合检测的 判断公式P＝exp(-6.838+0..026a+0.023b)/[1+exp(-6.838+0..026a+0.023b)](a＝Cystatin SN浓度， b＝Cystatin S浓度)计算P值，根据P值判断阳性和阴性，同时根据临床诊断，结果如表7所示。
表7、Cystatin SN和Cystatin S联合诊断肾癌结果
利用χ2统计Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒诊断结果与临床诊断结果的相关性， 结果显示P＜0.05，表明Cystatin SN和Cystatin S联合诊断肾癌与临床诊断结果有相关性，且一 致性较好，Kappa值为93.3％。
实施例13、Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒用于肾癌疗效评估
从江苏省肿瘤医院取10例肾癌患者治疗前尿液，检测尿液中Cystatin SN蛋白和Cystatin S 蛋白浓度，治疗结束后再取患者尿液检测CystatinSN蛋白和Cystatin S蛋白浓度。利用Cystatin SN和Cystatin S联合检测的判断公式P＝exp(-6.838+0..026a+0.023b)/[1+ exp(-6.838+0..026a+0.023b)](a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度)计算P值，然后根据治 疗前和治疗后P值评估疗效，判断标准为：P值与治疗前相比下降小于30％，判断为治疗无效； P值与治疗前相比下降大于或等于30％，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降大于或等于 70％，判断为治疗效果显著，其评估结果如表8所示；同时根据临床症状评估其疗效，结果如 表8所示。
表8、CystatinSN和Cystatin S联合评估肾癌疗效
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评价 1 下降41％ 改善 2 升高3％ 无效 3 升高7％ 无效 4 降低70％ 疗效显著 5 升高15％ 无效 6 降低50％ 改善 7 降低42％ 改善 8 降低60％ 改善 9 降低49％ 无效 10 降低90％ 疗效显著
由表8可知，使用Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒对肾癌疗效评估结果是10例患 者中，有2例疗效显著，5例治疗后病情得到改善，其余3例无疗效，而临床诊断结果是10例 患者中，有2例疗效显著，有4例患者病情得到改善，其余4例无治疗效果。因此，使用Cystatin SN/Cystatin S蛋白联合检测试剂盒与临床判断结果一致。
实施例14、Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒用于肾癌转移复发监控
对6例疗程结束后的肾癌早期患者进行跟踪随访，治疗后6周首次取尿液，并检测尿液 中Cystatin SN和Cystatin S蛋白浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。 根据检测结果，Cystatin SN和Cystatin S联合检测的计算公式 P＝exp(-6.838+0..026a+0.023b)/[1+exp(-6.838+0..026a+0.023b)](a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度)计算P值，当P大于或等于0.75时，为转移复发；当P小于0.75时，表明未发生 转移复发，为无进展生存，其结果如表9所示，并于9个月时根据临床症状监控其转移复发 情况，其结果如表9所示。
表9、Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒监控肾癌移转复发结果
患者编号 6周 3个月 6个月 9个月 临床评价 1 0.31 0.30 0.35 0.40 无进展生存
2 0.25 0.27 0.38 0.44 无进展生存 3 0.45 0.56 0.67 0.87 转移复发 4 0.43 0.43 0.37 0.56 无进展生存 5 0.32 0.41 0.59 0.71 转移复发 6 0.29 0.33 0.49 0.46 无进展生存
由表9可知，Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒监控结果是6例患者中有2例出现转 移复发，其余4例未发生转移复发，为无进展生存，与临床判断结果一致。但是在监控过程 中Cystatin SN和Cystatin S联合检测能够预测肾癌移转复发的趋势，可以为医生提前进行干预 提供指导。
综上所述，Cystatin SN和Cystatin S联合可以作为诊断和预示肾癌的标志物，同时检测2 个标志物的灵敏度和特异性高于检测单一标志物，能够提高诊断的准确性。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。