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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710948012.0 (22)申请日 2017.10.12 (71)申请人 临沂大学 地址 276000 山东省临沂市兰山区双岭路 中段临沂大学 (72)发明人 况鹏群王兆玲冯尚彩吕鑫华 赵志龙刘祁瑞 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 徐明双 (51)Int.Cl. C12P 13/00(2006.01) C07C 331/22(2006.01) (54)发明名称 一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还 原型萝 卜硫素提取物的方法 (57)摘。
2、要 本发明公开了一种利用两相体系酶解与萃 取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的方法： 新鲜 萝 卜芽苗烘干， 粉碎， 正己烷提取， 得除杂的萝 卜芽 苗微粉； 加入正己烷预分散； 完成后加入磷酸盐 缓冲溶液， 酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素； 调节溶液pH值， 静置； 加入无水硫酸钠， 脱水处 理； 减压蒸馏， 得还原型萝 卜硫素提取物。 本发明 的方法不仅可快速高得率的酶解获得还原型萝 卜 硫素提取物， 而且具有高萃取率、 高稳定性的特 点， 显著提高还原型萝 卜硫素提取物的总体制备 工艺收率， 大幅降低还原型萝 卜硫素的生产成本， 避免了二氯甲烷、 氯仿等高毒性有机溶剂的使 用， 对环境。
3、无污染， 特别适合工业化生产制备还 原型萝 卜硫素提取物。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 107630051 A 2018.01.26 CN 107630051 A 1.一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的方法， 其特征在于， 是由以下步骤制得的： 1） 取新鲜萝 卜芽苗， 烘干， 得干燥萝 卜芽苗； 将干燥萝 卜芽苗粉碎， 得萝 卜芽苗微粉； 2） 将萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取， 加入正己烷， 在提取温度15- 55和分散盘转速50-500rpm条件下， 分散提取0.5-3h； 提取完成后静置8-12h， 减压过滤或 离心， 得微粉； 。
4、重复分散提取1-5次， 得除杂的萝 卜芽苗微粉； 3） 将除杂的萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中， 加入正己烷， 在温度15-35和 分散盘转速50-500rpm条件下， 预分散5-30min； 预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液， 酶解与 萃取偶联制备还原型萝 卜硫素30-180min； 反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至1.0- 2.5， 静置1-5h； 充分收集正己烷相， 加入无水硫酸钠， 在转速为50-500rpm条件下， 脱水处理 1-5h； 在温度为30-50条件下， 减压蒸馏回收正己烷， 得还原型萝 卜硫素提取物。 2.根据权利要求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制。
5、备还原型萝 卜硫素提取物的 方法， 其特征在于， 所述步骤1） 中， 新鲜萝 卜芽苗的发芽和生长总时间为7-15天， 培养大棚温 度为15-35， 湿度为65-85%。 3.根据权利要求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的 方法， 其特征在于， 所述步骤1） 中， 烘干的温度为40-60； 干燥萝 卜芽苗的含水量为0.5-5%； 萝 卜芽苗微粉的粒径为150-550 m。 4.根据权利要求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的 方法， 其特征在于， 所述步骤2） 中， 萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 5-30L。 5.根据权利要。
6、求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的 方法， 其特征在于， 所述步骤3） 中， 除杂的萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 3-25L； 除杂的萝 卜芽苗微粉质量： 磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg： 3-25L； 无水硫酸钠质量： 正己烷 体积之比为0.01-0.15kg： 1L。 6.根据权利要求5所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的 方法， 其特征在于， 所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02-0.2mol/L、 pH值为3.0-7.0、 维生素C 含量为0-1.5mmoL/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107630051。
7、 A 2 一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取 物的方法 技术领域 0001 本发明属于生物化工技术领域， 具体涉及一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备 还原型萝 卜硫素提取物的方法。 背景技术 0002 研究表明， 萝 卜具有很好的抗癌、 防癌效果， 长期大量食用萝 卜的人群的癌症发病率 明显低于不食用或少量食用萝 卜的人群， 原因在于萝 卜中富含硫代葡萄糖苷类化合物。 其能 被萝 卜自身的黑芥子酶催化酶解， 再经分子内重排， 最终生成具有显著抗癌、 防癌效果的异 硫氰酸酯类化合物。 萝 卜中主要富含两种硫代葡萄糖苷类化合物 （氧化型萝 卜硫苷， Glucoraphenin；。
8、 还原型萝 卜硫苷， Glucoraphasatin） ， 其中， 萝 卜芽苗中主要富含的硫代葡萄 糖苷类化合物为还原型萝 卜硫苷， 其经萝 卜芽苗自身富含的黑芥子酶催化酶解， 再经分子内 重排反应， 最终转化生成还原型萝 卜硫素 （Raphasatin， 分子式为C6H9NS2） 。 还原型萝 卜硫素的 化学结构式如下： 据相关研究报道， 还原型萝 卜硫素具有很好的抗癌、 防癌效果， 其抗癌与防癌作用机制 为：（1） 显著诱导相解毒酶的表达， 促使人体快速代谢并排泄机体内积聚的大量致癌物 质；（2） 显著诱导多种癌细胞的快速凋亡；（3） 显著诱导多种癌细胞增殖周期的停滞；（4） 有 效抑制多。
9、种癌细胞的增殖， 并杀死癌细胞；（5） 有效抑制幽门螺杆菌的增殖， 并杀死幽门螺 杆菌， 从而高效预防胃癌的形成。 另外， 还原型萝 卜硫素还具有很好的抗氧化、 抗菌、 抗突变 等药理活性。 0003 近几年来， 随着国内外对还原型萝 卜硫素抗癌防癌及其它药理活性研究的不断深 入， 富含还原型萝 卜硫素相关产品越来越受到人们的关注， 对还原型萝 卜硫素提取物的需求 也在不断增加， 现有的还原型萝 卜硫素生产制备方法已经难以满足市场的需求。 现有的还原 型萝 卜硫素制备方法有化学合成法和黑芥子酶酶解法。 化学合成法可以大量获得还原型萝 卜 硫素， 且为外消旋体， 但从萝 卜芽苗中制备获得的天然还。
10、原型萝 卜硫素为左旋体， 且产品中高 毒性的有机溶剂残留量较高， 很难满足保健食品和药品的要求。 黑芥子酶酶解法可以从萝 卜 根茎和萝 卜芽苗中制备获得还原型萝 卜硫素， 但现有的制备方法效率低、 还原型萝 卜硫素得率 低、 生产成本高， 不适合工业化生产。 另外， 现有的黑芥子酶酶解法需要大量的水溶液反应 体系， 但还原型萝 卜硫素对水分子非常敏感， 水分子可快速攻击还原型萝 卜硫素分子中的异 硫氰酸基团， 导致酶解生成的还原型萝 卜硫素快速降解， 进一步增加了还原型萝 卜硫素的生 产制备难度。 发明内容 说明书 1/5 页 3 CN 107630051 A 3 0004 本发明提供了一种高。
11、萃取率、 高稳定性的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原 型萝 卜硫素提取物的方法。 0005 本发明的目的是通过如下技术方案实现的： 一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的方法， 是由以下步骤 制得的： 1） 取新鲜萝 卜芽苗， 烘干， 得干燥萝 卜芽苗； 将干燥萝 卜芽苗粉碎， 得萝 卜芽苗微粉； 本发明的烘干温度可显著降低新鲜萝 卜芽苗的水含量， 并显著提高萝 卜芽苗中还原型萝 卜硫素的酶解底物还原型萝 卜硫苷的保留率至96.5%以上， 有效避免萝 卜芽苗干燥过程中还原 型萝 卜硫苷的降解。 0006 2） 将萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取， 加入正己烷。
12、， 在提取温度 15-55和分散盘转速50-500rpm条件下， 分散提取0.5-3h； 提取完成后静置8-12h， 减压过 滤或离心， 得微粉； 重复分散提取1-5次， 得除杂的萝 卜芽苗微粉； 正己烷分散提取可脱除萝 卜芽苗微粉中叶绿素和油脂等弱极性杂质组分， 脱除率达到 98.5%以上， 避免该弱极性杂质组分掺杂在还原型萝 卜硫素中， 显著提高产品中还原型萝 卜硫 素的纯度。 静置8-12h的目的是使萝 卜芽苗微粉充分沉降。 0007 3） 将除杂的萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中， 加入正己烷， 在温度15-35 和分散盘转速50-500rpm条件下， 预分散5-30min； 预。
13、分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液， 酶 解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素30-180min； 反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至 1.0-2.5， 静置1-5h； 充分收集正己烷相， 加入无水硫酸钠， 在转速为50-500rpm条件下， 脱水 处理1-5h； 在温度为30-50条件下， 减压蒸馏回收正己烷， 得还原型萝 卜硫素提取物。 0008 静置的目的是使正己烷相与磷酸盐缓冲溶液相充分分层， 利于正己烷相的充分收 集。 0009 所述步骤1） 中， 新鲜萝 卜芽苗的发芽和生长总时间为7-15天， 培养大棚温度为15- 35， 湿度为65-85%。 0010 所述步骤1） 中， 烘干的。
14、温度为40-60； 干燥萝 卜芽苗的含水量为0.5-5%； 萝 卜芽苗 微粉的粒径为150-550 m。 0011 所述步骤2） 中， 萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 5-30L。 0012 所述步骤3） 中， 除杂的萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 3-25L； 除杂的萝 卜芽苗微粉质量： 磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg： 3-25L； 无水硫酸钠质量： 正己烷体积之比 为0.01-0.15kg： 1L； 所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02-0.2mol/L、 pH值为3.0-7.0、 维生素C含量为0- 1.5mmoL/L。 0013 本发明采用正己烷相-磷酸。
15、盐缓冲溶液相两相体系实现酶解与萃取偶联， 即磷酸 盐缓冲溶液相为酶解体系， 使萝 卜芽苗微粉自身的黑芥子酶快速酶解其含有的还原型萝 卜硫 苷， 以获得不稳定的中间体， 该不稳定的中间体再经分子内重排生成还原型萝 卜硫素， 还原 型萝 卜硫素的酶解得率提高至35%以上； 正己烷相快速萃取磷酸盐缓冲溶液相中新生成的还 原型萝 卜硫素， 显著降低磷酸盐缓冲溶液相中还原型萝 卜硫素浓度， 从而显著阻断磷酸盐缓 冲溶液相中水分子攻击还原型萝 卜硫素分子中的异硫氰酸基团， 防止还原型萝 卜硫素快速降 解， 提高酶解体系中还原型萝 卜硫素的稳定性， 显著提高还原型萝 卜硫素的制备得率， 所得还 说明书 2/。
16、5 页 4 CN 107630051 A 4 原型萝 卜硫素提取物中还原型萝 卜硫素的含量为25%以上。 0014 本发明的方法不仅可快速高得率的酶解获得还原型萝 卜硫素提取物， 而且具有高 萃取率、 高稳定性的特点， 显著提高还原型萝 卜硫素提取物的总体制备工艺收率， 大幅降低 还原型萝 卜硫素的生产成本， 避免了二氯甲烷、 氯仿等高毒性有机溶剂的使用， 对环境无污 染， 特别适合工业化生产制备还原型萝 卜硫素提取物。 附图说明 0015 图1为本发明的制备工艺流程图。 0016 图2为本发明制得的萝 卜芽苗微粉中还原型萝 卜硫苷液相色谱图。 0017 图3为本发明实施例1制备的还原型萝 卜。
17、硫素提取物的气相色谱-质谱图。 0018 图4为本发明实施例2制备的还原型萝 卜硫素提取物的气相色谱-质谱图。 0019 图5为本发明实施例3制备的还原型萝 卜硫素提取物的气相色谱-质谱图。 具体实施方式 0020 以下结合具体实施例， 对本发明的工艺技术方案作进一步的描述。 0021 实施例1 一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的方法， 是由以下步骤 制得的： 1） 取20kg新鲜萝 卜芽苗， 烘干， 得1.31kg干燥萝 卜芽苗； 将干燥萝 卜芽苗粉碎， 得萝 卜芽苗 微粉； 所述步骤1） 中， 新鲜萝 卜芽苗的发芽和生长总时间为10天， 培养大棚温度为15， 湿度 。
18、为65%。 0022 所述步骤1） 中， 烘干的温度为40； 干燥萝 卜芽苗的含水量为5%； 萝 卜芽苗微粉的粒 径为550 m。 0023 2） 将萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取， 加入正己烷， 在提取温度 15和分散盘转速500rpm条件下， 分散提取3h； 提取完成后静置10h， 减压过滤， 得微粉； 重 复分散提取5次， 得除杂的萝 卜芽苗微粉； 所述步骤2） 中， 萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 5L。 0024 3） 将除杂的萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中， 加入正己烷， 在温度15和 分散盘转速50rpm条件下， 预分散30min； 预分散。
19、完成后加入磷酸盐缓冲溶液， 酶解与萃取偶 联制备还原型萝 卜硫素180min； 反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至2.5， 静置1h； 充分 收集正己烷相， 加入无水硫酸钠， 在转速为500rpm条件下， 脱水处理1h； 在温度为30条件 下， 减压蒸馏回收正己烷， 得21.6g还原型萝 卜硫素提取物， 其中， 还原型萝 卜硫素含量为 26.5%， 还原型萝 卜硫素的酶解得率为35.3%。 0025 所述步骤3） 中， 除杂的萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 3L； 除杂的萝 卜芽 苗微粉质量： 磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg： 3L； 无水硫酸钠质量： 正己烷体积之比。
20、为 0.15kg： 1L； 所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02mol/L、 pH值为7.0、 维生素C含量为0mmoL/L。 0026 实施例2 说明书 3/5 页 5 CN 107630051 A 5 一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的方法， 是由以下步骤 制得的： 1） 取20kg新鲜萝 卜芽苗， 烘干， 得1.27kg干燥萝 卜芽苗； 将干燥萝 卜芽苗粉碎， 得萝 卜芽苗 微粉； 所述步骤1） 中， 新鲜萝 卜芽苗的发芽和生长总时间为15天， 培养大棚温度为35， 湿度 为75%。 0027 所述步骤1） 中， 烘干的温度为50； 干燥萝 卜芽苗的含水量为3.5%。
21、； 萝 卜芽苗微粉的 粒径为350 m。 0028 2） 将萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取， 加入正己烷， 在提取温度 55和分散盘转速200rpm条件下， 分散提取0.5h； 提取完成后静置12h， 离心， 得微粉； 重复 分散提取1次， 得除杂的萝 卜芽苗微粉； 所述步骤2） 中， 萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 30L。 0029 3） 将除杂的萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中， 加入正己烷， 在温度35和 分散盘转速500rpm条件下， 预分散5min； 预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液， 酶解与萃取偶 联制备还原型萝 卜硫素90min； 反应完成后。
22、用5mol/L盐酸调节溶液pH值至1.0， 静置3h； 充分 收集正己烷相， 加入无水硫酸钠， 在转速为300rpm条件下， 脱水处理5h； 在温度为50条件 下， 减压蒸馏回收正己烷， 得20.5g还原型萝 卜硫素提取物， 其中， 还原型萝 卜硫素含量为 28.6%， 还原型萝 卜硫素的酶解得率为36.2%。 0030 所述步骤3） 中， 除杂的萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 25L； 除杂的萝 卜 芽苗微粉质量： 磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg： 25L； 无水硫酸钠质量： 正己烷体积之比为 0.01kg： 1L； 所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.2mol/L、 pH值为3.。
23、0、 维生素C含量为1.5mmoL/L。 0031 实施例3 一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝 卜硫素提取物的方法， 是由以下步骤 制得的： 1） 取20kg新鲜萝 卜芽苗， 烘干， 得1.30kg干燥萝 卜芽苗； 将干燥萝 卜芽苗粉碎， 得萝 卜芽苗 微粉； 所述步骤1） 中， 新鲜萝 卜芽苗的发芽和生长总时间为7天， 培养大棚温度为25， 湿度为 85%。 0032 所述步骤1） 中， 烘干的温度为60； 干燥萝 卜芽苗的含水量为0.5%； 萝 卜芽苗微粉的 粒径为150 m。 0033 2） 将萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取， 加入正己烷， 在提取温度 25和分。
24、散盘转速50rpm条件下， 分散提取2.5h； 提取完成后静置8h， 减压过滤， 得微粉； 重 复分散提取3次， 得除杂的萝 卜芽苗微粉； 所述步骤2） 中， 萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 15L。 0034 3） 将除杂的萝 卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中， 加入正己烷， 在温度20和 分散盘转速300rpm条件下， 预分散20min； 预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液， 酶解与萃取 偶联制备还原型萝 卜硫素30min； 反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至2.0， 静置5h； 充 分收集正己烷相， 加入无水硫酸钠， 在转速为50rpm条件下， 脱水处理4h； 在。
25、温度为40条件 说明书 4/5 页 6 CN 107630051 A 6 下， 减压蒸馏回收正己烷， 得20.5g还原型萝 卜硫素提取物， 其中， 还原型萝 卜硫素含量为 28.5%， 还原型萝 卜硫素的酶解得率为36.1%。 0035 所述步骤3） 中， 除杂的萝 卜芽苗微粉质量： 正己烷体积之比为1kg： 15L； 除杂的萝 卜 芽苗微粉质量： 磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg： 15L； 无水硫酸钠质量： 正己烷体积之比为 0.1kg： 1L； 所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1mol/L、 pH值为5.5、 维生素C含量为0.5mmoL/L。 0036 以上所述仅为本发明的实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换， 或直接或间接运用在其他相关的技术领 域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。 说明书 5/5 页 7 CN 107630051 A 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 107630051 A 8 图3 图4 图5 说明书附图 2/2 页 9 CN 107630051 A 9 。