1,3,4-噻二唑碳青霉烯化合物及其制备方法和用途 本发明涉及碳青霉烯化合物及其制备方法和作为抗生素的应用，具体的说，本发明涉及一类1,3,4-噻二唑碳青霉烯化合物及其制备方法和该类化合物作为抗菌药物的用途。
碳青霉烯(Carbapenem，如结构式Ⅴ所示)化合物是七十年代发展起来的一类全新结构的β-内酰胺类化合物。其结构特点是，青霉烷母核1位的硫被碳取代，而且在2位具有双键。此种结构复合了青霉素的五元环和头孢菌素的共轭双键活化β-内酰胺环的作用；另外，其6位羟乙基侧链为反式构象，与通常青霉烯顺式构象显著不同。因其抗菌谱广，抗菌活性强，并对β-内酰胺酶稳定，所以十分引人注目。
已经开发出作为抗生素的碳青霉烯衍生物中，最具有代表性的是亚胺培南(Imipenem，如结构式Ⅵ所示)和帕尼培南(Panipenem，如结构式Ⅶ所示)，两者都是当前治疗严重细菌感染包括多重耐药菌感染的最有效药物。
亚胺培南(Imipenem)对革兰氏阳性菌、阴性菌、需氧菌、厌氧菌均具有很强的活性，对各种β-内酰胺酶稳定，并与其它抗生素无交叉耐药性。但是，亚胺培南在体内易被肾脱氢肽酶-Ⅰ(DHP-Ⅰ)迅速降解而打开β-内酰胺环(Kropp K,Sudelof J G,Hajdu R et al.Antimicrob Chemother1983,12(Suppl.D):1-35)，因而在临床上必须与肾肽酶抑制剂-西司他丁(Cilastatin)合用。
帕尼培南(Panipenem)对各型β-内酰胺酶高度稳定，对DHP-Ⅰ稳定，抗铜绿假单胞菌活性优于亚胺培南，对第三代头孢菌素不十分有效的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌也有良好活性。但因其有轻度肾毒性，所以需要与肾保护剂倍他米隆(Betaminpron)合用。
对碳青霉烯衍生物的进一步研究发现，1-β位引入甲基，可增强碳青霉烯的化学稳定性、抗菌活性和对DHP-Ⅰ的稳定性。由此引发了对碳青霉烯类抗生素的构效关系和作用机理地深入研究，特别是在1-β位引入甲基和C-2位引入侧链。其中已开发出的美罗培南(Meropenem，如结构式Ⅷ所示，Sunagawa M,Mat sumura H,Inoue T et al.J Antibiot 1990,43:51 9-32)，是一个超广谱的碳青霉烯类抗生素，与亚胺培南相比，在C-1位有一甲基，可增加对DHP-Ⅰ的稳定性，因而不存在肾毒性，可单剂给药。虽然临床评价认为是一个高效、安全的抗生素。但是，该药物对最常见的院内感染病原菌金黄色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStraphylococcus Aureus,MRSA)缺乏有效的抗菌活性。
从1961年第一次发现MRSA以来，MRSA现已成为全世界范围内最常见的院内感染病原菌。由于该菌不仅对各类β-内酰胺类抗生素具有内在的耐药性，而且通过获得其它耐药基因而呈现出对其它类抗生素的多重耐药性，给临床治疗带来了严重问题。目前，万古霉素(Vancomycin)作为临床上治疗MRSA感染的一线用药，但因其具有副作用，限制了它在临床上的应用。而且，随着万古霉素在临床上的广泛应用，万古霉素耐药的MRSA和肠球菌的出现，已成为临床上更为棘手的问题。因而，迫切需要探寻新的具有强抗MRSA活性的碳青霉烯类抗生素。
所以，如何提高碳青霉烯单剂的抗MRSA活性，已成为近年来碳青霉烯研究者关注的焦点。
本发明的目的在于经过对构效关系的研究和筛选，提出一类新的碳青霉烯化合物，即1,3,4-噻二唑碳青霉烯化合物，经抑菌试验表明，该类化合物能够广谱抗菌，尤其具有很强的抗MRSA活性。
本发明的另一目的在于提供抗菌药物组合物，尤其是抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌的药物组合物。
本发明的另一目的在于提供该1,3,4-噻二唑碳青霉烯化合物的合成路线。
本发明的目的还在于提供该1,3,4-噻二唑碳青霉烯化合物的抗菌用途，具体的说，本发明的目的还在于提供该碳青霉烯类抗生素在制备抗生素药物中的应用，尤其是在抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌的抗生素中的应用。
碳青霉烯对MRSA缺少有效活性，推测可能与大多数青霉素和头孢菌素一样，不能很好地与MRSA特有的青霉素结合蛋白PBP2a(或PBP2’)相结合。因而，在碳青霉烯中引入与PBP2a的“结合元素”，提高与PBP2a的亲合力，有可能提高碳青霉烯的抗MRSA活性。根据这一思路，本发明者经过悉心研究，终于完成了本发明。
本发明提供的碳青霉烯化合物，在1-β甲基碳青霉烯双环母核的C-2位连接有5-位取代的2-巯基-1,3,4-噻二唑侧链，该化合物具有如下结构式(Ⅰ)：
其中，R1选自吡啶基、一个或多个取代的吡啶基、苯基、一个或多个取代的苯基、氢、低级烷基、氨基、低级烷胺基、酰胺基、低级烷基羰基或芳基羰基、巯基、低级烷硫基或芳基硫基、羟基、低级烷氧基或芳基氧基；
R2为氢、碱金属或在生物体内水解的酯残基。
其中，“低级烷基”指碳原子数为1-6个的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、环戊基、正己基、异己基、环己基等，其中，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基，更优选甲基、乙基，最优选甲基、乙基。
“低级烷胺基”指碳原子数为1-6个的烷胺基，如甲胺基、乙胺基、正丙胺基、烯丙基胺基、异丙基胺基、环丙基胺基、正丁基胺基、异丁基胺基、仲丁基胺基、叔丁基胺基、正戊基胺基、异戊基胺基、正己基胺基、异己基胺基等；
“酰胺基”指甲基酰胺基、乙基酰胺基、正丙基酰胺基、异丙基酰胺基、烯丙基酰胺基、环丙基酰胺基、正丁基酰胺基、异丁基酰胺基、正戊基酰胺基、正己基酰胺基、苯基酰胺基、甲苯基酰胺基等。
“低级烷基羰基”指碳原子数为1-6个的烷基羰基，如甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、异丙基羰基、烯丙基羰基、环丙基羰基、正丁基羰基、异丁基羰基、仲丁基羰基、叔丁基羰基、正戊基羰基、异戊基羰基、正己基羰基、异己基等羰基等。
“芳基羰基”指苯基羰基、甲苯基羰基、二甲苯基羰基、吡啶基羰基等。
“低级烷硫基”指碳原子数为1-6个的烷硫基，如甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、环丙基硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基、正戊硫基、异戊硫基、正己硫基、异己硫基等；
“芳基硫基”指苯基硫基、甲苯基硫基、二甲苯基硫基等。
“低级烷氧基”指碳原子数为1-6个的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基等；
“芳基氧基”指苯基氧基、甲苯基氧基、二甲苯基氧基等。
本发明中所述的R1为取代的吡啶基、苯基时，取代基可以是卤素、硝基、氰基、低级烷基、低级环烷基、巯基、低级烷硫基、羟基、低级烷氧基、氨基、低级烷胺基、酰胺基、低级烷基羰基、芳基羰基或芳基。
其中，“卤素”可以是氟、氯、溴、碘等；
“低级烷基”指碳原子数为1-6个的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基等，其中，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基，更优选甲基、乙基，最优选甲基、乙基。
“低级环烷基”指碳原子数为1-6个的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；
“低级烷硫基”指碳原子数为1-6个的烷硫基，如甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基、正戊硫基、异戊硫基、正己硫基、异己硫基等；
“低级烷氧基”指碳原子数为1-6个的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基等；
“低级烷胺基”指碳原子数为1-6个的烷胺基，如甲胺基、乙胺基、正丙胺基、异丙胺基、正丁胺基、异丁胺基、仲丁胺基、叔丁胺基、正戊胺基、异戊胺基、正己胺基、异己胺基等；
“酰胺基”指甲基酰胺基、乙基酰胺基、正丙基酰胺基、异丙基酰胺基、正丁基酰胺基、异丁基酰胺基、正戊基酰胺基、正己基酰胺基、苯基酰胺基、甲苯基酰胺基等。
“低级烷基羰基”指碳原子数为1-6个的烷基羰基，如甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、异丁基羰基、仲丁基羰基、叔丁基羰基、正戊基羰基、异戊基羰基、正己基羰基、异己基等羰基等。
“芳基”指苯基、甲苯基、二甲苯基等。
“芳基羰基”指苯基羰基、甲苯基羰基、二甲苯基羰基等。
R1的具体可以例子包括：2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、4-氯代-2-吡啶基、5-氯代-2-吡啶基、6-氯代-2-吡啶基、4-硝基-2-吡啶基、4-甲酰胺基-2-吡啶基、4-己酰胺基-2-吡啶基、4-胺甲酰基-2-吡啶基、4-胺基-2-吡啶基、4-氟代-2-吡啶基、5-氟代-2-吡啶基、6-氟代-2-吡啶基、5-氟代-3-吡啶基、3-氟代-4-吡啶基、4-氯代苯基、2-氯代苯基、3-氯代苯基、2-氟代苯基、3-氟代苯基、4-氟代苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-胺基苯基、3-胺基苯基、4-胺基苯基、2-胺甲酰基苯基、3-胺甲酰基苯基、4-胺甲酰基苯基、甲基、乙基、正丙基、烯丙基、环丙基、环戊基、环己基、甲胺基、乙胺基、正丙胺基、烯丙基胺基、异丙胺基、环丙胺基、环己胺基、甲酰胺基、乙酰胺基、甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、异丙基羰基、烯丙基羰基、环丙基羰基、苯基羰基、甲苯基羰基、甲氧基、乙氧基、甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、环丙硫基、苯基硫基、甲苯基硫基等。
根据本发明的目的，通过对碳青霉烯类抗生素的构效关系和抗菌作用机理的研究，筛选出了具有结构式(Ⅰ)结构的碳青霉烯衍生物，其中抗菌活性最强，尤其是抗MRSA活性最强的，优选R1为2-吡啶基、苯基、乙酰胺基或丙酰胺基的1,3,4-噻二唑碳青霉烯化合物。
本发明中的R2可以为氢、或者钠盐、钾盐、铵盐等无机盐、三乙胺盐等有机盐、或者在生物体内可水解成相应羧酸的酯残基等，其中，优选钠盐或钾盐，最优选钠盐。
所述“在生物体内可水解成相应羧酸的酯残基”指C1-C4烷基酯(如甲酯、乙酯等)；C1-C4烷氧羰氧基-(C1-C4烷基)酯(如1-(甲氧羰氧基)乙酯、1-(乙氧羰氧基)乙酯、1-(异丙氧羰氧基)乙酯、叔丁氧羰氧基甲酯等)；C5-C6环烷氧羰氧基-(C1-C4烷基)酯(如环戊氧羰氧基甲酯、1-(环戊氧羰氧基)乙酯、1-(环己氧羰氧基)乙酯等)；C2-C5烷酰氧基-(C1-C4烷基)酯(如乙酰氧基甲酯、1-(乙酰氧基)乙酯、异丁酰氧基甲酯、1-(异丁酰氧基)乙酯、叔戊酰氧基甲酯等)等。
本发明还提供了以化合物(Ⅰ)为有效成分的抗菌组合物，可将化合物(Ⅰ)本身或其与可药用赋形剂、稀释剂等的混合物以片剂、胶囊、颗粒剂、散剂或糖浆剂的形式口服给药或以注射剂的形式非口服给药。
上述制剂可通过常规制药方法制备。可用的添加剂的例子包括赋形剂(例如糖类衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纤维素衍生物如结晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠；阿拉伯胶；右旋糖酐；硅酸盐衍生物如偏硅酸镁铝；磷酸盐衍生物如磷酸钙；碳酸盐衍生物如碳酸钙；硫酸盐衍生物如硫酸钙等)、粘合剂(例如明胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇)、崩解剂(例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮)、润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、鲸蜡、硼酸、笨甲酸钠、亮氨酸)、稳定剂(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、矫味剂(例如常用的甜味剂、酸味剂和香料等)、稀释剂和注射液用溶剂(例如水、乙醇和甘油等)。
化合物(Ⅰ)的给药量随患者的年龄、性别、种族、病情等的不同而不同。一般成人的给药量为约0.01-5000mg/日，优选1-1000mg/日，更优选5-500mg/日。
本发明提供的该碳青霉烯化合物(Ⅰ)可以通过使2-位具有离去基团并在羟基和羧基上均带有保护基的1-β甲基碳青霉烯双环母核，以通式(Ⅱ)表示的碳青霉烯化合物与以通式(Ⅲ)表示的巯基-1,3,4-噻二唑衍生物反应来制备。
式中，R1如以上定义，R3为离去基团，R4、R5为保护基。
可以采用任何可行的方法连接母核和侧链，得到本发明碳青霉烯类化合物(Ⅰ)。
具有结构式(Ⅱ)的1-β甲基碳青霉烯双环母核的合成可以参照公开记载的文献完成(例如Kondo K,Seki M,Kuroda T et al.J,Org,Chem1995,60,1096-97)。
根据本发明优选的方案，化合物(Ⅱ)可由中间体化合物(Ⅳ)通过分子内Dieckmann环合反应制备，其中，R4、R5是保护基。中间体化合物(Ⅳ)可以通过参考文献的方法(Kondo K,Seki M,KurodaT.et al.J.Org.Chem.1995；60(5):1096-1097)合成。
化合物(Ⅲ)的合成有很多种方法，例如可以采用下述两种方法：
(1)先合成取代的氨基腙或硫代酰肼，再与二硫化碳反应进行制备
(2)肼与二硫化碳反应先生成二硫羰酰肼，再与相应的脒或酰亚胺醚反应制备。
根据本发明优选的实施方案，该碳青霉烯化合物(Ⅰ)的合成路线包括：将侧链5-位取代的2-巯基-1,3,4-噻二唑(Ⅲ)制成硫醇碱金属盐，该盐与所述2-位具有离去基团并在羟基和羧基上均带有保护基的1-β甲基碳青霉烯双环母核(Ⅱ)在溶剂中反应，在所述1-β甲基碳青霉烯双环母核的2-位引入5-位取代的2-巯基-1,3,4-噻二唑侧链，然后分别脱去羟基和羧基上的保护基，进而得到可药用的酸、盐或在生物体内可水解成相应羧酸的酯。
根据本发明的技术方案，使用的羟基保护基R4可为叔丁基二甲基硅基、三甲基硅基、三己基硅基、烯丙基、叔丁基、苄基、二苯甲基、对硝基苄基、对甲氧基苄基，其中优选的羧基保护基R4为叔丁基二甲基硅基。
使用的羧基保护基R5可为烯丙基、叔丁基、苄基、二苯甲基、对硝基苄基、对甲氧基苄基，其中优选的羧基保护基R5为烯丙基或对硝基苄基。
R3为公知的可离去活泼基团，使母核被活化，优选二苯基磷酰氧基或三氟甲磺酰氧基。根据本发明的技术方案，可使用活化的1-β甲基碳青霉烯双环母核的三氟甲磺酸脂，而将侧链引入其C-2位。
该合成路线可表示如下：
根据本发明优选的方案，采用Dieckmann反应环合法，由结构如图所示的中间体化合物21，在强碱NaN(TMS)2的作用下，与三氟甲磺酸酐一步反应，先制备出活化的1-β甲基碳青霉烯双环母核57。
在引入侧链时，可以使用硫醇的钠盐，也可以使用硫醇的锂盐，硫醇的锂盐比钠盐更易加成，收率高，因此优选锂盐。先将侧链与一水合氢氧化锂在无水四氢呋喃中反应生成硫醇锂盐，再把上述活化了的1-β甲基碳青霉烯双环母核57加入到反应混合物中进行反应，即可成功地在碳青霉烯双环母核的C-2位引入侧链。
上述示例性的该合成路线可参见下图。
在上图中，羟基保护基为叔丁基二甲基硅醚，羧基保护基为烯丙基，可以通过任何可行的步骤脱去，从而得到本发明的目的产物。
例如，可以以二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮作溶剂，与氟化氢铵在室温反应96小时，即可脱去羟基的叔丁基二甲基硅醚保护。
用Pd(PPhz)4-PPh3作催化剂，与2-乙基己酸钾反应，脱去羧基的烯丙基保护，然后用大孔树脂柱层析纯化，冷冻干燥，即可得到目的产物。
经抗菌试验的筛选，本发明进一步提出了具有通式(Ⅰ)的化合物中优选的具体例子。化合物编号 R2 R1
60a 氢/钾/钠 2-吡啶基
60b 氢/钾/钠 苯基
60c 氢/钾/钠 甲基
60d 氢/钾/钠 乙酰胺基
60e 氢/钾/钠 丙酰胺基
60f 氢/钾/钠 烯丙氨基
60g 叔戊酰氧基甲酯 2-吡啶基
抑菌试验结果：
1．试验样品：
1)60a-e 合成样品
2)亚胺培南(Imipenem) (默沙东)
3)美罗培南(meropenem) (浙江海正药业)
4)万古霉素(Vancomycin) (sigma)
2．制备抗菌素平皿：
将上述8个药物根据所需药量及所需浓度用蒸馏水稀释后，取出前管半量加等量蒸溜水对倍稀释成15-16个浓度，每个药浓度取1ml药液，加19ml培基混匀后倒入平皿待冷却即可。
A)1号，2号药倒普通平皿(M-H培基)一套，接种MRSA,MSSA,E.coli.各20株菌；
B)3-8号药倒普通及血平皿各一套，接种S.pneumoniae,E.faecalis,P.aeruginosa各20株菌。
3．种菌：
1)肺炎球菌接种在2％的小牛血清营养肉汤中(10ml/管)；
2)其它菌接种在普通营养肉汤中(10ml/管)；
将上述接种菌置37℃孵育18小时，次日稀释成106作为试验用菌浓度，将菌加入微孔板中用多点接种法种菌在不同浓度的药物平皿上，待干后，置37℃孵育18小时后观察结果(见表1)。
表1 碳青霉烯类新化合物MIC结果strains MIC(ug/ml)Vanco mycin Merop enem Imipen em 60a 60b 60c 60d 60e MSSA MIC50 0.5＜0.008＜0.008 0.016 0.016 0.125 0.031 0.062 MIC90 1 1 0.062 0.062 0.125 0.25 0.125 0.125 MRSA MIC50 1 1616 4 4 8 4 8 MIC90 2 1664 8 4 16 16 16 S.pneu moniae MIC50 0.25 0.50.25 0.013 0.013 0.062 - - MIC90 0.5 20.5 0.25 0.25 0.25 - - E.faeca lis MIC50 2 42 2 4 8 - - MIC90 4 256128 8 16 64 - - E.coli. (S) MIC50＞256＜0.008 0.125 8 16 2 4 16 MIC90＞256 0.031 0.25 16 32 4 16 16 E.coli. (R) MIC50＞256 0.008 0.125 16 32 8 8 16 MIC90＞256 0.031 0.25 16 64 8 16 32 P.aerug inosa (S) MIC50＞256 2 4 16 ＞64 64 - - MIC90＞256 2 4 64 ＞64 ＞64 - - P.aerug inosa(R) MIC50＞256 4 32 64 ＞64 ＞64 - - MIC90＞256 8 32 64 ＞64 ＞64 - -
注：
MSSA 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌
MRSA 甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌
S.pneumoniae 肺炎球菌
E.faecalis 粪肠球菌
E.coli(S) 头孢哌酮敏感的大肠杆菌
E.coli(R) 头孢哌酮耐药的大肠杆菌
P.aeruginosa(S) 头孢哌酮敏感的绿脓杆菌
P.aeruginosa(R) 头孢哌酮耐药的绿脓杆菌
通过表1可以看出，化合物60a、60b抗革兰氏阳性菌活性除MSSA弱于泰能外，对MRSA、肺炎球菌、肠球菌活性均强于泰能和美罗培南。与临床上的抗MRSA抗生素-万古霉素相比，对MSSA、肺炎球菌活性强于万古霉素，抗MRSA、肠球菌活性比万古霉素稍弱。
其中，60a抗MSSA、大肠杆菌、绿脓杆菌、肠球菌活性比60b稍强，但抗MRSA活性比60b稍弱，两者活性差别不大。抗MSSA、MRSA、大肠杆菌活性，60d均大于60e，表明碳链延长抗菌活性降低；与60a、60b相比，其抗菌活性均弱于后两者，表明酰胺基取代比杂环取代抗菌活性降低。除抗大肠杆菌活性强于其它化合物外，60c的活性均为最弱，表明烷基取代抗菌活性降低。
下面通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明的实施并不仅限于这些实施例。
实施例1(1R,5R,6S)-6-[(1R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-1-甲基-2-三氟甲磺酰氧-碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(57)的合成
在三颈瓶中加入化合物(21)(1.56g,2.61mmol)，加入无水四氢呋喃(8ml)，氮气流下干冰-丙酮浴降至-78℃，缓慢加入六甲基二硅胺基钠的四氢呋喃溶液(6.0ml,6.0mmol)，反应3分钟，加入三甲基氯硅烷(0.44ml,3.4mmol)，反应5分钟，加入三氟甲磺酸酐(0.53ml,3.2mmol)，在-78℃反应1小时，滴加饱和碳酸氢钠溶液(10ml)和乙酸乙酯(10ml)稀释，缓慢升至0℃，分去水层，水相用乙酸乙酯萃取，合并，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得到油状物，VLC分离，环己烷∶乙酸乙酯=8∶1洗脱，得到产物(57)(0.79g,50.6％)。
EI-MS:m/z513[M+]
1H-NMR(CDCl3)δ: 0.08(6H,s),0.87(9H,s),1.23(3H,d,J=5.7Hz),1.28(3H,d,J=5.4Hz),3.23-3.42(2H,m),4.23-4.33(2H,m),4.76(2H,dq),5.34(2H,m,),5.93(1H,m,)实施例2 2-吡啶氨基腙(50)的合成
在反应瓶中加入2-氰基吡啶(2.6g,25mmol)，无水乙醇(4.5ml)，无水肼(7.5ml)，室温反应3小时，加入水(12ml)，产生沉淀，过滤，用少量水洗涤，得白色沉淀产物(50)(2.94g,87.8％)。
mp 95-96℃
1H-NMR(DMSO)δ:4.54(1H),5.30(2H),7.25(1H,dq,J=4.8Hz,1.5Hz),7.67(1H,dt,J=2.1Hz,7.8Hz),7.99(1H,d,J=7.8Hz),8.50(1H,d,J=4.5Hz)
实施例3 5-(2-吡啶基)-2-巯基-1,3,4-噻二唑(51)的合成
在反应瓶中加入由实施例6制备的化合物(50)(0.46g,3.43mmol)，无水乙醇(5ml)，二硫化碳(0.41,6.87mmol)，室温反应2小时，减压蒸去大部分乙醇，产生沉淀，过滤，用少量乙醇洗涤，得白色沉淀产物(51)(0.56g,83.8％)。
m.p.277-9℃
EI-MS:m/z195[M+]
1H-NMR(DMSO)δ:7.56(1H,m),8.00-8.02(2H,m),8.65(1H,d),14.79(1H,s)
实施例4 二硫羰酰肼钾(52)的合成
在反应瓶中加入95％乙醇(50ml)，冷却中加入85％水合肼(11.46ml,0.20mol)，抗坏血酸(0.05g)。在0-5℃滴加二硫化碳(12.02ml,0.20mol)的乙醇溶液(10ml)，在同温度下反应3小时，于4℃静置过夜，产生沉淀，过滤，用乙醚洗涤(60ml)，得到淡黄色固体产物(52)(27.36g,83.5％)。
mp.130-132℃。
实施例5 5-苯基-2-巯基-1,3,4-噻二唑(53)的合成
在反应瓶中加入由实施例4制备的化合物(52)(4.92g,0.030mol)，苄脒(6.57g,0.042mol)，水(30ml)，70℃反应5小时，出现棕黄色油状物，用浓硫酸调PH至1，出现沉淀，过滤，用水洗涤多次，得淡黄色沉淀产物(53)(5.24g,90.0％)。
mp 182-184℃
EI-MS:m/z194[M+]
1H-NMR(CDCl3)δ:7.48(3H,m),7.68(2H,m),11.0(1H)
实施例6 5-乙酰胺基-2-巯基-1,3,4-噻二唑(54)的合成
在反应瓶中加入市售5-氨基-2-巯基-1,3,4-噻二唑(4.0g,0.030ml)，醋酐(2ml)，醋酸(4ml)，在95-100℃反应14小时，加入水(5ml)，过滤，用水洗涤(20ml)，室温干燥，得固体。用10％NaHCO3重结晶，得白色结晶产物(54)(4.4g,84.0％)。
mp 291-293℃
EI-MS:m/z 175[M+],43[-COCH3]
1H-NMR(DMSO)δ:3.35(3H,s),11.43(1H)
实施例7 5-丙酰胺基-2-巯基-1,3,4-噻二唑(55)的合成
在反应瓶中加入市售5-氨基-2-巯基-1,3,4-噻二唑(2.0g,0.015mol)，吡啶(20ml)，在0-5℃滴加丙酰氯(1.38ml,0.0158mol)，加完后升至室温反应5小时，加入冰水(25ml)，过滤，用水洗涤(20ml)，室温干燥，得淡黄色固体产物(55)(1.99g,70.0％)。
mp 234-236℃
EI-MS:m/z 189[M+]
1H-NMR(DMSO)δ:1.04(3H,t),2.40(2H,q),12.32(1H),14.02(1H)
实施例8 5-烯丙氧羰基氨基-2-巯基-1,3,4-噻二唑(56)的合成
在反应瓶中加入市售5-氨基-2-巯基-1,3,4-噻二唑(2.68g,0.020mol)，吡啶(8ml)，在0-5℃滴加氯代甲酸烯丙酯(2.33ml,0.022mol)，加完后升至室温反应4小时，加入冰水，出现沉淀，用浓盐酸调PH至2，过滤，用水洗涤，室温干燥，得产物(56)(4.9g,84.0％)。
EI-MS:m/z 217[M+]
1H-NMR(DMSO)δ:4.66(2H,d,J=5.4Hz),5.29(2H,m),5.93(1H,m),12.20(1H),13.92(1H)
实施例9 (1R,5R,6S)-2-[5-(2-吡啶基)-1,3,4-噻二唑-2-硫-]-6-[(1R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(58a)的合成
在反应瓶中加入实施例3中得到的化合物(51)(0.057g,0.292mmol)，一水合氢氧化锂(0.013g,0.321mmol)，无水四氢呋喃(5ml)，反应0.5小时，加入实施例5中得到的化合物(57)(0.15g,0.292mmol)的四氢呋喃溶液(2ml)，室温反应5小时，减压蒸去四氢呋喃，得到油状物，VLC分离，环己烷∶乙酸乙酯=12∶1洗脱，得到棕色油状产物(58a)(0.085g,47.7％)。
EI-MS:m/z 543[M+-CH3]
1H-NMR(CDCl3)δ:0.07(6H,s),0.87(9H,s),1.12(3H,d,J=7.5Hz),1.28(3H,d,J=5.7Hz),3.23(1H,dd,J=7.5Hz,2.5Hz),3.78(1H,m),4.24(1H,m),4.36(1H,dd,J=2.5Hz,5.7Hz),4.79(2H,dq),5.31(2H,m),5.95(1H,m),7.39(1H,m),7.89(1H,m),8.29(1H,d,J=7.8Hz),8.64(1H,dd,J=7.8Hz,9.9Hz)
实施例10 (1R,5R,6S)-2-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(58b)的合成
以实施例5中得到的化合物(53)为原料,按照与实施例9相同的方法操作，得到产物(58b)。
收率46.2％。
EI-MS:m/z 543[M+-CH3]
1H-NMR(CDCl3)δ:0.07(6H,s),0.87(9H,s),1.12(3H,d,J=7.5Hz),1.28(3H,d,J=5.7Hz),3.23(1H,dd,J=7.5Hz,2.5Hz),3.78(1H,m),4.24(1H,m),4.36(1H,dd,J=2.5Hz,5.7Hz),4.79(2H,dq),5.31(2H,m),5.95(1H,m),7.39(1H,m),7.89(1H,m),8.29(1H,d,J=7.8Hz),8.64(1H,dd,J=7.8Hz,9.9Hz)
实施例11 (1R,5R,6S)-2-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(58c)的合成
用市售的5-甲基-2-硫基-1,3,4-噻二唑取代实施例9中的化合物(51)，按照与实施例9相同的方法操作，得到产物(58c)。
收率45.3％.
EI-MS:m/z 495[M+]
1H-NMR(CDCl3)δ:0.07(6H,s),0.87(9H,s),1.12(3H,d,J=7.2Hz),1.28(3H,d,J=6.0Hz),2.81(3H,s),3.25(1H,dd,J=7.2Hz,2.7Hz),3.78(1H,m),4.24(1H,m),4.36(1H,dd,J=2.7Hz,9.4Hz),4.76(2H,dq),5.36(2H,m),5.97(1H,m)
实施例12 (1R,5R,6S)-2-(5-乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(58d)的合成
以实施例6中得到的化合物(54)为原料，按照与实施例9相同的方法操作，得到产物(58d)。
收率52.5％.
FAB-MS:m/z 539[M++1]
1H-NMR(CDCl3)δ0.06(6H,s),0.86(9H,s),1.12(3H,d,J=7.2Hz),1.28(3H,d,J=6.3Hz),2.49(3H,s),3.24(1H,dd,J=7.2Hz,2.1Hz),3.29(1H,m),4.11(1H,m),4.24(1H,dd,J=2.1Hz,12.4Hz),4.78(2H,dq),5.36(2H,m),5.93(1H,m)
实施例13 (1R,5R,6S)-2-(5-丙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(58e)的合成
以实施例7中得到的化合物(55)为原料，按照与实施例9相同的方法操作，得到产物(58e)。
收率62.0％.
FAB-MS:m/z 553[M++1]
1H-NMR(CDCl3)δ0.06(6H,s),0.86(9H,s),1.12(3H,d,J=6.6Hz),1.28(3H,d,J=7.2Hz),1.32(3H,t),2.76(2H,q),3.25(1H,m),3.35(1H,m),4.18(1H,m),4.32(1H,m),4.78(2H,dq),5.36(2H,m),5.93(1H,m),12.87(1H)
实施例14 (1R,5R,6S)-2-(5-烯丙氧羰基氨基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(58f)的合成
以实施例8中得到的化合物(56)为原料，按照与实施例9相同的方法操作，得到产物(58f)。
收率37.1％.
FAB-MS:m/z 581 [M++1 ]
1H-NMR(CDCl3)δ0.06(6H,s),0.87(9H,s),1.12(3H,d,J=7.2Hz),1.18(3H,d,J=6.3Hz),3.24(1H,m),3.37(1H,m),4.21-4.28(2H,m),4.79(4H,m),5.36(4H,m),5.93(2H,m)
实施例15 (1R,5R,6S)-2-[5-(2-吡啶基)-1,3,4-噻二唑-2-硫-]-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(59a)的合成
在反应瓶中加入实施例9中得到的化合物(58a)(0.47g,0.843mmol)，二甲基甲酰胺(3.38ml)和N-甲基吡咯烷酮(1.27ml)，加入氟化氢胺(0.185g,3.39mmol)，反应120小时，加入磷酸缓冲液(5ml)稀释，乙酸乙酯(20ml×3)萃取，有机相用缓冲液(1ml×2)洗涤，饱和食盐水(20ml×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到油状物，VLC分离，环己烷∶乙酸乙酯=2∶1洗脱，得到油状产物(59a)(0.17g,45.8％)。
FAB-MS:m/z445[M++1]
1H-NMR(CDCl3)δ1.12(3H,d,J=7.5Hz),1.28(3H,d,J=6.3Hz),3.30(1H,dd,J=6.3Hz,2.7Hz),3.81(1H,m),4.27(1H,m),4.34(1H,dd,J=2.7Hz,6.3Hz),4.79(2H,dq),5.29(2H,m),5.98(1H,m),7.40(1H,dd,J=6.0,1.5Hz),7.88(1H,dq,J=7.8Hz),8.31(1H,d,J=7.8Hz),8.65(1H,d,J=4.5Hz)
实施例16 (1R,5R,6S)-2-(5-(2-苯基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(59b)的合成以实施例10中得到的化合物(58b)为原料，按照与实施例15相同的方法操作，得到产物(59b)。
收率34.4％.
FAB-MS: m/z 444[M++1]
1H-NMR(CDCl3)δ1.20(3H,d,J=6.3Hz),1.28(3H,d,J=6.3Hz), 3.33(1H,dd,J=6.3Hz,3.0Hz),3.75(1H,m),4.27(1H,m),4.34(1H,dd,J=3.0Hz,9.9Hz),4.79(2H,dq),5.47(2H,m),5.97(1H,m),7.52(3H,m),7.94(2H,dd,J=1.5,5.4Hz)
实施例17 (1R,5R,6S)-2-(5-(2-甲基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(59c)的合成
以实施例11中得到的化合物(58c)为原料，按照与实施例15相同的方法操作，得到产物(59c)。
收率75.0％.
FAB-MS: m/z 382[M++1]
1H-NMR(CDCl3)δ:1.09(3H,d,J=7.5Hz),1.30(3H,d,J=5.7Hz),2.83(3H,s,),3.25(1H,dd,J=5.7Hz,2.7Hz),3.63(1H,m),4.22(1H,m),4.29(1H,dd,J=2.7Hz,9.4Hz),4.79(2H,m),5.36(2H,m),5.97(1H,m)
实施例18 (1R,5R,6S)-2-(5-(2-乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(59d)的合成
以实施例12中得到的化合物(58d)为原料，按照与实施例15相同的方法操作，得到产物(59d)。
收率61.7％.
FAB-MS:m/z 425[M++1]
1H-NMR(CDCl3)δ1.14(3H,d,J=7.2Hz),1.37(3H,d,J=7.2Hz), 2.48(3H,s),3.28(1H,dd,J=2.7Hz,7.2Hz),3.34(1H,m),4.21(1H,m),4.28(1H,dd,J=2.7,6.6Hz),4.79(2H,m),5.36(2H,m),5.93(1H,m),12.94(1H)
实施例19 (1R,5R,6S)-2-(5-(2-丙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(59e)的合成
以实施例13中得到的化合物(58e)为原料，按照与实施例15相同的方法操作，得到产物(59e)。
收率49.2％.
EI-MS:m/z423[M+-CH3],57[-OCH2CH=CH2]
1H-NMR(CDCl3)δ:1.12(3H,d,J=7.5Hz),1.28(3H,d,J=5.7Hz),1.32(3H,t),2.73(2H,q),3.28(1H,dd,J=5.7Hz,3.0Hz),3.63(1H,m),4.22(1H,m),4.29(1H,dd,J=3.0,6.6Hz),4.79(2H,m),5.36(2H,m),5.97(1H,m),12.73(1H)
实施例20 (1R,5R,6S)-2-(5-(2-烯丙氧羰基氨基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸烯丙酯(59f)的合成
以实施例14中得到的化合物(58f)为原料，按照与实施例15相同的方法操作，得到产物(59f)。
收率50.4％.
FAB-MS:m/z 467[M++1]
1H-NMR(CDCl3)δ:1.12(3H,d,J=7.2Hz),1.18(3H,d,J=6.6Hz),3.27(1H,dd,J=7.2,2.7Hz),3.43(1H,m),4.21-4.28(2H,m),4.78(4H,m),5.38(4H,m),5.97(2H,m)
实施例21 (1R,5R,6S)-2-[5-(2-吡啶基)-1,3,4-噻二唑-2-硫-]-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸钾(60a)的合成
在反应瓶中，加入实施例15中得到的化合物(59a)(0.086g,0.194mmol)，二氯甲烷(0.35ml，三苯膦(0.0045g,0.017mmol)，三苯膦钯[Pd(PPh3)4](0.0045g,0.0038mmol)，加入0.5M的2-乙基己酸钾的乙酸乙酯溶液(0.35ml)，避光反应1小时，加入乙酸乙酯(5ml)，用水萃取(3ml×2)，合并水相，减压除去溶剂，上大孔树脂柱层析分离，水∶丙酮=2∶1洗脱，冷冻干燥，得到白色粉末状的目的产物(0.025g,29.1％)。
HRFAB-MS: m/z 443.020420[M++1]，元素组成: C17H16N4O4S2K
1H-NMR(D2O):1.13(3H,d,J=7.5Hz),1.29(3H,d,J=6.5Hz),3.43(1H,dt,J=7.5,10.0Hz),3.56(1H,dd,J=6.0,3.0Hz), 4.27(1H,p,J=6.5,6.0Hz),4.35(1H,dd,J=10.0,3.0Hz),7.59(1H,t,J=6.5,4.5Hz),8.02(1H,t,J=6.5,7.5Hz),8.09(1H,d,J=7.5Hz),8.56(1H,d,J=4.5Hz)
实施例22 (1R,5R,6S)-2-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸钾(60b)的合成
以实施例16中得到的化合物(59b)为原料，按照与实施例20相同的方法操作，得到目的产物。
白色粉末，收率31.2％。
HRFAB-MS:m/z 442.028000[M++1]，元素组成：C18H17N3O4S2K
1H-NMR(D2O): 0.98(3H,d,J=7.0Hz),1.13(3H,d,J=6.5Hz),3.21(1H,p,J=7.0,8.5Hz),3.39(1H,dd,J=6.0,3.0Hz),4.12(1H,p,J=6.5,6.0Hz),4.17(1H,dd,J=8.5,3.0Hz),7.43(2H,t,J=7.5,7.5Hz),7.49(1H,t,J=7.5,7.5Hz),7.73(2H,d,J=3.0,7.5Hz).
实施例23 (1R,5R,6S)-2-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸钾(60c)的合成
以实施例17中得到的化合物(59c)为原料，按照与实施例20相同的方法操作，得到目的产物。
白色粉末，收率53.2％。
IR(KBr)cm-1:3414(-OH),1759(β-Lactam),1606(C=N)
HRFAB-MS:m/z 380.017100[M++1]，元素组成：C13H15N3O4S2K
1H-NMR(D2O): 1.11(3H,d,J=7.0Hz),1.29(3H,d,J=6.5Hz),2.80(3H,s),3.31(1H,dt,J=7.0,10.0Hz),3.53(1H,dd,J=6.0,2.5Hz),4.26(1H,dd,J=6.5,6.0Hz),4.31(1H,dd,J=10.0,2.5Hz).
实施例24 (1R,5R,6S)-2-(5-乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸钾(60d)的合成
以实施例18中得到的化合物(59d)为原料，按照与实施例20相同的方法操作，得到目的产物。
淡黄色粉末，收率33.2％。
HRFAB-MS:m/z 423.021182[M++1]，元素组成：C14H16N4O5S2K
1H-NMR(D2O):1.11(3H,d,J=7.0Hz),1.28(3H,d,J=6.5Hz), 2.34(3H,s),3.23(1H,p,J=7.0,6.5Hz),3.50(1H,dd,J=6.0,2.0Hz),4.26(1H,p,J=6.5,6.0Hz),4.27(1H,dd,J=6.5,2.0Hz).
实施例25 (1R,5R,6S)-2-(5-丙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸钾(60e)的合成
以实施例19中得到的化合物(59e)为原料，按照与实施例20相同的方法操作，得到目的产物。
淡黄色粉末，收率33.2％。
HRFAB-MS:m/z 437.036094[M++1]，元素组成：C15H18N4O5S2K
1H-NMR(D2O): 1.11(3H,d,J=7.0Hz),1.22(3H,t,J=7.0Hz),1.28(3H,d,J=6.5Hz),2.63(2H,q,J=7.0Hz),3.21(1H,dt,J=7.0,6.5Hz),3.50(1H,dd,J=6.0,3.0Hz),4.26(1H,p,J=6.5,6.0Hz),4.27(1H,dd,J=6.5,3.0Hz).
实施例26 (1R,5R,6S)-2-(5-烯丙胺基-1,3,4-噻二唑-2-硫-)-6-[(1R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸钾(60f)的合成
以实施例20中得到的化合物(59f)为原料，按照与实施例20相同的方法操作，得到目的产物。
淡黄色粉末，收率11.8％。
HRFAB-MS:m/z 421.036554[M++1]，元素组成：C15H18N4O4S2K
1H-NMR(D2O):1.11(3H,d,J=7.0Hz),1.27(3H,d,J=6.0Hz),3.18(1H,p,J=7.0,6.5Hz),3.47(1H,dd,J=6.0,2.5Hz),3.99(2H,d,J=5.0Hz),4.22(1H,p,J=6.5,6.0Hz),4.24(1H,dd,J=6.5,2.5Hz),5.25(2H,m),5.94(1H,m).实施例27 冻干粉针剂的制备化合物60a 475mg碳酸钾 25mg
500mg
按照上述配方，将灭菌后的化合物60a和碳酸钾放入18ml的玻璃瓶中，加入2ml注射用水，溶解后冷冻干燥，得到粉针剂。