技术领域
本发明属于培养基技术领域，尤其涉及一种高产DHA的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)是重要的多不饱和脂肪酸，具有重要的生理功能，是人体心血管、神经和视觉系统发挥正常功能所不可缺少的物质。随着生活水平的提高，人们越来越重视DHA的补充。DHA正以各种各样的形式进入人们的生活。含DHA的食品正影响更广泛的人群，包括孕妇、哺乳期妇女、婴儿、儿童以及老人等。
DHA的应用市场越来越广，诸多相关研究机构和企业对DHA的研究越来越多。国内DHA的来源主要是鱼油，年产量达万吨左右，但保健品用鱼油不足，且鱼油大部分质量不高。鱼油全球产量下降，鱼油产品需求却日益增加。深海鱼油的产量和质量都难以满足人类的需要。随着在食品、保健品和医药行业中的应用增加以及水产业的快速发展，市场对的DHA需求迅速增加。若单以深海鱼油为主要原料，产量将不能满足曰益扩大的市场的需求。近年来科学研究发现：深海各种鱼类中的长链多不饱和脂肪酸并不是它们自身合成的，而是通过海洋食物链(海洋微藻，真菌，细菌—浮游动物—鱼)而累积在深海鱼类体内的1。多不饱和脂肪酸大多来自于海洋微生物，包括破囊壶菌等。很多相关的工作，特别是海洋微生物生产DHA的研究受到广泛关注。随着人类海洋真菌类原生生物(破囊壶菌等)的研究，发现其产生的脂质中多不饱和脂肪酸组成简单，含量高；不仅可以减少对海洋资源消耗、降低生产成本，而且还具有避免有毒物质的污染，提高产品安全性的优点2。因此海洋真菌类原生生物被认为是一种有潜力的新生资源。
破囊壶菌(Thraustochytrids)是一类异养的类真菌海洋原生生物，能够生产大量的脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸。随着市场对DHA需求量的增加，人们开始致力于改善用破囊壶菌生产DHA的技术。其中获得高浓度的DHA是改善生物技术的最终目标，培养基的优化是提高DHA产量的重要手段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种高产DHA的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法。
本发明的第一个技术方案是一种高产DHA的破囊壶菌发酵培养基，成分及比例如下：
甘油40-60g/L、酵母提取物2.5-7.5g/L、磷酸二氢钾0.25g-1.0/L、海盐20-33g/L
本发明的第二个技术方案是采用上述破囊壶菌发酵培养基的培养方法，该方法包括如下步骤：
(1)、破囊壶菌发酵培养基M4tju制备：搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装至至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(2)、破囊壶菌通用培养基M4制备：取葡萄糖：20g、酵母提取物1g、蛋白胨1.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，自然pH，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(3)、菌种的活化：在超净台内，用灭菌的接种环从固体培养基上挑取破囊壶菌接种于通用培养基M4平板上三区划线，置28℃培养箱中培养24～48h，得活化菌种；
(4)、破囊壶菌种子液制备：
挑取一环活化菌种接种于通用培养基M4中，将其放入条件为150rpm，28±1℃的摇床中培养24-48h；
(5)、摇瓶发酵培养发酵液：
在超净台内，用移液枪取5ml上述破壶囊菌种子液的菌液至灭菌的发酵培养基M4tju中，温度28℃、转速150r/min，培养4天，96h取样，得到含DHA的发酵液；
(6)、测定生物量干重；
(7)、测定DHA产量。
所述步骤(4)破壶囊菌种子液接种量为5％-10％。
所述步骤(6)具体为：取出所述步骤(5)得到含DHA的发酵液8-20ml，离心水洗后弃上清，将菌体冻干称重即可得到其发酵液中破囊壶菌生物量。
所述步骤(7)具体为：
A、取冻干的菌体加入2ml的4％的H2SO4-甲醇；
B、100μl内标(1g/L十九烷酸)，80°水浴1h后取出冷却；
C、加入1ml灭菌水，1ml正己烷，混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量。
有益效果：本发明提供发酵培养基及培养条件简单，操作方便，生产成本低，DHA产量高，易于工业化生产，节能环保，经济和社会效益巨大：
(1)将碳源原料由葡萄糖改变为甘油，节省了生产成本。
(2)将培养基中氮源原料由酵母提取物和蛋白胨两种，变为了酵母提取物一种，简化了培养及成分。
(3)使用该培养基与原培养基相比，其菌体生物量并没有显著地增加，而其增加主要体现在DHA产量上，提高其原料利用效率。
附图说明
图1为破囊壶菌Schizochytrium sp.PKU#Mn4(CGMCC 8091)使用通用培养基(M4)与高产DHA发酵培养基(M4tju)的生物量(Biomass)及DHA含量。
图2为破囊壶菌Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16(CGMCC 8095)使用通用培养基(M4)与高产DHA发酵培养基(M4tju)的生物量(Biomass)及DHA含量。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
本发明一种高产DHA的破囊壶菌发酵培养基，成分及比例如下：甘油40-60g/L、酵母提取物2.5-7.5g/L、磷酸二氢钾0.25g-1.0/L、海盐20-33g/L，海盐为法国红十字公司生产的小丑盐。
一种采用上述破囊壶菌发酵培养基的培养方法，具体步骤如下：
(1)、破囊壶菌发酵培养基M4tju制备：取甘油：40-60g、酵母提取物2.5-7.5g、磷酸二氢钾0.25-1.0g、人工海盐20-33g，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装至至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(2)、破囊壶菌通用培养基M4制备：取葡萄糖：20g、酵母提取物1g、蛋白胨1.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(3)、破囊壶菌固体培养基M4制备：取葡萄糖：20g、酵母提取物1g、蛋白胨1.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，琼脂20g，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声5分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，冷却至60℃，倒入培养皿，即可得到固体平板；
(4)、菌种的活化：在超净台内，用灭菌的接种环从固体培养基上挑取破囊壶菌接种于通用培养基M4平板上三区划线，置28℃培养箱中培养24-48h，得活化菌种；
(5)、破囊壶菌种子液制备：
挑取一环活化菌种接种于通用培养基M4中，将其放入条件为150rpm，28℃的摇床中培养24-48h；
(6)、摇瓶发酵培养发酵液：
在超净台内，用移液枪取5ml上述破壶囊菌种子液的菌液至灭菌的发酵培养基M4tju中，温度28℃、转速150r/min，培养4天，96h取样，得到含DHA的发酵液；
(7)、测定生物量干重：取出所述步骤(6)发酵液8-20ml，离心水洗后弃上清，将菌体冻干称重即可得到其发酵液中破囊壶菌生物量；
(8)、测定DHA产量：取冻干的菌体加入2ml的4％的H2SO4-甲醇，100μl内标(1g/L十九烷酸)，80°水浴1h后取出冷却；
加入1ml灭菌水，1ml正己烷，混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量。
实施例1：
使用菌种为：破囊壶菌Schizochytrium sp.PKU#Mn4(拉丁文：Schizochytrium sp.PKU#Mn4，保藏日期：2014-4-9，保藏单位：CGMCC，编号：CGMCC 8091)，进行M4培养基与M4tju培养基发酵：
(1)、破囊壶菌发酵培养基M4tju制备：取甘油40g、酵母提取物2.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，超纯水溶解后定容至1L，搅拌并超声5分钟至完全溶解，分装至至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(2)、破囊壶菌通用培养基M4制备：取葡萄糖20g、酵母提取物1g、蛋白胨1.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声5分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(3)、破囊壶菌固体培养基M4制备：取葡萄糖20g、酵母提取物1g、蛋白胨1.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，琼脂20g，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声5分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，冷却至60℃，倒入培养皿，即可得到固体平板；
(4)、菌种的活化：在超净台内，用灭菌的接种环从固体培养基上挑取破囊壶菌接种于M4培养基平板上三区划线，接种量为5％，置27℃培养箱中培养48h，得活化菌种；
(5)、破囊壶菌种子液制备：
挑取一环活化菌种接种于通用培养基M4中，将其放入条件为150rpm，28℃的摇床中培养24h；
(6)、摇瓶发酵培养发酵液：
在超净台内，用移液枪取5ml上述破壶囊菌种子液的菌液至灭菌的M4tju培养基中，温度28℃、转速150r/min，培养4天，96h取样，得到含DHA的发酵液；
(7)、测定生物量干重：取出上述步骤(6)发酵液8ml，离心水洗后弃上清，将菌体冻干称重即可得到其发酵液中破囊壶菌生物量；
(8)、测定DHA产量：取冻干的菌体加入2ml的4％的H2SO4-甲醇；
100μl内标(1g/L十九烷酸)，80°水浴1h后取出冷却；
加入1ml灭菌水，1ml正己烷，混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量。
分析样品后可知使用M4培养基发酵培养培养，96h其生物量(Biomass)为：7.413g/L，DHA产量为：0.854g/L；而使用M4tju培养基进行发酵培养，96h其生物量为：8.023g/L，DHA产量为：1.154g/L，其DHA产量提高了35％(见附图1)。
实施例2：
使用菌种为：破囊壶菌Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16(拉丁文：Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16，保藏日期：2014-4-9，保藏单位：CGMCC，编号：CGMCC 8095)，进行M4培养基与M4tju培养基发酵：
(1)、破囊壶菌发酵培养基M4tju制备：取甘油：60g、酵母提取物7.5g、磷酸二氢钾1.0g、人工海盐20g，超纯水溶解后定容至1L，搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装至至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(2)、破囊壶菌通用培养基M4制备：取葡萄糖20g、酵母提取物1g、蛋白胨1.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，冷却至室温；
(3)、破囊壶菌固体培养基M4制备：取葡萄糖20g、酵母提取物1g、蛋白胨1.5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐33g，琼脂20g，超纯水溶解后定容至1L，玻璃棒搅拌并超声5分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，冷却至60℃，倒入培养皿，即可得到固体平板；
(4)、菌种的活化：在超净台内，用灭菌的接种环从固体培养基上挑取破囊壶菌接种于M4培养基平板上三区划线，接种量为10％，置29℃培养箱中培养24h，得活化菌种；
(5)、破囊壶菌种子液制备：
挑取一环活化菌种接种于通用培养基M4中，将其放入条件为150rpm，28℃的摇床中培养48h；
(6)、摇瓶发酵培养发酵液：
在超净台内，用移液枪取5ml上述破壶囊菌种子液的菌液至灭菌的M4tju培养基中，温度28℃、转速150r/min，培养4天，96h取样，得到含DHA的发酵液；
(7)、测定生物量干重：取出上述步骤(6)发酵液20ml，离心水洗后弃上清，将菌体冻干称重即可得到其发酵液中破囊壶菌生物量；
(8)、测定DHA产量：取冻干的菌体加入2ml的4％的H2SO4-甲醇；
100μl内标(1g/L十九烷酸)，80°水浴1h后取出冷却；
加入1ml灭菌水，1ml正己烷，混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量。
分析样品后可知使用M4培养基发酵培养培养，96h其生物量(Biomass)为：
6.225g/L，DHA产量为：0.843g/L；而使用M4tju培养基进行发酵培养，96h其生物量为：8.054g/L，DHA产量为：1.427g/L，其DHA产量提高了69％(见附图2)。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
参考文献
1.程汝滨.裂壶藻遗传转化体系的建立和油脂合成相关基因的遗传转化[D].,2011.
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