技术领域
本发明属于微生物基因工程技术领域，特别涉及一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法。
背景技术
芽孢杆菌是一类重要的生防微生物资源，可产生具有多种生物功能的代谢产物和酶等功能分子，因而广泛应用于农业和养殖业生物防治、医药开发、工业酶制剂、饲料加工以及环境污染治理等众多领域。暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)是一种新型的芽孢杆菌菌种，其产生的次级代谢产物对许多病原细菌(如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌，副溶血性弧菌及创伤弧菌等)和真菌(如尖孢镰刀菌、辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、烟草黑胫病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌及稻瘟病菌等)均有强烈的抑菌活性，具有广阔的应用价值(许本宏等，2018；Meidong R等，2017；Fan等，2016；陈倩倩等，2017；冯志珍等，2012)。然而，从自然界获得的微生物菌种的生产性能往往达不到商业开发价值，因此通常需要对其性能进一步改进，以提高其产抗能力或高产某种单组份活性物的能力。
随着生物信息学及分子遗传学技术的快速发展，通过基因工程技术对具有潜在应用价值的优良菌种进行遗传改良备受青睐。然而，基因工程改造的关键技术瓶颈之一就是遗传转化技术，只有将需要改造的目的基因导入到目标菌株之后才能对目标菌株进行改造。目前，可以用于芽孢杆菌转化的方法主要有：感受态转化法、原生质体转化法、电穿孔转化法等。感受态转化法虽然操作简单，但成功率极低，而原生质体转化法转化率相对较高，但步骤繁琐，且条件不易控制，因此目前最频繁运用的是电击转化法。然而，电击转化法虽然操作相对简便、转化效率相对较高、参数容易控制、无残余毒性，且适用于一些难转化的菌株，但由于不同菌株生理特性差异大，其合适的电转化参数往往不同。因此，探索并确定暹罗芽孢杆菌合适的电转化参数对其高效遗传转化方法的构建至关重要。
由于芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，有较厚的细胞壁，因此芽孢杆菌转化困难及转化效率低的问题一直备受关注。目前，关于芽孢杆菌的遗传转化方法虽然已有成功先例，但除了枯草芽孢杆菌模式菌的转化体系较为成熟外，其它野生型芽孢杆菌的遗传转化体系仍然在不断尝试与改进，而关于暹罗芽孢杆菌遗传转化方法或其基因工程改造方面的研究至今未见报道。此外，不同于枯草芽孢杆菌168、WB600和WB800等模式菌株，野生型暹罗芽孢杆菌通常存在严格的限制性修饰系统，易降解外源DNA，且其细胞膜通透性一般较低，不利于胞内外物质的顺利进出，因而进一步加大了DNA转化的操作难度。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法，是以暹罗芽孢杆菌感受态细胞为转化受体，用电击转化法将DNA分子导入至暹罗芽孢杆菌感受态细胞中；
所述的暹罗芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)挑取暹罗芽孢杆菌的单菌落接种到2×YT液体培养基中，震荡培养；次日取菌液转接到2×YT液体培养基中，培养至OD600为0.2～0.5，向培养液中补充添加1％的DL-苏氨酸、2％的甘氨酸、0.1％的色氨酸和0.03％的吐温80，相同条件继续培养1～1.5h(优选1h)，用预冷无菌的离心管收集细菌体，冰浴20～30min(优选20min)，让细菌停止生长；
(2)离心，弃去上清液收集菌体，并尽量吸尽残留的培养液；
(3)加入预冷的电击缓冲液洗涤菌体，轻缓地来回吹打使之重悬，离心弃上清，重复洗涤菌体4次以上；
所述的电击缓冲液：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，0.5M海藻糖，去离子水定容至1000mL，pH自然，灭菌备用；
(4)用电击缓冲液再次重悬菌体；
(5)分装感受态细胞，每管装80μL，制备的感受态细胞现制现用；
步骤(1)中，
优选的，所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)JFL15，但不限于此。
所述的2×YT液体培养基：胰蛋白胨16g/L，酵母提取粉10g/L，NaCl 5g/L，调pH至7.2～7.4，灭菌备用；
优选的，所述的震荡培养的条件为35～37℃震荡培养过夜；更优选为37℃震荡培养过夜；
优选的，所述的培养至OD600为0.2～0.5的条件为200r/min培养1.5～3h至OD600为0.2～0.5。
步骤(2)中所述的离心的条件为4℃，8000×g，离心10min；
所述的电击转化法为在电压2.1kV、电容25μF和电阻200Ω的电击参数下电击电击缓冲液中的暹罗芽孢杆菌感受态细胞。
所述的电击的时间为4～5ms。
所述的电击转化法包括如下步骤：
1)取新鲜制备的暹罗芽孢杆菌感受态细胞；
2)向暹罗芽孢杆菌感受态细胞中加入DNA分子，用移液器轻轻混匀；
3)将感受态细胞加入到已预冷的电击杯中，轻轻扣下电击杯使感受态细胞沉到底部，电击杯放置冰中5～10min后，将电击杯外面的水用擦镜纸擦干后，再进行电击操作；
4)电压2.1kV、电容25μF和电阻200Ω的电击参数电击4～5ms，电击完成后要立即加入复苏培养基到电击杯中，用移液器使细胞重悬，然后将培养液转移至离心管中，振荡培养；
所述的复苏培养基：2×YT液体培养基加入0.5M山梨醇和0.38M甘露醇；
5)取菌液涂布到LB抗性平板进行筛选，并对LB抗性平板生长出的菌落进行PCR鉴定，获得DNA分子成功转化的暹罗芽孢杆菌。
优选的，步骤2)中所述的DNA分子为质粒pHT08-Cas9-gRNA或pHT08-cody-up-down，其浓度为600～1200ng/μL(质粒浓度低于600ng/μL可能会导致转化失败)；
优选的，步骤4)中所述的振荡培养的条件为于37℃、200r/min振荡培养2～3h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明对暹罗芽孢杆菌JFL15电击转化过程中的感受态细胞的制备、质粒的浓度以及电击参数等因素进行了全面的优化，首次建立了一套简单、有效的暹罗芽孢杆菌遗传转化方法。该遗传转化体系的最佳条件如下：感受态细胞制备时添加1％DL-苏氨酸、2％甘氨酸、0.1％色氨酸和0.03％吐温80，电击缓冲液中不含盐离子、只含0.5M山梨醇、0.5M甘露醇和0.5M海藻糖，电转质粒浓度最好在600ng/μL以上，最佳电击参数为电压2.1kv、电击时间4～5ms、电容25μF和电阻200Ω。
(2)本发明的暹罗芽孢杆菌遗传转化方法操作简单，转化率高，效果稳定，可高效转化用于CRISPR-cas9基因敲除以及用于同源重组敲除载体的大片度质粒(>11kbp)，不仅为暹罗芽孢杆菌的遗传改造奠定了良好基础，对加快其在工业生产中的应用具有重要意义，同时也为其它芽孢杆菌的遗传转化提供了重要参考。
附图说明
图1是质粒pHT08-cas9-gRNA的图谱；
图2是质粒pHT08-cody-up-down的图谱；
图3是质粒pHT08-cas9-gRNA电击转化暹罗芽孢杆菌后的转化子生长结果。
图4是转化子中质粒pHT08-cas9-gRNA的提取验证结果；M：DNA Maker4；1～8：重组质粒pHT08-cas9-gRNA。
图5是转化子中质粒pHT08-cas9-gRNA的PCR鉴定结果；M：DNA Maker4；1：ddH2O对照；2，3，4：质粒pHT08-cas9-gRNA PCR鉴定。
图6是转化子中Cas9蛋白的表达纯化结果；M：Protein Maker；1：蛋白提取的上清液；2，3：Ni柱纯化中1×Ni-NTA washing buffer洗脱两次的收集液；4～7：Ni柱纯化中1×Ni-NTA elute buffer洗脱四次的收集液。
图7是质粒pHT08-cody-up-down电击转化暹罗芽孢杆菌后的转化子生长结果。
图8是转化子中质粒pHT08-cody-up-down的提取验证结果；M：DNA Maker4；1，2，3：重组质粒pHT08-cody-up-down。
图9是转化子中质粒pHT08-cody-up-down的PCR鉴定结果；M：DNA Maker3；1，5：ddH2O对照；2，3，4：质粒pHT08-cody-up-down上游同源臂PCR鉴定结果；6，7，8：质粒pHT08-cody-up-down下游同源臂PCR鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中所用的暹罗芽孢杆菌JFL15为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)JFL15，在文献“带鱼肠道中芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵液抗菌性质研究.《水产科学》,2018,37(2).”中公开。
实施例中所用的质粒pHT08购自德国mobitech公司；
质粒p415-GalL-Cas9-CYC1t(货号：43804)、质粒pHT-6xR.ads-PxylA-DI(货号：47386)均购于Addgene公司。
实施例中所述的敲除载体pHT08-cas9-gRNA的构建步骤如下：
敲除载体pHT08-cas9-gRNA的构建分为两部分，第一步先构建中间载体pHT08-cas9，第二步构建敲除载体pHT08-cas9-gRNA。敲除载体参照必克隆试剂盒构建完成。
(一)pHT08-cas9中间载体的构建
(1)载体pHT08双酶切
过夜活化含pHT08载体的大肠杆菌(DH5α)，提取质粒pHT08，质粒经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，双酶切体系如下：
pHT08 plasmid 85μL BamHⅠ 2.5μL XbaⅠ 2.5μL 10×FastDigest Buffer 10μL 总体积 100μL
将上述组分依次加入到0.2mL PCR管中，混匀，反应体系于37℃水浴中酶切30min，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，判断其是否酶切完全。
将酶切产物用1％回收琼脂糖凝胶电泳分离，回收酶切中的大片段，用紫外分光光度计测定回收片段的浓度。
(2)Cas9序列的扩增
过夜活化含p415-GalL-Cas9-CYC1t载体的大肠杆菌(DH5α)，提取质粒p415-GalL-Cas9-CYC1t，以p415-GalL-Cas9-CYC1t质粒为模板，进行含18bp pHT-6xR.ads-PxylA-DI质粒同源序列的cas9基因扩增。反应程序设置为：98℃预变性2min；98℃变性10s；62℃退火10s；72℃延伸21s；34个循环；72℃再延伸5min，4℃保持。反应体系如下：
Cas9-F 1.0μL Cas9-R 1.0μL 2×PrimeSTAR Max Premix 25μL DNA 2μL ddH2O 21μL Total Volume 50μL
Cas9-F：5′-GCGGCCGCATGGACAAGAAGTACTCCATTG-3′；
Cas9-R：5′-TCTAGATCACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGTCAGCC-3′。
(3)pHT08-Cas9载体的构建
将经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切得到的pHT08载体线性大片段与含18bp同源序列的cas9基因回收片段连接，连接反应参照南京爱必梦生物科技有限公司必克隆试剂盒(Ligation-Free Cloning Kit，货号E002)完成。回收纯化后的载体和cas9基因片段按以下反应体系配制(基因片段与载体的摩尔比为1：3～1：10之间)：
5×MasterMix 4μL cas9 fragment 10～200ng pHT08 BamHⅠ and XbaⅠproduct 50～200ng RNase Free H2O to 20μL Total Volume 20μL
将反应体系放入冰浴中30min即可进行大肠杆菌(DH5α)转化，步骤如下：
①将上述必克隆反应体系加入到60μL感受态细菌中，轻混匀后，在冰浴上孵育30min。
②将反应体系放入预热的42℃水浴中放置45s进行热击处理。
③取出反应后立即放置在冰浴上2min。
④加入150μL不含任何抗生素的LB培养液，置于37℃摇1小时以使细菌复苏。
⑤将复苏后的细菌均匀地铺在预温的、含有100μg/mL Amp的LB琼脂平板培养基上，37℃培养过夜。
(4)pHT08-Cas9载体的鉴定及测序
将在含100μg/mL Amp的平板上长出的单菌落随机挑取几个分别接种于含Amp抗性的LB液体培养基中培养，然后取适量菌液作为模板用Cas9-F/Cas9-R进行PCR鉴定。将PCR鉴定后的阳性菌落进行质粒的提取和测序，将测序正确的质粒命名为pHT08-Cas9。
(二)pHT08-Cas9-gRNA敲除载体的构建
(1)中间载体pHT08-Cas9单酶切
过夜活化含pHT08-Cas9载体的大肠杆菌(DH5α)，提取质粒pHT08-Cas9，质粒经XbaⅠ单酶切，单酶切体系如下：
pHT08-Cas9 plasmid 175μL XbaⅠ 5μL 10×FastDigest Buffer 20μL Total Volume 200μL
将上述组分依次加入到1.5mL离心管中，混匀，反应体系于37℃水浴中酶切30min，酶切产物用核酸纯化试剂盒进行回收。
(2)pHT08-Cas9单酶切回收片段的去磷酸化
将pHT08-Cas9单酶切回收片段进行去磷酸化处理，体系如下：
pHT08-Cas9 fragment 87μL Alkaline Phosphatase 3μL 10×Alkaline Phosphatase Buffer 10μL Total Volume 100μL
将上述组分依次加入到1.5mL离心管中，混匀，反应体系于37℃水浴中反应10min，后将反应体系置于75℃中放置5min，灭活碱性磷酸酶的活性。去磷酸化产物用核酸纯化试剂盒进行回收。
(3)gRNA片段的扩增
以暹罗芽孢杆菌JFL15中的一种全局调控因子Cody作为敲除靶基因，设计gRNA序列(见SEQ ID NO：3)，然后交由上海捷瑞生物工程有限公司进行化学合成，并连入pGH-T载体，形成pGH-gRNA中间质粒。过夜活化含pGH-gRNA载体的大肠杆菌(DH5α)，提取质粒pGH-gRNA，以pGH-gRNA质粒为模板，进行含18bp pHT08-Cas9质粒同源序列的gRNA框架扩增。反应程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性35s；63℃退火35s；72℃延伸30s；34个循环；72℃再延伸10min，4℃保持。反应体系如下：
10×PCR Buffer 5.0μL dNTP Mixture(10mmol/L) 4.0μL gRNA-F 1.0μL gRNA-R 1.0μL Ex Taq(5U/μL) 0.5μL DNA 2μL ddH2O 37.5μL Total Volume 50μL
gRNA-F：5′-GCCTAGTTAAGTAGCTATTCTAGAGAGTTCTGAGAATTGG TATGCC-3′；
gRNA-R：5′-CTTCTTCTCCTTCCACACTACTAGTGTCGACGTCCCC-3′。
将PCR产物用1％回收琼脂糖凝胶电泳分离，回收gRNA框架片段，用紫外分光光度计测定回收片段的浓度。
(4)pHT08-Cas9-gRNA载体的构建
将经XbaⅠ单酶切得到去磷酸化的pHT08-Cas9线性片段与含18bp同源序列的gRNA框架片段连接，连接反应参照必克隆试剂盒完成。回收纯化后的载体和gRNA框架片段按以下反应体系配制(基因片段与载体的摩尔比为1：3～1：10之间)：
5×MasterMix 4μL gRNA fragment 12μL pHT08-Cas9 XbaⅠproduct 4μL Total Volume 20μL
将反应体系放入冰浴中30min即可进行大肠杆菌(DH5α)转化，步骤同pHT08-Cas9载体的转化。
(5)pHT08-Cas9-gRNA载体的鉴定
将在含100μg/mL Amp的平板上长出的单菌落随机挑取几个分别接种于含Amp抗性的LB液体培养基中培养，然后取适量菌液作为模板用C9-cpdy-F/C9-cpdy-R进行PCR鉴定。将PCR鉴定后的阳性菌落进行质粒的提取和测序，将测序正确的质粒命名为pHT08-Cas9-gRNA。
实施例中所述的敲除载体pHT08-cody-up-down的构建步骤如下：
(1)pHT08-cody-up中间载体的构建
提取的质粒pHT08经SacⅠ单酶切，单酶切体系如下：
pHT08 plasmid 75μL SacⅠ 5μL 10×FastDigest Buffer 20μL Total Volume 100μL
将上述组分依次加入到1.5mL离心管中，混匀，反应体系于37℃水浴中酶切30min，酶切产物用核酸纯化试剂盒进行回收。
将上述获得的pHT08单酶切回收片段进行去磷酸化处理，体系如下：
pHT08 fragment 87μL Alkaline Phosphatase 3μL 10×Alkaline Phosphatase Buffer 10μL Total Volume 100μL
将上述组分依次加入到1.5mL离心管中，混匀，反应体系于37℃水浴中反应10min，后将反应体系置于75℃中放置5min，灭活碱性磷酸酶的活性。去磷酸化产物用核酸纯化试剂盒进行回收。
cody-up框架片段和cody-down框架片段的扩增：根据暹罗芽孢杆菌JFL15的全基因组数据(Genbank登录号：NZ_KQ236689.1)，在Cody基因上、下游各1500bp范围内设计上下游同源臂引物，并分别添加含SacⅠ和PaeⅠ/SphⅠ酶切位点的18bp pHT08质粒的同源序列。利用上下游引物对上下游同源臂分别进行克隆。反应程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性35s；63℃退火35s；72℃延伸90s；34个循环；72℃再延伸10min，4℃保持。反应体系如下：
10×PCR Buffer 5.0μL dNTP Mixture(10mmol/L) 4.0μL Up-F/Down-F 1.0μL Up-R/Down-R 1.0μL Ex Taq(5U/μL) 0.5μL DNA 2μL ddH2O 37.5μL Total Volume 50μL
将PCR产物用1％回收琼脂糖凝胶电泳分离，回收上、下游同源臂片段，记为cody-up、cody-down，用紫外分光光度计测定回收片段的浓度。
将上述获得的pHT08线性片段与含18bp同源序列的cody-up框架片段连接，连接反应参照必克隆试剂盒完成。回收纯化后的载体和cody-up框架片段按以下反应体系配制(基因片段与载体的摩尔比为1：3～1：10之间)：
5×MasterMix 4μL cody-up fragment 12μL pHT08 SacⅠproduct 4μL Total Volume 20μL
将反应体系放入冰浴中30min即可进行大肠杆菌(DH5α)转化，步骤同pHT08-Cas9载体的转化。
将在含100μg/mL Amp的平板上长出的单菌落随机挑取几个分别接种于含Amp抗性的LB液体培养基中培养，然后取适量菌液作为模板用Up-F/Up-R进行PCR鉴定。将PCR鉴定后的阳性菌落进行质粒的提取并送华大基因进行测序，将测序正确的质粒命名为pHT08-cody-up。
(2)pHT08-cody-up-down敲除载体的构建
提取质粒pHT08-cody-up，质粒经PaeⅠ和SphⅠ双酶切，双酶切体系如下：
pHT08-cody-up plasmid 80μL PaeⅠ 5μL SphⅠ 5μL 10×FastDigest Buffer 10μL 总体积 100μL
将上述组分依次加入到0.2mL PCR管中，混匀，反应体系于37℃水浴中酶切30min，酶切产物将酶切产物用1％回收琼脂糖凝胶电泳分离，回收酶切中的大片段，用紫外分光光度计测定回收片段的浓度。
将上述回收获得的pHT08-cody-up线性片段与含18bp同源序列的cody-down框架片段连接，连接反应参照必克隆试剂盒完成。回收纯化后的载体和cody-down框架片段按以下反应体系配制(基因片段与载体的摩尔比为1：3～1：10之间)：
5×MasterMix 4μL cody-down fragment 8μL pHT08-cody-up PaeⅠ and SphⅠproduct 8μL Total Volume 20μL
将反应体系放入冰浴中30min即可进行大肠杆菌(DH5α)转化，步骤同pHT08-Cas9载体的转化。
将在含100μg/mL Amp的平板上长出的单菌落随机挑取几个分别接种于含Amp抗性的LB液体培养基中培养，然后取适量菌液作为模板用Down-F/Down-R进行下游同源臂片段的PCR鉴定。将PCR鉴定后的阳性菌落进行质粒的提取并送华大基因进行测序，将测序正确的质粒命名为pHT08-cody-up-down。
实施例1
一、仪器或设备：
pH计PB-10购于赛多利斯公司；生化培养箱SPX-158L购于中国宁波新芝；Eppendorf离心机5418购于Eppendorf公司；蒸气灭菌锅YXQ50购于西安太康；超净工作台SKJH-1109购于上海苏坤；双光束紫外可见分光光度计UV2310II购于杭州奥盛；Nano Drop分光光度计ND-1000购于Nano Drop公司；电击转化仪MicroPulser购于美国Bio-Red。
二、菌株、质粒及引物：
暹罗芽孢杆菌JFL15分离自带鱼肠道，对多种病原细菌和真菌均具有强烈抑菌活性，保藏于华南农业大学食品学院食品生物技术研究所，已进行全基因组测序(Genbank登录号：NZ_KQ236689.1)。
CRISPR-cas9基因敲除载体pHT08-cas9-gRNA，其质粒图谱如图1所示，是在pHT08质粒基础上改造获得。
同源重组敲除载体pHT08-cody-up-down，其质粒图谱如图2所示，同样是在pHT08质粒基础上改造获得。
cas9-gRNA(4528bp)片段扩增引物：
C9-cpdy-F：5′-ATGGCTTTACTACAAAAAACACGAATTATTAACAG-3′；
C9-cpdy-R：5′-CGCGCTTCTTCTTCGATTTCTTCTG-3′。
上游同源交换臂鉴定引物：
Up-F：5′-TTATAAAAATTGAAGCGACAAAATTTACAGAAGTCGGC-3′；
Up-R：5′-ATTGCGTTGCGCGTTAAATAATCCTCCTAGAATTC-3′。
下游同源交换臂鉴定引物：
Down-F：5′-GTTGCTGGCGTTTCCAAAAGCAGGATCCCT-3′；
Down-R：5′-CCACTTACATCACCTTACTTTCCGATTTCTAAAGCCT-3′。
三、培养基及试剂
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取粉5g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1000mL，琼脂粉20g(仅固体培养基)，调pH至7.2～7.4，121℃灭菌30min；
2×YT液体培养基：胰蛋白胨16g，酵母提取粉10g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.2～7.4，115℃灭菌30min；
电击缓冲液：山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，海藻糖0.5M，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌30min；
复苏培养基：胰蛋白胨16g，酵母提取粉10g，NaCl 5g，山梨醇0.5M，甘露醇0.38M，蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.2～7.4，115℃灭菌30min。
Ex Taq酶、dNTPs、10×Ex Taq Buffer、Premixed Protein Maker(low)均为Takara公司产品，DNA Maker4、DNA Maker 3、20bp Lader、6×Loading Buffer、蛋白酶K、溶菌酶购自东盛生物科技有限公司。抗生素购自Aldrich公司，IPTG购自成硕化学试剂公司，其他普通试剂均为国产分析纯；去内毒素的质粒中提取试剂盒HiPure Plasmid EF Midi Kit购自广州美基生物科技有限公司；引物由上海捷瑞广州分公司合成，DNA及质粒序列测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。必克隆试剂盒(Ligation-Free Cloning Kit)，货号E002，购自南京爱必梦生物科技有限公司(abmgoodchina Inc.)。
四、暹罗芽孢杆菌感受态细胞制备：
(1)从-80℃冰箱中取出保存的暹罗芽孢杆菌JFL15菌株，用接种环划线接种到LB平板上，37℃过夜培养；
(2)挑取单菌落接种到10mL 2×YT液体培养基中，37℃震荡培养过夜。次日取1mL菌液转接到装有75mL 2×YT液体培养基的250mL三角瓶中，200r/min培养至OD600为0.2(约2h)左右，向培养液中补充添加1％(m/v)的DL-苏氨酸、2％(m/v)的甘氨酸、0.1％(m/v)的色氨酸和0.03％(m/v)的吐温80，相同条件继续培养1h，用预冷无菌的离心管收集细菌体，冰浴20min，让细菌停止生长；
(3)4℃，8000×g，离心10min，弃去上清液收集菌体，将离心管倒置于无菌滤纸上，尽量吸尽残留的培养液；
(4)加入预冷的电击缓冲液20mL洗涤菌体，用移液器轻缓地来回吹打使之重悬，离心弃上清，重复洗涤菌体4次；
(5)用电击缓冲液1mL再次重悬菌体；
(6)分装感受态细胞，每管装80μL，制备的感受态细胞现制现用。
五、电击转化步骤：
(1)用去内毒素的质粒中提取试剂盒(美基生物HiPure Plasmid EF Midi Kit)提取重组质粒pHT08-Cas9-gRNA和pHT08-cody-up-down，浓度600～1200ng/μL(质粒浓度低于600ng/μL可能会导致转化失败)。
(2)取新鲜制备的暹罗芽孢杆菌感受态细胞；
(3)向80μL感受态细胞中加入20μL构建好的敲除质粒(pHT08-Cas9-gRNA和pHT08-cody-up-down)，用移液器轻轻混匀；
(4)将感受态细胞加入到已预冷的2mm电击杯中，轻轻扣下电击杯使感受态细胞沉到底部，电击杯放置冰中约10min后，将电击杯外面的水用擦镜纸擦干后，再进行电击操作；
(5)使用电压2.1kV、电容25μF和电阻200Ω的电击参数电击4～5ms，电击完成后立即加入1mL复苏培养基到电击杯中，用移液器使细胞重悬，然后将培养液转移至1.5mL的离心管中，放置于37℃摇床中200r/min振荡培养2～3h；
(6)取100μL菌液涂布到含5μg/mL氯霉素的LB平板，37℃过夜培养；
六、转化结果验证：
构建成功的pHT08-cas9-gRNA质粒经电击转化暹罗芽孢杆菌JFL15，结果如图3所示，在含5μg/mL氯霉素的LB抗性平板上长出8个转化子，说明pHT08-cas9-gRNA质粒可能已成功转入暹罗芽孢杆菌JFL15。挑取8个转化子于5μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，过夜培养后，10000rpm，离心1min收集菌体后，用20mg/mL的溶菌酶在37℃水浴中处理45min，再根据质粒试剂盒流程(美基生物HiPure Plasmid EF Midi Kit)提取质粒，结果如图4所示，质粒条带在15000bp左右，与预期大小相符。选取3个上述提取的质粒，使用引物C9-cpdy-F/C9-cpdy-R进行cas9-gRNA(4528bp)片段的PCR扩增鉴定，结果如图5所示，PCR扩增的条带在5000bp左右，与预期大小相符，说明质粒pHT08-cas9-gRNA已经成功转化暹罗芽孢杆菌JFL15中。由于本试验中用的pHT08质粒是芽孢杆菌常用的蛋白表达载体，里面有8个组氨酸标签，可以使用镍柱纯化含组氨酸标签的目的蛋白，因此可以对Cas9蛋白进行纯化鉴定。选取一株成功转化pHT08-cas9-gRNA质粒的暹罗芽孢杆菌JFL15进行Cas9蛋白表达，并将表达上清液经超滤浓缩后过镍柱纯化，纯化结果如图6所示，纯化后的洗脱液中在130～180kDa之间有一条明显的条带，而Cas9蛋白的分子量为156kDa，说明转化pHT08-cas9-gRNA质粒已成功转入暹罗芽孢杆菌JFL15中，并可在0.2～0.8mmol/L的IPTG诱导下成功表达Cas9蛋白。
实施例2
本实施例与实施例1不同点在于使用的穿梭载体为pHT08-cody-up-down同源重组质粒，其余同实施例1。
将构建成功的pHT08-cody-up-down质粒经电击转化暹罗芽孢杆菌JFL15，结果如图7所示，在含5μg/mL氯霉素的LB抗性平板上长出大量转化子，表明质粒pHT08-cody-up-down可能已经成功转化暹罗芽孢杆菌JFL15，且质粒pHT08-cody-up-down的转化效率明显高于质粒pHT08-cas9-gRNA。随机挑取3个转化子于含5μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，过夜培养后，提取质粒，结果如图8所示，质粒条带在8000～15000bp之间，与预期11000bp大小相符。将上述提取的3个质粒使用引物(Up-F/Up-R和Down-F/Down-R)同时进行上下游同源臂片段的PCR鉴定，结果如图9所示，上、下游同源臂均扩增出单一条带，大小在1200～2000bp之间，与预期1500bp大小相符，说明质粒pHT08-cody-up-down已经成功转化暹罗芽孢杆菌JFL15中。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cas9-F
<400> 1
gcggccgcat ggacaagaag tactccattg 30
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cas9-R
<400> 2
tctagatcac accttcctct tcttcttggg gtcagcc 37
<210> 3
<211> 412
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA序列
<400> 3
gagttctgag aattggtatg ccttataagt ccaattaaca gttgaaaacc tgcataggag 60
agctatgcgg gttttttatt ttacataatg atacataatt taccgaaact tgcggaacat 120
aattgaggaa tcatagaatt ttgtcaaaat aattttattg acaacgtctt attaacgttg 180
atataattta aattttattt gacaaaaatg ggctcgtgtt gtacaataaa tgtagtgcca 240
tttctttaaa gtttacgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 300
atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttta gcccgcctaa tgagcgggct 360
tttaaaaaag cccgctcatt aggcgggctg ccccggggac gtcgactcta ga 412
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA-F
<400> 4
gcctagttaa gtagctattc tagagagttc tgagaattgg tatgcc 46
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA-R
<400> 5
cttcttctcc ttccacacta ctagtgtcga cgtcccc 37
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C9-cpdy-F
<400> 6
atggctttac tacaaaaaac acgaattatt aacag 35
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C9-cpdy-R
<400> 7
cgcgcttctt cttcgatttc ttctg 25
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Up-F
<400> 8
ttataaaaat tgaagcgaca aaatttacag aagtcggc 38
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Up-R
<400> 9
attgcgttgc gcgttaaata atcctcctag aattc 35
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Down-F
<400> 10
gttgctggcg tttccaaaag caggatccct 30
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Down-R
<400> 11
ccacttacat caccttactt tccgatttct aaagcct 37