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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510920390.9 (22)申请日 2015.12.11 C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人 郭镭 地址 100018 北京市朝阳区金盏乡东苇路 39 号天安假日别墅区圣释园区 申请人 里程 圣释 （北京） 生物工程有限公司 (72)发明人 郭镭 (74)专利代理机构 北京瑞恒信达知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11382 代理人 曹津燕 张伟 (54) 发明名称 一种 hUC-MSC 的无血清分步培养方法及采用 所述方法获得的 hUC-MSC (57) 摘要 本发明公开了一种人脐带间充质干细胞 (。
2、human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUC-MSC) 无血清培养方案。该方案采用分 步法培养hUC-MSC ： 先使用TME培养基培养3-4小 时促进hUC-MSC贴壁， 然后更换为TMD培养基进行 快速扩增。TME 和 TMD 无血清分步培养法很好地 解决了 hUC-MSC 无血清培养方法中细胞贴壁能力 差、 增殖缓慢、 易分化等问题， 为 hUC-MSC 进行长 期稳定的无血清培养技术奠定基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图11页 CN 105420。
3、188 A 2016.03.23 CN 105420188 A 1/2 页 2 1.一种用于 hUC-MSC 的无血清分步培养方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： 采用 TME 培 养基和TMD培养基分步进行hUC-MSC的无血清培养， 其中所述TME培养基含有a-MEM、 -巯 基乙醇和非必需氨基酸， 所述 TMD 培养基含有 a-MEM/DMEM-F12、 - 巯基乙醇、 非必需氨基 酸、 重组人碱性成纤维生长因子 (b-FGF) 和血清替代物。 2.根据权利要求1所述的培养方法， 其特征在于， 所述hUC-MSC为从自然分娩或剖宫产 的健康新生儿脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。 3。
4、.根据权利要求 1 或 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述 TME 培养基含有 0.05-0.2 体积份的 - 巯基乙醇、 0.5-2 体积份的非必需氨基酸水溶液和 95-100 体积份的 a-MEM， 其 中， 所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、 丙氨酸、 L-天门酰胺、 L-天冬 氨酸、 谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸 ； 优选地， 所述 TME 培养基含有 0.1 体积份的 - 巯基乙醇、 1 体积份的非必需氨基酸水 溶液和 99 体积份的 a-MEM ； 优选地， 所述 TME 培养基由所述 a-MEM、 - 巯基乙醇和非必需氨基酸水溶液组成。 4.根据权利要求 。
5、1 至 3 中任一项所述的培养方法， 其特征在于， 所述 TMD 培养基包含 0.05-0.2 体积份的 - 巯基乙醇、 0.5-2 体积份的非必需氨基酸水溶液、 8-12 体积份的血 清替代物、 85-95 体积份的 a-MEM/DMEM-F12 和终浓度为 5-15ng/ml 的重组人碱性成纤维生 长因子， 其中， 所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为 8-12mM 的甘氨酸、 丙氨酸、 L- 天门酰 胺、 L- 天冬氨酸、 谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸 ； 优选地， 所述 TMD 培养基包含 0.1 体积份的 - 巯基乙醇、 1 体积份的非必需氨基酸水 溶液、 10 体积份的血清替代物、 89。
6、 体积份的 a-MEM/DMEM-F12 和终浓度为 10ng/ml 的重组人 碱性成纤维生长因子 ； 优选地， 所述TMD培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、 -巯基乙醇、 非必需氨基酸水溶液、 重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法包括以下 步骤 ： (1) 将 hUC-MSC 以 0.5-4104个细胞 /cm 2的密度接种于 TME 培养基中进行贴壁培养 ； (2) 培养 3-6 小时之后， 弃去 TME 培养基， PBS 清洗， 更换为 TMD 培养基， 每 3-5 天更换 新鲜的 TMD 培养基 。
7、； (3) 待细胞达 70-90汇合后， 收集细胞备用、 冻存或重复步骤 (1) 和 (2) 传代培养 ； 可选择地， 取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞， 检测以下项目中的一项或多项 ： 分化能力、 细胞活性、 细胞纯度、 细胞污染和增殖特性。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法包括以下 步骤 ： (1) 将 hUC-MSC 以 2104个细胞 /cm 2的密度接种于 TME 培养基中进行贴壁培养 ； (2) 培养 3-4 小时后， 弃去 TME 培养基， PBS 清洗 1 次， 更换为预先 37孵育的 TMD 培 养基， 每 3 天更换新鲜的 TM。
8、D 培养基 ； (3) 待细胞达 90汇合后， 收集细胞备用、 冻存或重复步骤 (1) 和 (2) 传代培养 ； 可选择地， 取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞， 检测以下项目中的全部 ： 分化能力、 细胞活 性、 细胞纯度、 细胞污染和增殖特性。 权 利 要 求 书 CN 105420188 A 2 2/2 页 3 7.通过权利要求 1 至 6 中任一项所述的方法获得的 hUC-MSC。 8.根据权利要求 7 所述的 hUC-MSC， 其特征在于， 所述 hUC-MSC 具有以下特征 ： (1) 粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长 ； (2)表达CD29、 CD44、 CD73、 CD90。
9、、 CD105和HLA-ABC的阳性比例大于99.0； 表达CD45、 CD34 和 HLA-DR 的阳性比例小于 1.0 ； (3) 体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞 ； (4) 活细胞检测比率达 99以上 ； (5) 呈典型的 “S 型” 生长曲线特性 ； (6) 多能性基因表达， 所述多能性基因为选自 SSEA-4、 OCT-4、 NANOG 和 SOX-2 中的一种 或多种。 9.一种用于无血清分步培养 hUC-MSC 的 TME 培养基和 / 或 TMD 培养基。 10.根据权利要求 9 所述的 TME 培养基和 / 或 TMD 培养基， 其特征在于， 所述 TME 培养 基包含 。
10、a-MEM、 - 巯基乙醇和非必需氨基酸， 优选含有 0.1 体积份的 - 巯基乙醇、 1 体积 份的非必需氨基酸和 99 体积份的 a-MEM， 更优选由所述 a-MEM、 - 巯基乙醇和非必需氨基 酸组成 ； 所述 TMD 培养基含有 a-MEM/DMEM-F12、 - 巯基乙醇、 非必需氨基酸、 重组人碱性成纤 维生长因子和血清替代物， 优选含有 0.1 体积份的 - 巯基乙醇、 10ng/ml 的重组人碱性成 纤维生长因子、 1 体积份的非必需氨基酸、 10 体积份的血清替代物和 89 体积份的 a-MEM/ DMEM-F12 ； 更优选由所述 a-MEM、 - 巯基乙醇、 非必需氨基。
11、酸、 重组人碱性成纤维生长因子 和血清替代物组成。 权 利 要 求 书 CN 105420188 A 3 1/8 页 4 一种 hUC-MSC 的无血清分步培养方法及采用所述方法获得 的 hUC-MSC 技术领域 0001 本发明涉及干细胞的研究领域， 特别是涉及一种 hUC-MSC 的新型、 高效的无血清 培养方法。 背景技术 0002 间充质干细胞普遍存在于人体多种组织和器官中， 并具有多向分化潜能， 具有刺 激组织再生、 调节免疫等功能， 在细胞治疗领域有着广阔的应用前景。 0003 骨髓间充质干细胞已经在临床上得到了广泛应用， 而目前的研究表明， 脐带来源 的间充质干细胞不但能够成为骨。
12、髓间充质干细胞的理想替代物， 而且具有更大的应用潜 能。其中， 源于人脐带的人脐带间充质干细胞 (human Umbilical Cord mesenchymal stem cells， hUC-MSC) 表达多种胚胎干细胞的特有标志， 具有分化潜力大、 增殖能力强、 免疫原性 低、 取材方便、 无道德伦理问题的限制、 易于工业化制备等特征， 而且研究证实 hUC-MSC 在 神经疾病、 免疫系统、 内分泌系统以及癌症、 心脏病等疾病的动物模型和临床研究中有良好 治疗效果， 因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 0004 若要将 hUC-MSC 进一步应用于临床， 最重要的就是 hUC。
13、-MSC 的体外大量扩增达到 有效的临床治疗剂量， 因此 hUC-MSC 的体外培养成为了最基础同时也是最重要的技术之 一。现有的 hUC-MSC 培养方法多采用在基础培养基中添加 FBS、 青链霉素， 但非人血清成分 复杂， 使 hUC-MSC 在长期的培养过程中易分化， 且非存在传播异种病原体的危险。 0005 此外， 虽然已有科研工作者开发出多种类型的血清替代物， 但目前市场可购买的 供 hUC-MSC 培养的血清替代物以及完全培养基的培养效果仍不理想， 尤其对于干细胞的贴 壁、 增殖、 以及细胞长期培养后的稳定性的维持等特性均无法达到预期效果。 发明内容 0006 因此本发明的目的是针。
14、对本领域的需要， 提供一种能够获得贴壁能力好、 增殖快 速、 易分化的 hUC-MSC 培养方法。 0007 本发明的另一目的是提供通过本发明的方法获得的 hUC-MSC。 0008 具体而言， 本发明提供一种新型的无血清分步培养 hUC-MSC 的培养方案， 利用此 方法可在无血清环境下进行 hUC-MSC 的长期扩增培养， 同时确保其在长期培养情况下依然 保持多潜能性及较强的增殖能力。 0009 本发明的技术方案如下。 0010 一方面， 本发明提供了一种用于 hUC-MSC 的无血清分步培养方法， 所述方法包括 ： 采用 TME 培养基和 TMD 培养基分步进行 hUC-MSC 的无血清。
15、培养。 0011 其中， 所述 hUC-MSC 为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织分离出的人脐 带间充质干细胞。目前本领域已有多种公知的人脐带间充质干细胞分离方法。 0012 本发明采用的 TME 培养基包含 a-MEM、 - 巯基乙醇和非必需氨基酸。优选地， 所 说 明 书 CN 105420188 A 4 2/8 页 5 述 TME 培养基含有 0.05-0.2 体积份的 - 巯基乙醇、 0.5-2 体积份的非必需氨基酸水溶液 和95-100体积份的a-MEM， 其中， 所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、 丙氨酸、 L- 天门酰胺、 L- 天冬氨酸、 谷氨酸、 。
16、脯氨酸和丝氨酸 ； 更优选地， 所述 TME 培养基含 有 0.1 体积份的 - 巯基乙醇、 1 体积份的非必需氨基酸水溶液和 99 体积份的 a-MEM ； 进一 步优选地， 所述 TME 培养基由所述 a-MEM、 - 巯基乙醇和非必需氨基酸水溶液组成。 0013 本发明采用的 TMD 培养基含有 a-MEM/DMEM-F12、 - 巯基乙醇、 非必需氨基酸、 重 组人碱性成纤维生长因子 (b-FGF) 和血清替代物。 0014 优选地， 所述 TMD 培养基包含 0.05-0.2 体积份的 - 巯基乙醇、 0.5-2 体积份的 非必需氨基酸水溶液、 8-12 体积份的血清替代物、 85-。
17、95 体积份的 a-MEM/DMEM-F12 和终浓 度为 5-15ng/ml 的重组人碱性成纤维生长因子， 其中， 所述非必需氨基酸水溶液包含浓度 各为 8-12mM 的甘氨酸、 丙氨酸、 L- 天门酰胺、 L- 天冬氨酸、 谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸 ； 更优 选地， 所述 TMD 培养基包含 0.1 体积份的 - 巯基乙醇、 1 体积份的非必需氨基酸水溶液、 10 体积份的血清替代物、 89 体积份的 a-MEM/DMEM-F12 和终浓度为 10ng/ml 的重组人碱性 成纤维生长因子。优选地， 所述 TMD 培养基由所述 a-MEM/DMEM-F12、 - 巯基乙醇、 非必需 氨基酸水。
18、溶液、 重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。 0015 根据本申请的具体实施方式， 所述非必需氨基酸水溶液可以采用 Gibco 公司货号 为 11140 的产品。 0016 根据本申请的具体实施方式， 所述血清替代物可以采用 KnockOutTMSerum Replacement(Gibco 公司产品， 货号 10828-010)。 0017 进一步地， 所述培养方法包括以下步骤 ： 0018 (1)将hUC-MSC以0.5-4104个细胞/cm 2的密度接种于TME培养基中培养3-6小 时 ； 细胞在此步骤中进行显著的贴壁 ； 0019 (2) 弃去 TME 培养基， PBS 清洗， 。
19、更换为 TMD 培养基， 每 3-5 天更换新鲜的 TMD 培养 基 ； 细胞在此步骤中进行显著的扩增 ； 0020 (3) 待细胞达 70-90汇合后， 收集细胞备用、 冻存或重复步骤 (1) 和 (2) 传代培 养 ； 0021 可选择地， 取步骤 (3) 收集的 hUC-MSC 细胞， 检测以下项目中的一项或多项 ： 分化 能力、 细胞活性、 细胞纯度、 细胞污染和增殖特性。 0022 优选地， 所述培养方法包括以下步骤 ： 0023 (1) 将 hUC-MSC 以 2104个细胞 /cm 2的密度接种于 TME 培养基中进行贴壁培养 ； 0024 (2) 培养 3-4 小时后， 弃去 。
20、TME 培养基， PBS 清洗 1 次， 更换为预先 37孵育的 TMD 培养基， 每 3 天更换新鲜的 TMD 培养基 ； 0025 (3) 待细胞达 90汇合后， 收集细胞备用、 冻存或重复步骤 (1) 和 (2) 传代培养 ； 0026 可选择地， 取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞， 检测以下项目中的全部 ： 分化能力、 细 胞活性、 细胞纯度、 细胞污染和增殖特性。 0027 根据本发明的具体实施方式， 所述用于 hUC-MSC 的无血清分步培养方法包括以下 步骤 ： 0028 (1) 使用 TME 培养基以一定密度接种 hUC-MSC 于六孔板或 T75 培养瓶内进行贴壁 培养 。
21、； 优选地， hUC-MSC 的接种密度为约 2104个细胞 /cm 2； 说 明 书 CN 105420188 A 5 3/8 页 6 0029 (2)接种4小时后， 用移液器小心吸弃旧TME培养基， 用PBS洗一遍， 更换为同样预 先 37孵育的 TMD 培养基 ； 0030 (3) 待细胞达 90汇合后， 利用上述方案进行传代培养或冻存细胞。 0031 选择性地， 针对步骤 (3) 所得的 hUC-MSC， 检测以下项目 ： 分化能力、 细胞活性、 细 胞纯度、 细胞污染和增殖特性。 0032 另一方面， 本发明还提供通过上述方法获得的 hUC-MSC。 0033 优选地， 所述 hUC。
22、-MSC 具有以下特征 ： 0034 (1) 粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长 ； 0035 (2) 表达 CD29、 CD44、 CD73、 CD90、 CD105 和 HLA-ABC 的阳性比例大于 99.0； 表达 CD45、 CD34 和 HLA-DR 的阳性比例小于 1.0 ； 0036 (3) 体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞 ； 0037 (4) 活细胞检测比率达 99以上 ； 0038 (5) 呈典型的 “S 型” 生长曲线特性 ； 0039 (6) 多能性基因表达， 所述多能性基因为选自 SSEA-4、 OCT-4、 NANOG 和 SOX-2 中的 一种或多种。 004。
23、0 又一方面， 本发明还提供在上述培养方法中采用的 TME 培养基和 / 或 TMD 培养基。 0041 本发明中所述的TME培养基和TMD培养基均为无血清组分， 且组成明晰， 避免了在 培养细胞培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况， 也排除了传播异种 病原体危险的可能。 0042 此外， 利用分步培养方案， 先使用 TME 培养基培养促进 hUC-MSC 贴壁， 然后更换为 TMD 培养基进行快速扩增， 很好地解决了常规无血清培养中细胞贴壁能力差， 增殖缓慢的缺 点， 且在长期培养过程中， 细胞仍能保持良好的增殖能力和多向分化潜能， 为动物细胞的体 外培养提供了一种高效的解决。
24、方案。 0043 并且， 本发明的方法操作简单易行， 缩短了原代培养时间。 0044 经流式细胞仪测定， 经活力检测、 分化能力鉴定以及多能性基因分析， 通过本发明 方法获得的间充质干细胞活率高， 纯度高， 分化能力强， 建立的细胞库可直接用于科学研究 和临床辅助治疗。 附图说明 0045 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中 ： 0046 图 1 是使用含血清培养基培养 hUC-MSC 的图， 其中图 1A 为接种 2 小时后的细胞形 态， 图 1B 为接种 24 小时后的细胞形态， 图 1C 为接种 48 小时后的细胞形态。 0047 图 2 是在培养基组成筛选过程中的细胞图。
25、， 其中图 2A 为高浓度 - 巯基乙醇培养 基在细胞接种 4 小时后细胞形态， 图 2B 为低浓度血清替代物培养基接种 48 小时后细胞形 态， 图 2C 为高浓度血清替代物培养基接种 24 小时后细胞形态， 图 2D 为低浓度 bFGF 培养基 接种 24 小时后细胞形态， 图 2E 为高浓度 bFGF 培养基培养细胞在传代后细胞形态。 0048 图3是使用TME培养基培养hUC-MSC的图， 其中图3A为接种2小时后的细胞形态， 图 3B 为接种 24 小时后的细胞形态， 图 3C 为接种 48 小时后的细胞形态。 0049 图4是使用TMD培养基培养hUC-MSC的图， 其中图4A为接。
26、种2小时后的细胞形态， 说 明 书 CN 105420188 A 6 4/8 页 7 图 4B 为接种 24 小时后的细胞形态， 图 4C 为接种 48 小时后的细胞形态。 0050 图 5 是利用本发明分步培养方法培养 hUC-MSC 的图， 其中图 5A 为使用 TME 培养基 接种 2 小时后的细胞形态， 图 5B 为使用 TME 培养基接种 4 小时后更换为 TMD 培养基继续培 养至 24 小时的细胞形态， 图 5C 为使用 TME 培养基接种 4 小时后更换为 TMD 培养基继续培 养至 48 小时的细胞形态。 0051 图 6(6A 至 6I) 为采用本发明的无血清分步培养方法获。
27、得的 hUC-MSC 经流式细 胞仪分析细胞表面分子的结果， 显示所述 hUC-MSC 表达 CD29、 CD44、 CD73、 CD90、 CD105、 HLA-ABC 的阳性比例大于 99 ； 表达 CD45、 CD34、 HLA-DR 的阳性比例小于 1。 0052 图 7 为 Vi-Cell 细胞活力分析仪对获得的 hUC-MSC 的细胞活力、 生长特性分析结 果， 其中图 7A 为 hUC-MSC 的直径分布图， 图 7B 为 hUC-MSC 的生长曲线， 图 7C 为 hUC-MSC 的 实时活力分析， 结果表明所述 hUC-MSC 的活性在 99.7以上， 细胞直径分布在 13m。
28、 左右， 并且具有潜伏期、 对数增长期、 平台期的增殖特性。 0053 图 8 为获得的 hUC-MSC 向成骨细胞和成骨细胞的定向诱导分化结果， 其中图 8A 示 出了茜素红与成骨过程的钙结节发生显色反应产生的深红色化合物， 图8B示出了油红O对 成脂细胞的脂肪泡特异性着色。 0054 图9为免疫荧光染色分析获得的hUC-MSC多能性特异蛋白， 从左到右， 从上到下依 次为 SSEA-4、 SOX-2、 OCT-4、 NANOG。 具体实施方式 0055 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 0056 未注明具体条。
29、件的， 按照本发明所属领域的常规条件或仪器试剂供应商的建议条 件进行 ； 为注明商购来源的， 为可以市售购得的常规产品。 0057 实施例 1 常规有血清培养基培养 hUC-MSC 0058 受试培养基 ： 89 体积份的 -MEM， 10胎牛血清 (FBS)、 100U/ml 青霉素、 100U/ ml 链霉素， 0.1 体积份的 - 巯基乙醇， 10ng/ml 的 b-FGF， 1 体积份的非必需氨基酸水溶液 (11140， Gibco 公司 )。 0059 在生物安全柜内， 取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第 3 代的 hUC-MSC， 以 2104个细胞 /cm 2密度接种于 。
30、T75 细胞培养瓶， 加 15mL 受试培养基， 移入 CO 2 浓度为 5的 37恒温培养箱中。接种 2 小时后观察细胞贴壁情况， hUC-MSC 大量细胞贴 壁， 有触角伸出 ； 在 48 小时后观察， hUC-MSC 达 90汇合 ； 细胞触角舒展， 明亮。 0060 细胞形态参见图 1。但是， 在细胞培养过程中， 引入血清会造成传播异种病原体风 险， 并且因血清批次差异也会导致细胞生长过程不稳定。 0061 实施例 2 常规市售无血清培养基培养 hUC-MSC 0062 参考实施例 1 方法， 以相同细胞源、 相同密度接种， 加 15mL 市售无血清培养基 ( 赛 业公司产品， 货号 。
31、HUXUC-90061) 培养细胞。接种 2 小时后观察细胞已贴壁， 细胞明亮， 多呈 圆形， 触角为伸展 ； 在接种 24 小时后观察细胞， hUC-MSC 在显微镜下明亮， 触角延伸， 扩增不 明显 ； 在接种 48 小时后， 细胞汇合率达 50左右 ； 接种 72 小时后观察细胞， hUC-MSC 细胞 明亮， 达 90以上汇合， 胰酶消化收集细胞冻存。 说 明 书 CN 105420188 A 7 5/8 页 8 0063 选择地， 细胞达100汇合后， 继续培养后， 细胞从培养瓶边缘处开始卷曲脱落。 由 此可知， 当缺乏血清成分时， 细胞易脱落， 难以维持良好贴壁状态。 0064 实。
32、施例 3 培养基组成的筛选 0065 ( 一 )TME 培养基组成的筛选 0066 受试培养基 ： 0.01、 0.02、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.3 或 0.5 体积份的 - 巯基乙醇， 1 体积份的非必需氨基酸水溶液 (11140， Gibco 公司 )， 99 体积份的 a-MEM。 0067 参考实施例 1 方法， 以相同细胞源、 相同密度接种， 加 15mL 受试培养基培养细胞。 观察细胞贴壁情况。 0068 结果 ： 在培养基中分别含0.01和0.02体积份-巯基乙醇的两个浓度组中， 细胞 贴壁速度较慢， 在接种 4 小时后， 仍有部分细胞未贴壁， 约 8 。
33、小时后， 细胞基本全部贴壁 ； 在 培养基中分别含 0.05、 0.1、 0.15 和 0.2 体积份 - 巯基乙醇的四个浓度组中， 在接种 4 小 时后细胞已完全贴壁， 细胞明亮， 伸出触角 ； 在培养基中分别含 0.3 和 0.5 体积份 - 巯基 乙醇的两个浓度组中， 在接种 4 小时后， 细胞也已经贴壁， 但部分细胞状态变差， 出现分化 早期症状 ( 见图 2A)。 0069 ( 二 )TMD 培养基组成的筛选 0070 TME培养基 ： 0.1体积份的-巯基乙醇， 1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140， Gibco 公司 )， 99 体积份的 a-MEM。 0071 受试培养基 。
34、： 0.1 体积份的 - 巯基乙醇， 10ng/ml 的重组人碱性成纤维生长因子 (b-FGF， Peprotech 公司 )， 1 体积份的非必需氨基酸水溶液 (11140， Gibco 公司 )， 1、 2、 5、 8、 10、 12、 15 或 20 体积份的 Knockout FBS 血清替代物 (10828-028， Gibco 公司 )， 89 体积份 的 a-MEM。 0072 参考实施例 1 方法， 以相同细胞源、 相同密度接种， 加 15mL TME 培养基培养细胞。 接种 2 小时后观察细胞已贴壁， 继续培养， 接种约 4 小时后细胞即完全贴壁， 更换 15mL 受试 培养。
35、基。观察细胞生长情况。 0073 结果 ： 在培养基中分别含 1、 2、 5 体积份血清替代物的三个浓度组中， 细胞增殖缓 慢， 在接种24小时后观察细胞， hUC-MSC部分细胞聚集， 细胞扁平， 折光率差， 汇合度达20 左右， 接种 48 小时后观察细胞， hUC-MSC 细胞明亮， 达 60左右汇合后， 基本停止增殖 ( 见 图 2B) ； 在培养基中分别含 8、 10、 12 体积份血清替代物的三个浓度组中， 细胞生长状态良 好， 在接种 24 小时后观察细胞， hUC-MSC 呈梭形旋涡状聚集， 伸展度高， 细胞明亮， 汇合度达 40-60， 接种 48 小时后观察细胞， hUC-。
36、MSC 细胞明亮， 达 90以上汇合 ； 在培养基中分别 含 15、 20 体积份血清替代物的两个浓度组中， 出现和低浓度组相同的状况， 细胞生长缓慢， 细胞扁平化， 轮廓清晰 ( 见图 2C)。 0074 ( 三 )TMD 培养基组成的筛选 0075 TME培养基 ： 0.1体积份的-巯基乙醇， 1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140， Gibco 公司 )， 99 体积份的 a-MEM。 0076 受试培养基 ： 0.1 体积份的 - 巯基乙醇， 1、 2、 5、 8、 10、 12、 15、 18 或 20ng/ml 的 重组人碱性成纤维生长因子 (b-FGF， Peprotech 公。
37、司 )， 1 体积份的非必需氨基酸水溶液 (11140， Gibco 公司 )， 10 体积份的 Knockout FBS 血清替代物 (10828-028， Gibco 公司 )， 89 体积份的 a-MEM。 说 明 书 CN 105420188 A 8 6/8 页 9 0077 参考实施例 1 方法， 以相同细胞源、 相同密度接种， 加 15mL TME 培养基培养细胞。 接种 2 小时后观察细胞已贴壁， 继续培养， 接种约 4 小时后细胞即完全贴壁， 更换 15mL 受试 培养基。观察细胞生长情况。 0078 结果 ： 在培养基中分别含 1、 2ng/ml bFGF 的两个浓度组中， 。
38、细胞增殖缓慢， 细胞状 态差， 呈现营养不足状态 ( 参见图 2D) ； 在培养基中分别含 5、 8、 10、 12、 15ng/ml bFGF 的浓 度组中， 细胞正常生长， 亮度高， 生长好 ； 在培养基中分别含 18、 20ng/ml bFGF 的浓度组中， 细胞增殖良好， 明亮， 但经过多次传代过程中， 细胞易分化， 细胞会成团状汇集， 或触角变长 ( 参见图 2E)。 0079 实施例 4 利用 TME 培养基培养 hUC-MSC 0080 TME培养基 ： 0.1体积份的-巯基乙醇， 1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140， Gibco 公司 )， 99 体积份的 a-MEM。 。
39、0081 在生物安全柜内， 取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第 3 代的 hUC-MSC， 以 2104个细胞 /cm 2密度接种于 T75 细胞培养瓶， 加 15mL TME 培养基， 移入 CO 2 浓度为 5的 37恒温培养箱中。接种 2 小时后观察细胞已贴壁伸出触角， 在 24 小时和 48 小时移出培养箱观察， 细胞贴壁状况良好， 但出现大量漂浮死细胞。增殖不明显 ； 接种后第 3 天， 更换新鲜 ME 培养基继续培养， 细胞逐渐从瓶底脱落死亡， 增殖不明显。 0082 细胞形态参见图 3。 0083 实施例 5 利用 TMD 培养基培养 hUC-MSC 0084 TMD 培。
40、养基 ： 0.1 体积份的 - 巯基乙醇， 10ng/ml 的重组人碱性成纤维生长因子 (b-FGF， Peprotech 公司 )， 1 体积份的非必需氨基酸水溶液 (11140， Gibco 公司 )， 10 体积 份的 Knockout FBS 血清替代物 (10828-028， Gibco 公司 )， 89 体积份的 a-MEM。 0085 参考实施例 4 方法， 以相同细胞源、 相同密度接种， 加 15mL TMD 培养基培养细胞。 同样在接种 2 小时后观察细胞贴壁情况， hUC-MSC 仍有大量细胞漂浮未贴壁 ； 在 24 小时后 观察细胞， 细胞贴壁不均匀， 局部聚集 ； 在 。
41、48 小时后观察， hUC-MSC 细胞贴壁更大面积聚集 ； 接种后第 3 天， 更换新鲜 TMD 培养基继续培养， 部分细胞在换液过程中脱落， 少部分细胞呈 局部老化死亡， 培养至 96 小时后， 细胞汇合度约 90。 0086 细胞形态参见图 4。 0087 实施例 6 无血清分步培养 hUC-MSC 0088 TME培养基 ： 0.1体积份的-巯基乙醇， 1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140， Gibco 公司 )， 99 体积份的 a-MEM ； 0089 TMD 培养基 ： 0.1 体积份的 - 巯基乙醇， 10ng/ml 的重组人碱性成纤维生长因子 (b-FGF， Peprot。
42、ech 公司 )， 1 体积份的非必需氨基酸水溶液 (11140， Gibco 公司 )， 10 体积 份的 Knockout FBS 血清替代物 (10828-028， Gibco 公司 )， 89 体积份的 a-MEM。 0090 参考实施例 4 方法， 以相同细胞源、 相同密度接种， 加 15mL TME 培养基培养细胞。 接种 2 小时后观察细胞已贴壁， 继续培养， 接种约 4 小时后细胞即完全贴壁， 更换新鲜 TMD 培养基 ； 在接种 24 小时后观察细胞， hUC-MSC 呈梭形旋涡状聚集， 伸展度高， 细胞明亮， 汇合 度达 40-60 ； 接种 48 小时后观察细胞， hUC。
43、-MSC 细胞明亮， 达 90以上汇合， 胰酶消化收 集细胞冻存。 0091 选择地， 细胞达 100汇合后， 继续培养后， 细胞未卷起脱落， 维持长时间良好贴 说 明 书 CN 105420188 A 9 7/8 页 10 壁。 0092 细胞形态参见图 5。 0093 将实施例 6 与实施例 1 相比较可知， 本发明采取 TME 培养基和 TMD 培养基进行无 血清分步培养， 实现了与常规有血清培养的相同结果， 但同时又避免了在培养细胞由于引 入血清造成传播异种病原体风险， 也避免了培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程 不稳定的情况。 0094 实施例 7 流式细胞仪分析 hUC-MS。
44、C 的表面标志 0095 取实施例6培养的第3代细胞， 待细胞生长至90汇合后， 2mL 0.125胰酶消化， 然后在 4下 1200rpm 离心 6 分钟， 弃上清收集细胞， PBS 清洗两次， 将细胞每管 1105个 转移至流式管， 分别加 5L CD34-PE、 CD45-FITC、 CD29-FITC、 CD44-PE、 CD73-PE、 CD105-PE、 CD90-FITC、 HLA-ABC-FITC、 HLA-DR-PE、 IgG1-PE( 同型对照 ) 和 IgG1-FITC( 同型对照 ) 抗 体， 混匀 4下避光孵育 30 分钟， PBS 清洗一次， 离心去上清， 加 50。
45、0L PBS 缓冲液重悬混 匀， 上机检测 ( 流式细胞仪 XL， Beckman 公司 )， 每个样本收集 1104个细胞。 0096 结果参见图 6。 0097 实施例 8 细胞活力仪分析 hUC-MSC 的细胞活力、 生长特性 0098 取实施例 6 培养的第 3 代细胞接种到 T25 培养瓶中， 待细胞达到 95 -100汇合 后， 0.125胰酶消化， 收集细胞以 1105个 / 孔密度接种于两个 6 孔板。待细胞全部贴壁 且部分生长 10 小时后， 收集两孔细胞加 500L PBS 制成细胞悬液， 上机分析 ( 细胞活力分 析仪 Vi-Cell XR， Beckman 公司 )。此。
46、后每 12 小时取样分析， 绘制生长曲线。 0099 结果参见图7， 表明hUC-MSC活性在99.7以上， 细胞直径分布在在9-15m， 并且 具有潜伏期、 对数增长期、 平台期的增殖特性。 0100 实施例 9 hUC-MSC 多向分化潜能的鉴定 0101 1) 成骨诱导分化 0102 取实施例 6 培养的第 3 代 hUC-MSC 以 3104个细胞 /cm 2接种至 6 孔细胞培养 板， 24 小时后， 每孔添加新鲜配制的人 UC MSC 成骨诱导分化培养基 (HUXUC-90021， 赛业产 品 )2mL， 此后每 3 天更换新鲜的成骨分化诱导培养基， 2 周后多聚甲醛固定， 茜素红。
47、染色 3-5min。 0103 结果参见图 8A， 表明以本发明方法得到的 hUC-MSC 在成骨诱导两周后， 茜素红与 成骨过程的钙结节发生深红色显色反应。 0104 2) 成脂诱导分化 0105 取实施例 6 培养的第 3 代 hUC-MSC 以 2104个细胞 /cm 2接种至 6 孔细胞培养板， 待细胞达到 100汇合后， 每孔添加成脂诱导分化培养基 A 液 (HUXUC-90031， 赛业产品 ) 开 始诱导， 3天后换成成脂诱导分化培养基B液进行维持24小时， 如此循环。 当脂滴出现较多 但较小时， 用成脂诱导液 B 维持 7 天， 诱导结束后 4多聚甲醛固定， 油红 O 染色。 。
48、0106 结果参见图8B， 表明以本发明方法得到的hUC-MSC在成脂诱导两周后， 油红O对成 脂细胞着色明显。 0107 实施例 10 免疫荧光染色分析 hUC-MSC 特异性蛋白 0108 取实施例 6 培养的第 5 代 hUC-MSC 以 5103个细胞每孔的密度接种于 24 孔 细胞培养板， 待细胞生长至 30 50汇合， 以 4多聚甲醛固定 15 分钟后用 0.25 说 明 书 CN 105420188 A 10 8/8 页 11 TritonX-100 打孔处理 20 分钟， 山羊血清封闭后加稀释好的鼠抗人一抗 ( 抗 -SOX2 抗体、 抗-OCT4抗体、 抗-NANOG抗体和抗。
49、-NANOG抗体)， 在4下过夜避光孵育 ； 之后加FITC标记 的山羊抗鼠二抗， 在室温下避光孵育 2 小时 ； 然后以 DAPI/PI 染核， 在室温避光孵育 20min， 荧光显微镜下观察。 0109 结果参见图 9， 表明以本发明方法分步培养的 hUC-MSC 表达 SOX-2、 OCT-4、 NANOG 以及 SSEA-4 特异性蛋白。 0110 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求的范 围。 说 明 书 CN 105420188 A 11 1/11 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 105420188 A 12 2/11 页 13 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 105420188 A 13 3/11 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 105420188 A 14 4/11 页 15 说 明 书 附 图 CN 105420188 A 15 5/11 页 16 说 明 书 附 图 CN 105420188 A 16 6/11 页 。