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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510560617.3 (22)申请日 2015.09.07 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 云南省农业科学院粮食作物研究所 地址 650000 云南省昆明市北京路 2238 号 (72)发明人 寇姝燕 袁平荣 邹茜 (74)专利代理机构 四川君士达律师事务所 51216 代理人 芶忠义 (54) 发明名称 一种广谱稻瘟病抗病基因 Pi40 的 SCAR 标记 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种广谱稻瘟病抗病基因Pi40 的 SCAR 标记及其应用， 利用 PCR。
2、 分子标记技术 从 3 份 Pi40 粳稻材料中扩增， 筛选获得特异性片 段， 然后经回收、 测序、 引物设计， 最终转化为一 个 pi40 特异性 SCAR 标记 ； 该标记在单基因系、 及 186 份水稻育成品种中进一步检测， 发现其对 Pi40 基因具有很高的特异性 ； 在分子标记辅助育 种中， 利用该标记通过 PCR 可快速准确筛选出后 代群体的抗性单株。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 105400866 A 2016.03.16 CN 105400866 A 1/1 页 2 。
3、1.一种广谱稻瘟病抗病基因 Pi40 的 SCAR 标记， 其特征在于， 引物的序列为 ： 5 -tgcacctgaagaagatctact-3 、 5 -cccccaggtcgtgataccttc-3 。 2.权利要求1所述广谱稻瘟病抗病基因Pi40的SCAR标记在分子标记鉴定过程中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 105400866 A 2 1/6 页 3 一种广谱稻瘟病抗病基因 Pi40 的 SCAR 标记及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 涉及一种广谱稻瘟病抗病基因 Pi40 的 SCAR 标记 及其应用。 背景技术 0002 稻瘟病(rice blast)。
4、由子囊菌(Magnaporthe grisea)的无性世代(Pyricularia grisea)引起， 是水稻生产中危害最严重的世界性的水稻病害。 我国每年因稻瘟病而损失的 稻谷约 10 亿千克， 稻瘟病已成为制约我国粮食安全及水稻稳产高产的瓶颈。有效防控稻瘟 病对保障我国粮食安全意义重大。我国对水稻稻瘟病抗性育种也十分重视， 在水稻品种区 试中， 高感的水稻品种不能通过区试， 具有一票否决的作用。水稻育种实践证明 ： 选育利用 抗病新品种 ( 组合 ) 是防止该病最行之有效的措施， 同时， 也是减少农业污染、 降低农业生 产投入、 增加农民收入的可持续发展的最为经济有效的方法 ； 而水稻抗。
5、稻瘟病育种的核心 是稻瘟病抗性基因， 尤其是广谱持久抗稻瘟基因， 的发掘与利用。 0003 水稻上， 对多个稻瘟菌生理小种表现抗性的基因， 称为广谱抗瘟基因。一般认为， 广谱抗瘟基因与水稻的水平抗性有关， 由多基因控制。 但是有报道表明， 在水稻生产中某些 携带一个主效抗瘟基因的栽培品种对病原菌有较广的抗谱， 同时在长时间栽种过程中抗性 也不会丧失， 具有较好的广谱持久抗性。水稻广谱持久抗瘟基因 Pi40 来源于澳洲野生稻， Pi40 位于水稻第 6 号染色体着丝粒附近的抗瘟基因簇内， 位于标记 S2539 和 RM3330 之间， 遗传距离分别为 3.8cM 和 2.4cM， 对来自韩国和菲。
6、律宾毒性最强的稻瘟病菌株表现较强的 抗性。 通过电子着陆(e-Landing)技术分析， 在70Kb的染色体区域内， DNA标记9871.T7E2b 与 Pi40(t) 紧密连锁 (Khush and Jena,2007)。 0004 SCAR(sequence characterized amplified regions 特定序列扩增 ) 标记通常是 从RAPD、 SRAP、 SSR标记转化而来。 SCAR标记是将特异标记片断从凝胶上回收并进行克隆和 测序， 根据其碱基序列设计一对特异引物 (18-24 碱基 ) ； 也可对 RAPD 标记末端进行测序， 在原 RAPD 所用 10 碱基引。
7、物的末端增加 14 个左右的碱基， 成为与原 RAPD 片断末端互补的 特异引物。SCAR 标记一般表现为扩增片断的有无， 是一种显性标记。抗稻瘟病基因 Pi40 的 特异 SCAR 分子标记的开发为 pi40 分子辅助选择育种提供技术基础。 发明内容 0005 为了解决现有技术中存在的技术问题， 本发明提供了一种广谱稻瘟病抗病基因 Pi40 的 SCAR 标记及其应用。利用 PCR 分子标记技术从 3 份 Pi40 粳稻材料中扩增， 筛选获 得特异性片段， 然后经回收、 测序、 引物设计， 最终转化为一个 pi40 特异性 SCAR 标记 ； 该标 记在单基因系、 及 186 份水稻育成品种。
8、 ( 系 ) 中进一步检测， 发现其对 Pi40 基因具有很高 的特异性 ； 在分子标记辅助育种中， 利用该标记通过 PCR 可快速准确筛选出后代群体的抗 性单株。 0006 其技术方案如下 ： 说 明 书 CN 105400866 A 3 2/6 页 4 0007 一 种 广 谱 稻 瘟 病 抗 病 基 因 Pi40 的 SCAR 标 记，引 物 的 序 列 为 ： 5 -tgcacctgaagaagatctact-3 、 5 -cccccaggtcgtgataccttc-3 。 0008 本发明所述广谱稻瘟病抗病基因 Pi40 的 SCAR 标记在分子标记鉴定过程中的应 用。 0009 与。
9、现有技术相比， 本发明利用 PCR 分子标记技术从 3 份 Pi40 粳稻材料中扩增， 筛 选获得特异性片段， 然后经回收、 测序、 引物设计， 最终转化为一个 pi40 特异性 SCAR 标记 ； 该标记在单基因系、 及 186 份水稻育成品种 ( 系 ) 中进一步检测， 发现其对 Pi40 基因具有 很高的特异性 ； 在分子标记辅助育种中， 利用该标记通过 PCR 可快速准确筛选出后代群体 的抗性单株。 附图说明 0010 图 1 是 3F 引物对 pi 单基因系的扩增结果 ； 0011 图 2 是 Pi40 特异 SCAR 标记对部分群体材料的扩增结果。 具体实施方式 0012 下面结合。
10、具体实施例进一步说明本发明的技术方案。 0013 利用 pi40 特异性 SCAR 标记进行分子标记鉴定的具体方法如下 ： 0014 1、 以中国普感稻瘟病水稻品种丽江新团黑谷、 携带 Pi40 的水稻品系、 Pii、 pi9、 pita、 Piz 等单基因系为对照， 分析 SCAR 标记的特异性 ； 0015 (1)材料 ： 丽江新团黑谷、 3份Pi40高代粳稻回交系(4145、 4150和4163)和pita、 piz、 pikm、 pii 和 pib 等单基因系材料 ； 0016 (2)DNA 提取 ： 上述材料取幼苗叶片， 液氮研磨， 利用 2CTAB 法提取每个样品的基 因组总 DN。
11、A ； 0017 (3) 开发的 Pi40 特异 SCARf 引物的序列为 ： 5 -tgcacctgaagaagatctact-3 、 5 -cccccaggtcgtgataccttc-3 ； 0018 (4)PCR 反应程序为 ： PCR 反应体系共 15l， 其中 10PCRbuffer 1.5ul， dNTP 1.125ul， Taq 0.15ul， Forward Reverse Primer 各 0.1ul, 模板 DNA 1ul， 加 ddH2O 补足 15ul。PCR 循环程序 ： 94预变性 5min， 94变性 30s， 60退火 30s， 72延伸 1min， 25 个 。
12、循环。末次循环结束后， 将反应管置于 72温育 10min， 以确保充分延伸 ； 0019 (5) 上述 PCR 反应产物放置于 1.5琼脂糖凝胶上电泳， 花青素染色， 0.5TBE 电 泳缓冲液， 电压 6V/cm， 电泳时间 40min， 电泳完成后， 在凝胶呈像系统拍照并分析结果 ； 0020 (6)Pi40 特异性 SCAR 引物仅在 3 份 Pi40 高代粳稻回交系中均能够扩增出一条约 550bp 的特征带型， 而在轰早生 ( 云南地方老品种， 携带 pii)、 合系 24 号 ( 云南粳稻课题组 育成品种， 携带 pii 和 pikm)、 IR24( 国际水稻所育成品种， 携带 p。
13、ib)、 地谷 B 和 K22( 外省 引进品种， 携带pi9)、 三磅七十箩(云南地方老品种， 抗病， 基因未知)以及其它单基因系材 料中均没有扩增出特异带型， 如图 1 所示 ： 0021 2、 以 186 份水稻品种为模板， 分析 Pi40 特异 SCAR 标记的应用前景 ； 0022 (1) 材料 ： 水稻材料 186 份， 具体如表 1 所示 ： 0023 (2) 基因组总 DNA 提取、 PCR 反应和电泳检测方法同 1 所述相同 ； 说 明 书 CN 105400866 A 4 3/6 页 5 0024 (3) 结果 ： 如表 1， 在 186 份云南育成水稻品种中的 9 份 (。
14、 楚粳 22 号、 楚粳 27 号、 岫粳 11 号、 岫粳 14 号、 岫糯 3 号、 临籼 21 号、 临籼 26 号、 红优 8 号 ) 中扩增出了特异性的 目标带型， 而在其它 176 份材料中均没有扩增产物出现， 3F 对云南育成水稻品种的检测准 确性达到 94.6， 表明 3F 可以作为今后在云南水稻育种生产中的 pi40 抗性育种的 MAS 标 记加以应用。 0025 表 1 ： 186 份云南水稻材料对 Pi40 特异 SCAR 引物的扩增反应一览表 0026 0027 说 明 书 CN 105400866 A 5 4/6 页 6 0028 说 明 书 CN 105400866。
15、 A 6 5/6 页 7 0029 3、 在抗稻瘟病遗传改良群体中利用 Pi40 特异 SCAR 标记快速筛选抗性单株。 0030 (1) 材料 ： 合系 30 号 /4163 杂交 F2 群体， 214 个单株 ； 0031 (2) 分单株提取 DNA， 提取方法、 PCR 反应和电泳检测方法同 1 所述相同 ； 0032 (3) 结果 ： 在 214 份单株中， 应用开发的 Pi40 特异 SCAR 标记从中检测出带有 Pi40 基因的单株 120 份， 如图 2 所示。 0033 以上所述， 仅为本发明最佳实施方式， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明 披露的技术范围内， 可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的 保护范围内。 0034 说 明 书 CN 105400866 A 7 6/6 页 8 说 明 书 CN 105400866 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 105400866 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105400866 A 10 。