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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510443132.6 (22)申请日 2015.07.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105017412 A (43)申请公布日 2015.11.04 (73)专利权人 中华人民共和国广州机场出入境 检验检疫局 地址 510470 广东省广州市白云国际机场 南工作区横一路 专利权人 中山大学附属第一医院 (72)发明人 柏建山冯少珍戴金黄燕琼 邓艳何淑华陈增荣付腾 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 (51。
2、)Int.Cl. C07K 14/765(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (56)对比文件 张英霞等.黄鳝血清白蛋白的纯化及抗体制 备. 水产养殖 .2012,第33卷(第1期),12-16. 徐云远等.牛血清白蛋白纯化工艺的改进. 甘肃科学学报 .1991,第3卷(第1期),51-54. 审查员 郭婷婷 (54)发明名称 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白 的方法 (57)摘要 本发明属于蛋白纯化技术领域， 具体公开了 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方 法。 本发明将稀释后的牛血清依次经过硫酸铵盐 析、 分子筛层析、 阴。
3、离子交换层析、 病原微生物进 行灭活、 分子筛层析、 超滤浓缩、 过滤除菌最终得 到高纯度牛血清白蛋白。 牛血清白蛋白的纯度高 于99.5%， 而且， 牛血清白蛋白中不含有小分子物 质， 例如氯化钠、 硫酸铵、 氨基酸等； 另外， 牛血清 白蛋白中不含活病毒。 权利要求书1页 说明书5页 附图6页 CN 105017412 B 2018.11.27 CN 105017412 B 1.一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1.向牛血清中加入生理盐水或PBS溶液， 将牛血清稀释； 向稀释后的牛血清中加入适 量硫酸铵， 28静置30min以上， 离心收集上清液。
4、； S2.向上清液中加入23倍体积的PBS溶液， 混匀后进行疏水层析， 使用PBS溶液洗脱， 收集洗脱液； S3.将洗脱液进行分子筛层析， 收集不含盐和其它小分子的蛋白峰； 所述层析填料为 G10G75葡聚糖； S4.使用阴离子交换层析进一步纯化牛血清白蛋白， 通过0.11.5M浓度氯化钠进行梯 度洗脱， 收集精纯的牛血清白蛋白； S5.加入非蛋白质变性类的灭活剂对病原微生物进行灭活， 之后进行分子筛层析， 使用 超纯水洗脱收集牛血清白蛋白； 所述分子筛层析填料为G25或G50的葡聚糖； S6.使用孔径为30K的膜包进行超滤浓缩， 使牛血清白蛋白最终浓度达到5mg/ml以上； 最后使用0.2微。
5、米的滤膜进行过滤除菌； S1所述硫酸铵按每100毫升稀释血清中加入1030g硫酸铵的量加入。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， S1所述生理盐水或PBS溶液的加入量为牛 血清体积的13倍。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， S1所述硫酸铵按每100毫升稀释血清中加 入1525g硫酸铵的量加入。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， S1所述硫酸铵按每100毫升稀释血清中加 入2025g硫酸铵的量加入。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， S2所述疏水层析的填料为苯基-葡聚糖或 丁基-葡聚糖。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， S4所述阴离子。
6、交换层析的填料为DEAE-葡 聚糖。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， S5所述非蛋白质变性类的灭活剂为 -丙内 酯。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105017412 B 2 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方法 技术领域 0001 本发明涉及蛋白纯化技术领域， 具体地， 涉及一种从牛血清中分离高纯度牛血清 白蛋白的方法。 背景技术 0002 牛血清白蛋白 （BSA） ， 又称第五组分 （Cohn Fraction V） ， 也是牛血液的主要成分， 包含583个氨基酸残基， 分子量为66.430 kDa， 等电点约为4.7。 该命名 （第五组分） 规则源于 最初采用冷乙。
7、醇沉淀法的 Cohn 血清白蛋白分离法。 根据 Cohn 氏法， 在第五个乙醇馏分 中找到了血清白蛋白。 其实所谓的牛血清白蛋白第五组分是一种主要含有牛血清白蛋白的 混合物， 而不是纯的牛血清白蛋白。 白蛋白可与多种阳离子、 阴离子和其他小分子物质结 合。 血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、 pH缓冲作用、 载体作用和营养作用。 在动物细 胞无血清培养中， 添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。 牛血清白蛋白在生 化实验中有广泛的应用， 例如在western blot和制备ELISA板中的封闭试剂。 BSA一般做为 稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中， 因为有些酶在低浓。
8、度下不稳定或 活性低。 加入BSA后， 它可能起到 “保护” 或 “载体” 作用， 不少酶类添加 BSA后能使其活性大 幅度提高。 牛血清白蛋白是一种具有很强疏水性和亲水性等多功能特征的蛋白质， 其它蛋 白质不具有这样的特征， 如果牛血清白蛋白不纯， 例如含有其它蛋白质或者小分子物质， 将 会影响其功能。 0003 分离获得纯的血清白蛋白的目的主要是分离除去血浆中其它二百多种杂蛋白和 可能存在的污染物质， 得到无热原、 无抗原抗体反应、 无污染的白蛋白等。 目前， 血清白蛋白 纯化的报道多数是关于人源血清白蛋白的分离纯化： 早期的方法如， Denis的氯化纳法 (1847年)， Hofmeis。
9、ter的硫酸钠法(1890年)和Hermmarsten的硫酸铵分级盐析结晶法(1894 年)。 我国早期使用硫酸铵盐析法生产人血清白蛋白， 但由于硫酸铵生产过程繁琐， 后来也 采用冷乙醇沉淀法。 至今在工业上仍是生产人血清白蛋白的主要方法。 利用冷乙醇沉淀法 也有一些不足： 乙醇是一种非特异性沉淀剂， 尽管对人血清白蛋白生产效果显著， 但产品纯 度不是很高； 作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集或变性； 在非封闭式的环境中 有机溶剂对工作人员危害也较大， 同时残留于产品中乙醇难于除。 为此也有人改用PEG沉淀 法， 以避免蛋白质聚集或变性， 而且不易从白蛋白溶液中除去， 工业生产有一定困难。
10、。 为解 决硫酸铵、 乙醇、 PEG等小分子化学试剂在血清白蛋白中残留和血清白蛋白纯度不高的问 题， 就采用色谱法生产的白蛋白。 但单纯采用色谱法难以有效地抑制或除去热原或者外源 病毒等， 严重影响产品的安全性。 为弥补色谱法的不足， 近期发展了色谱与冷乙醇沉淀相结 合的方法， 二者优势互补， 应用生产后一定效果。 0004 但是， 这些方法纯化的牛血清白蛋白会存在以下缺点： 1） 血清白蛋白中残留大量 的小分子物质或者化学试剂， 例如氯化钠、 硫酸铵、 PEG、 乙醇、 氨基酸、 维生素、 微量元素等； 2） 血清白蛋白纯度不够高； 3） 血清中外源病毒等微生物没有完去除， 影响血清白蛋白的。
11、安 全性。 说明书 1/5 页 3 CN 105017412 B 3 发明内容 0005 本发明的目的是为了克服现有技术的不足， 提供一种从牛血清中分离高纯度牛血 清白蛋白的方法。 0006 为了实现上述目的， 本发明是通过以下技术方案予以实现的： 0007 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方法， 包括以下步骤： 0008 S1. 向牛血清中加入生理盐水或PBS溶液将牛血清稀释； 向稀释后的牛血清中加 入适量硫酸铵， 28静置30min以上， 离心收集上清液； 0009 S2. 向上清液中加入23倍体积的PBS溶液， 混匀后进行疏水层析， 使用PBS溶液洗 脱， 收集洗脱液； 0010 。
12、S3. 将洗脱液进行分子筛层析， 收集不含盐和其它小分子的蛋白峰； 所述层析填 料为G10-G75葡聚糖； 0011 S4. 使用阴离子交换层析进一步纯化牛血清白蛋白， 通过0.11.5M浓度氯化钠进 行梯度洗脱， 收集精纯的牛血清白蛋白； 0012 S5. 加入非蛋白质变性类的灭活剂对病原微生物进行灭活， 之后进行分子筛层 析， 使用超纯水洗脱收集牛血清白蛋白； 所述分子筛层析填料为G25或G50的葡聚糖； 0013 S6.使用孔径为30K的膜包进行超滤浓缩， 使牛血清白蛋白最终浓度达到5mg/ml以 上； 最后使用0.2微米的滤膜进行过滤除菌。 0014 牛血清中蛋白质种类组成复杂， 因此。
13、要想将牛血清白蛋白从中高纯度分离出来， 必须排除其他杂蛋白的掺杂。 传统技术大多是采用普遍适用的氯化纳法、 硫酸钠法和硫酸 铵分级盐析结晶法， 这些普遍适用的方法虽然也能分离到牛血清白蛋白， 但是根本无法排 除其他杂蛋白的掺杂， 即得到的牛血清白蛋白的纯度不高。 本发明通过多年对牛血清的成 分组成的分析研究， 根据血清白蛋白与其他杂蛋白或杂物质的生物活性区别， 开发出一种 高纯度分离白蛋白的方法。 本发明使用到的疏水层析、 分子筛层析、 离子交换层析虽然都是 用于蛋白分离纯化的常规技术手段， 但是， 各种层析的先后顺序却是不可随意调整改变的， 并且我们研究发现， 疏水层析的分辨率和载流量在分离。
14、白蛋白时均比离子交换好， 因此该 组合是最优组合。 0015 优选地， S1所述生理盐水或PBS溶液的加入量为牛血清体积的13倍。 0016 硫酸铵的作用是使蛋白质变性， 暴露蛋白内的疏水基团， 以便根据疏水性质不同 进行分离， 优选地， S1所述硫酸铵的用量为每100毫升稀释血清中加入1030g硫酸铵。 0017 更优选地， S1所述硫酸铵按每100毫升稀释血清中加入1525g硫酸铵的量加入。 0018 最优选地， S1所述硫酸铵按每100毫升稀释血清中加入2025g硫酸铵的量加入。 0019 向稀释后的牛血清中加入硫酸铵后， 最好在28静置1小时以上再进行离心， 收 集上清液； 所述离心的。
15、优选条件为50008000转/分钟， 离心30分钟至1小时。 0020 疏水层析是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发 生可逆性结合而进行分离。 该方法基于的是蛋白质的疏水差异， 在高盐溶液中， 蛋白质会与 疏水配基相结合， 而其他的杂蛋白则没有此种性质， 利用此种性质， 可以将蛋白质初步的分 离。 优选地， S2所述疏水层析的填料为苯基-葡聚糖或丁基-葡聚糖其它疏水填料。 疏水层析 时， 杂蛋白存在于穿透液中， 使用PBS溶液洗脱， 收集洗脱液， 洗脱液中主要含有血清白蛋 说明书 2/5 页 4 CN 105017412 B 4 白。 0021 本发明进行分子筛层析的目。
16、的是脱盐和去除小分子物质， 例如， 硫酸铵、 氯化钠、 氨基酸、 维生素、 小分子蛋白质等物质。 0022 优选地， S4所述阴离子交换层析的填料为DEAE-葡聚糖。 0023 优选地， S5所述非蛋白质变性类的灭活剂为 -丙内酯。 使用 -丙内酯对病原微生 物进行灭活的优选条件为37灭活24小时。 -丙内酯按照其在溶液中的终浓度为5的加 入量加入。 0024 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0025 通过本发明制备得到的牛血清白蛋白中牛血清白蛋白的纯度高于99.5%， 而且， 牛 血清白蛋白中不含有小分子物质， 例如氯化钠、 硫酸铵、 氨基酸等； 另外， 牛血清白蛋白中不 含活病。
17、毒。 附图说明 0026 图1为实施例1中牛血清苯基-葡聚糖疏水层析分离血清白蛋白的效果图； 其中， 蓝 色曲线为血清中蛋白质在疏水层析过程中的分离变化情况； 红色曲线为溶液中电导 （各种 离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰。 0027 图2为实施例1中牛血清白蛋白溶液通过G25葡聚糖分子筛除盐和小分子物质的效 果图； 其中， 蓝色曲线为牛血清白蛋白溶液中蛋白在分子筛层析过程中蛋白质变化情况； 红 色曲线为溶液中电导 （各种离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰； 红色箭头为 小分子物质蛋白峰。 0028 图3为实施例1中牛血清白蛋白通过DEAE-葡聚糖离子交换层析进一。
18、步精纯的效果 图； 其中， 蓝色曲线为牛血清白蛋白粗纯样品通过离子交换层析蛋白质分离情况； 红色曲线 为溶液中电导 （各种离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰。 0029 图4为实施例1中精纯牛血清白蛋白溶液通过G50葡聚糖分子筛层析除盐和小分子 物质的效果图； 其中， 蓝色曲线为精纯后牛血清白蛋白溶液中蛋白质分离情况； 红色曲线为 溶液中电导 （各种离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰； 红色箭头为小分子物 质蛋白峰。 0030 图5为实施例1中精纯化后的牛血清白蛋白和牛血清进行SDS-PAGE电泳效果比对 图； M： 标准蛋白质Marker； 2： 精纯后的牛血清白。
19、蛋白； 3： 箭头对应的蛋白质的分子量。 0031 图6为实施例2中牛血清丁基-葡聚糖疏水层析分离血清白蛋白的效果图； 其中， 蓝 色曲线为血清中蛋白质在疏水层析过程中的分离变化情况； 红色曲线为溶液中电导 （各种 离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰。 0032 图7为实施例2中牛血清白蛋白溶液通过G50葡聚糖分子筛除盐和小分子物质的效 果图； 其中， 蓝色曲线为牛血清白蛋白溶液中蛋白在分子筛层析过程中蛋白质变化情况； 红 色曲线为溶液中电导 （各种离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰； 红色箭头为 小分子物质蛋白峰。 0033 图8为实施例2中牛血清白蛋白通过DEA。
20、E-葡聚糖离子交换层析进一步精纯的效果 图； 其中， 蓝色曲线为牛血清白蛋白粗纯样品通过离子交换层析蛋白质分离情况； 红色曲线 为溶液中电导 （各种离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰。 说明书 3/5 页 5 CN 105017412 B 5 0034 图9为实施例2中精纯牛血清白蛋白溶液通过G25葡聚糖分子筛层析除盐和小分子 物质的效果图； 其中， 蓝色曲线为精纯后牛血清白蛋白溶液中蛋白质分离情况； 红色曲线为 溶液中电导 （各种离子浓度） 变化情况； 黑色箭头为牛血清白蛋白峰； 红色箭头为小分子物 质蛋白峰。 0035 图10为实施例2中精纯化后的牛血清白蛋白和牛血清进行SD。
21、S-PAGE电泳效果比对 图； M： 标准蛋白质Marker； 2： 精纯后的牛血清白蛋白； 3： 箭头对应的蛋白质的分子量。 具体实施方式 0036 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述， 所述实施例 只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。 下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明， 均为常规方法； 所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂 和材料。 0037 实施例1 0038 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方法， 具体步骤如下： 0039 S1. 向50mL牛血清中加入50mL生理盐水混匀， 然后加入20g硫酸铵混匀， 放。
22、入28 冰箱中静止2小时， 然后8000转/分钟， 离心30分钟， 收集上清液。 0040 S2. 向上清液中加入300 mL的PBS溶液， 混匀后， 直接上样进行疏水层析， 层析填 料为苯基-葡聚糖 （GE公司） ， 使用生理盐水溶液洗脱填料， 收集生理盐水洗脱峰。 疏水层析 分离血清白蛋白的效果图见图1。 0041 S3. 然后使用分子筛进行去除盐和小分子物质， 层析填料为G25葡聚糖 （GE公司） ， 收集不含盐和其它小分子的蛋白峰。 通过G25葡聚糖分子筛除盐和小分子物质的效果图见 图2。 0042 S4. 然后进行阴离子交换层析， 层析填料为DEAE-葡聚糖 （GE公司） ， 样品直。
23、接上样 后使用0.5M氯化钠进行梯度洗脱， 收集牛血清白蛋白峰。 DEAE-葡聚糖离子交换层析进一步 精纯的效果图见图3。 0043 S5. 加入 -丙内酯， 其在溶液中的终浓度为5， 37灭活24小时； 然后进行分子 筛层析， 使用G50葡聚糖 （GE公司） 层析填料进行脱盐和去除小分子物质， 此过程使用超纯水 洗脱， 收集牛血清白蛋白。 G50葡聚糖分子筛除盐和小分子物质的效果图见图4。 0044 S6. 然后使用孔径为30K的膜包进行超滤浓缩， 使最终牛血清白蛋白浓度达到 5mg/mL以上； 最后使用0.2微米的滤膜进行过滤除菌即得高纯度牛血清白蛋白； 牛血清白蛋 白中牛血清白蛋白的纯度。
24、为99.7%。 将精纯后的牛血清白蛋白和牛血清进行SDS-PAGE电泳 效果比对， 结果见图5。 0045 实施例2 0046 S1. 向50mL牛血清中加入100mL生理盐水混匀， 然后加入40g硫酸铵混匀， 放入28 冰箱中静止2小时， 然后8000转/分钟， 离心30分钟， 收集上清液。 0047 S2. 向上清液中加入300mL生理盐水， 混匀后， 直接上样进行疏水层析， 层析填料 为丁基-葡聚糖 （GE公司） ， 使用0.1M的PBS溶液洗脱填料， 收集0.1M的PBS洗脱峰。 疏水层析 分离血清白蛋白的效果图见图6。 0048 S3. 然后使用分子筛进行去除盐和小分子物质， 层析填。
25、料为G50葡聚糖 （GE公司） ， 说明书 4/5 页 6 CN 105017412 B 6 收集不含盐和其它小分子的蛋白峰。 G50葡聚糖分子筛除盐和小分子物质的效果图见图7。 0049 S4. 然后进行离子交换层析， 层析填料为DEAE-葡聚糖 （GE公司） ， 样品直接上样后 使用0.5M氯化钠进行梯度洗脱， 收集牛血清白蛋白峰。 DEAE-葡聚糖离子交换层析进一步精 纯的效果图见图8。 0050 S5. 加入 -丙内酯， 其在溶液中的终浓度为5， 37灭活24小时。 然后进行分子 筛层析， 使用G25葡聚糖层析填料进行脱盐和去除小分子物质， 此过程使用超纯水洗脱， 收 集牛血清白蛋白。。
26、 G25葡聚糖分子筛除盐和小分子物质的效果图见图9。 0051 S6.然后使用孔径为30K的膜包进行超滤浓缩， 使用最终牛血清白蛋白浓度达到 5mg/ml以上。 最后使用0.2微米的滤膜进行过滤除菌即得高纯度牛血清白蛋白。 牛血清白蛋 白中牛血清白蛋白的纯度为99.6%。 将精纯后的牛血清白蛋白和牛血清进行SDS-PAGE电泳 效果比对， 结果见图10。 0052 实施例3 0053 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方法， 具体步骤如下： 0054 S1. 向50mL牛血清中加入50mL生理盐水混匀， 然后加入30g硫酸铵混匀， 放入28 冰箱中静止3小时， 然后8000转/分钟， 离心。
27、60分钟， 收集上清液。 0055 S2. 向上清液中加入250 mL的PBS溶液， 混匀后， 直接上样进行疏水层析， 层析填 料为苯基-葡聚糖 （GE公司） ， 使用生理盐水溶液洗脱填料， 收集生理盐水洗脱峰。 0056 S3. 然后使用分子筛进行去除盐和小分子物质， 层析填料为G25葡聚糖 （GE公司） ， 收集不含盐和其它小分子的蛋白峰。 0057 S4. 然后进行阴离子交换层析， 层析填料为DEAE-葡聚糖 （GE公司） ， 样品直接上样 后使用0.2M氯化钠进行梯度洗脱， 收集牛血清白蛋白峰。 0058 S5. 加入 -丙内酯， 其在溶液中的终浓度为5， 37灭活24小时； 然后进行。
28、分子 筛层析， 使用G50葡聚糖 （GE公司） 层析填料进行脱盐和去除小分子物质， 此过程使用超纯水 洗脱， 收集牛血清白蛋白。 0059 S6. 然后使用孔径为30K的膜包进行超滤浓缩， 使最终牛血清白蛋白浓度达到 5mg/mL以上； 最后使用0.2微米的滤膜进行过滤除菌即得高纯度牛血清白蛋白。 0060 对比例1 0061 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方法， 基本操作同实施例1， 唯一不同 的是将S3步骤去掉， 最后得到的牛血清白蛋白中牛血清白蛋白的纯度为80%。 说明书 5/5 页 7 CN 105017412 B 7 图1 图2 说明书附图 1/6 页 8 CN 105017412 B 8 图3 图4 说明书附图 2/6 页 9 CN 105017412 B 9 图5 图6 说明书附图 3/6 页 10 CN 105017412 B 10 图7 图8 说明书附图 4/6 页 11 CN 105017412 B 11 图9 说明书附图 5/6 页 12 CN 105017412 B 12 图10 说明书附图 6/6 页 13 CN 105017412 B 13 。