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防治外寄生物的方法和组合物
    本申请是2004年7月16日提交的CN200480020528.X，题为“防治外寄生物的方法和组合物”的分案申请。

    【发明领域】

    本发明涉及用来防治外寄生物的方法和组合物。具体而言，本发明涉及抑制外寄生物卵孵化的方法和组合物。本发明还提供治疗和预防外寄生物感染的方法和组合物。本发明还涉及识别能抑制外寄生物卵孵化的化合物的方法。

    背景技术

    外寄生物，包括某些昆虫在很多种动物和植物中引起显著的害虫问题。特别是，外寄生物通常会骚扰、叮咬人和家畜并引起感染。其中特别关注的是这些寄生物的存在以及对人、家庭宠物或陪伴动物如狗和猫，以及其它驯养动物如马的影响。

    已知有各种用来防治或灭除叮咬和吸血害虫(外寄生物)，如跳蚤、壁虱、苍蝇、虱子和螨类的组合物和应用方法。在过去的数年里，已经提出许多种气雾剂和室内喷洒剂、液体、肥皂、洗发香波、可湿润的粉、颗粒、饵料和粉剂，用来防治这类外寄生物。

    对外寄生物常规的防治措施依赖于使用化学杀虫剂，例如，氯化烃类(DDT、硫丹等)以及合成除虫菊酯(氯氰菊酯、溴氰菊酯)。与使用化学杀虫剂相关的问题包括目标外寄生物形成的耐受性，化学品在环境以及植物和动物组织中的持久性以及对寄主和非目标生物体的伤害性。

    杀外寄生物剂(ecto驱虫剂)的其它类型包括杀虫剂，如昆虫生长调节剂(IGR)，已知能干扰壳多糖合成和杀虫细菌毒素(如苏金杆菌(Bt)毒素)。更有用的杀虫剂是杀虫活性高且环境持久性低的那些，如有机磷酸酯和合成的拟除虫菊酯。然而，与这些杀虫剂相关的一个突出问题是造成目标昆虫的耐受性。

    例如，在EP 0191236和美国专利5,288,483描述了用来防治虱子的杀虫剂。使用这些制剂的一个突出的缺点是虱子会产生抗性。需要进一步的防治时要将它们暴露于更强的制剂中并增加了成本。此外，临床医生和家长也要不情愿地用这些证实对人有毒性的制剂来治疗孩子。而且，这些化合物中许多都具有难闻的气味或其它不良的性能，令患者难以忍受，导致个体的再感染以及感染蔓延到其它人。此外，对这些制剂的苛刻条件，使得它们不适合用作预防剂。

    有头虱感染时，家庭治疗法如施用玉米油、橄榄油、桉树油、印度楝树油、椰子油、蛋黄酱或凡士林油足够时间(如过夜)以杀灭头虱实际上并不完全有效。这些防治头虱的方法的另一个缺点是还需要一个独立处理步骤来除去头发中的虫卵。通常用专门的细齿梳子来除去虫卵。只用梳子来处理头虱的缺点是，头虱用它们的爪子固定在头发丝上或通过爬行逃离被梳的区域。这种需要每天梳理的耗费劳力方法很痛苦，并且因为头虱是活动的、可见和爬行的而令人不快。

    全世界仍然明确需要改进的防治虱子的方法。特别是，报道了针对防治虱子的产品的缺陷。认为虱子对目前使用的许多化学品包括氯菊酯、除虫菊酯和马拉硫磷形成的耐受性是防治失败的一个主要因素。此外，还认为，含不最适宜活性剂的不适当配剂要对耐受性形成负一定责任。最近，对防治头虱的草药产品市场明显增长，但是，对所进行的试验几乎没有公开的证据，来有效评价这些产品。

    而且，虽然有许多产品声称拥有杀卵活性，但是本领域对此的证据远不能令人信服，推荐的普通产品是，在最初防治后的二次防治应在7-14天之间进行，以杀灭新出现的卵。

    最近人们的注意力集中在昆虫蛋白酶上，蛋白酶能提供防治外寄生物的可能的方法。蛋白酶在生物体中发挥各种功能，包括调节和破坏蛋白质和肽类，因此有助于消化。

    它们还涉及胚胎形成期间的组织重整，蜕皮和蛹化。蛋白酶是各种可变的酶，包括有助消化的蛋白酶，它们在数量已经种类之间的催化性能明显不同。例如，一直认为丝氨酸蛋白酶涉及蜕皮的关键生长调节剂领域(Samuels R.I.和Paterson C.J.，Comparative Biochemistry and Physiology，1995，110B：661-669)。

    已经提出蛋白酶抑制剂是另一种有用的化学防治方法，特别是外寄生物已对这些化学杀虫剂具有耐受性时。特别是，丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂已显示能减少幼虫生长和/或各种昆虫存活(Dymock等人，New Zealand Journal of Zoology，1992，19：123-131)。用肠线的主要消化酶的抑制剂已达到抑制生长，并且一直以外寄生物幼虫或成熟的寄生生物为目标。然而，对各种类型蛋白酶抑制剂的活性和功能的了解很少。杀外寄生物剂的存在的共同问题是它们对外寄生物卵不起作用，因此施用驱虫剂给寄主时，为达到效果，经常需要重复防治或延长暴露于驱虫剂时间。这不仅不方便，而且会增加对环境以及寄主的危险。

    因此，仍然需要提供能有效抑制外寄生物卵孵化，来达到有效防治外寄生物的方法和组合物。

    发明概述

    本发明一个方面，提供一种抑制外寄生物卵孵化的方法，该方法包括将外寄生物卵暴露于至少一种金属螯合剂中，所述金属螯合剂是一种包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧和磷，所述化合物包含至少一个被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，所述金属螯合剂或者是包含至少一个含至少一个杂原子的杂环的化合物，所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代。

    本发明另一方面，提供一种抑制外寄生物卵孵化的方法，该方法包括将外寄生物卵暴露于有效量的金属蛋白酶抑制剂。

    本申请人已识别出作为抑制外寄生物卵孵化的有效制剂的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂。金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂用来抑制外寄生物卵孵化具有防止外寄生物的繁殖周期，从而防治外寄生物感染是优点。

    另一方面，提供一种治疗或预防在寄主的外寄生物感染的方法，该方法包括施用有效量的至少一种螯合剂，所述金属螯合剂是一种包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧和磷，所述化合物包含至少一个被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或者是包含至少一个含至少一个杂原子的杂环的化合物，所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代。

    本发明另一方面，提供治疗或预防寄主的外寄生物感染的方法，该方法包括给予对象有效量的至少一种金属蛋白酶抑制剂。

    本发明又一方面，提供一种抑制虱卵孵化的方法，该方法包括将虱卵暴露于有效量的至少一种化学式(Ia)的化合物，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐中：

    

    式中，X选自：共价键、-C(R⁵)₂-、-Z-或-C(R⁵)₂-Z-C(R⁵)₂-；R¹和R¹’独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C₁-C₆烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂；

    R²、R²’、R³、R³’、R⁴和R⁴’独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基(alkylthiol)、CO₂H，CO₂C_1-6烷基、SO₃H，SO₃C_1-6烷基、NH₂，NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂，或-CH₂CHNH(CO₂H)；或

    R²和R³或R³和R⁴和/或R²’和R³’或R³’和R⁴’与它们连接的碳原子一起形成五或六元碳环或杂环；

    各R⁵独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂；和

    Z选自：共价键、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-和-C(S)-。

    本发明又一方面，提供一种抑制外寄生物卵孵化的组合物，该组合物包含有效量的至少一种金属螯合剂以及合适的稀释剂、赋形剂或载体，所述金属螯合剂是一种包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧和磷，所述化合物包含至少一个被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或者是包含至少一个含至少一个杂原子的杂环的化合物，所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代。

    本发明的另一方面，提供一种抑制外寄生物卵孵化的组合物，该组合物包含有效量的至少一种金属蛋白酶抑制剂以及合适的稀释剂、赋形剂或载体。

    本发明另一方面，提供一种识别抑制外寄生物卵孵化的化合物的方法，该方法包括评价化合物对外寄生物卵中存在的金属蛋白酶的抑制能力。

    本发明又一方面，提供采用上述方法识别的金属螯合剂和/或金属蛋白酶抑制剂。

    附图简要说明

    图1：所示为用考马斯蓝染色凝胶和脱色后，由头发和头虱卵各样品获得的洗涤物的蛋白酶活性的明胶底物SDS-PAGE分析。通道1显示由孵化12小时内未孵化的头虱卵获得的洗涤物中检测到的蛋白酶活性。蛋白酶活性在SDS凝胶的高分子量区。通道2显示从头发的洗涤物中检测到的蛋白酶活性，表明存在许多高活性和稳定的很可能是母系起源的蛋白酶。通道3显示头发样品，该样品用1％次氯酸钠溶液洗涤1分钟，随后用水洗涤多次，试图除去这些污染蛋白酶。这种处理能除去母系蛋白酶，导致只在头发样品中没有检测到蛋白酶种类。通道4显示孵化12小时的卵用次氯酸钠(如上所述)处理，在这种卵的洗涤物中检测到的蛋白酶活性。这种处理除去了在未洗涤样品(与通道1相比)中观察到的蛋白酶活性。通道5显示来自用次氯酸钠预处理后孵化的头虱卵的卵洗涤物中存在一种或两种高分子量蛋白酶。这些蛋白酶特别预卵孵化时的头虱卵相关。

    图2：所示为用次氯酸盐处理后，由头虱卵获得的卵壳洗涤物的抑制剂考马斯蓝染色处理后的明胶SDS-PAGE凝胶。很明显有三个带在约25-30kDa(相等的)。通道1，ESW正对照，没有抑制剂处理，通道2，用10mM 1，0-菲咯啉处理后的ESW，通道3，用5mM PMSF处理后的ESW，以及通道4，用10μM E-64处理后的ESW。在37℃孵化3小时。注意到用用1，10-菲咯啉(通道2相等区)处理后蛋白酶活性明显降低。使用天冬氨酸抑制剂胃酶抑素(数据未示出)时，未观察到ESW的蛋白酶活性下降。

    图3：显示1，10-菲咯啉对头虱卵孵化的作用。头虱卵处理5天后，随时间观察到的孵化。

    图4：显示苯丁亮氨酸(Bestatin)对头虱卵孵化的作用。头虱卵处理5天后，随时间观察到的孵化。

    优选实施方式的详细描述

    本文中，术语“金属螯合剂”指包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧或磷，所述化合物包含至少一个被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或者包含至少一个含至少一个杂原子的杂环的化合物，所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代。较好地，金属螯合剂包含一个芳环或杂芳环。更好地，金属螯合剂包含至少一个氮杂原子。较好地，金属螯合剂是非嵌入的

    本文中，术语“金属蛋白酶抑制剂”指能抑制与外寄生物卵孵化相关的金属蛋白酶活性的分子、化合物、蛋白质或制剂。所述抑制可以是对金属蛋白酶表示抑制或对金属蛋白酶酶活性的抑制。优选的金属蛋白酶抑制剂是金属螯合剂。

    优选的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂选自：联芳基化合物、肽和氨基酸衍生物、四环抗菌素和硫脲类化合物。

    优选的联芳基化合物包括联吡啶基化合物和1，10-菲咯啉化合物。

    一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是化学式(I)的化合物，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐：

    

    式中：X选自共价键、-C(R⁵)₂-、-Z-或-C(R⁵)₂-Z-C(R⁵)₂-；

    R¹和R¹’独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C₁-C₆烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂，NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂，或R¹和R¹’-起是-C(R⁵)₂-、-C(R⁵)₂-C(R⁵)₂-、-CR⁵＝CR⁵-、C(O)、C(S)或NH；

    R²、R²’、R³、R³’、R⁴和R⁴’独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂，NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂，或-CH₂CHNH(CO₂H)；或

    R²和R³或R³和R⁴和/或R²’和R³’或R³’和R⁴’与它们连接的碳原子一起形成五或六元碳环或杂环；各R⁵独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂，NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂；和

    Z选自：共价键、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-和-C(S)-。

    优选的化学式(I)的化合物具有至少一个下面的特征：

    R¹和R¹’独立地选自：C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C₁-C₆烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂，更优选是氢或C₁-C₃烷基，最优选氢或甲基；

    R²和R²’独立地是氢或C_1-3烷基，更优选氢；

    R³、R³’、R⁴和R⁴’独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基或CO₂C_1-6烷基，优选氢或C_1-3烷基，更优选氢或甲基；

    各R⁵独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基或CO₂C_1-6烷基，优选氢或C_1-3烷基，更优选氢或甲基；

    X是共价键、-CH₂-Z-CH₂-或Z，优选共价键；

    Z是-NH-、-O-或-S-，优选-NH-。

    化学式(I)的优选化合物包括：

    2，2’-联吡啶、6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶和5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐。

    另一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是化学式(II)的化合物，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐：

    

    式中：X’选自：共价键、-C(R¹³)₂-、Z’或C(R¹³)₂-Z’-C(R¹³)₂-；

    U选自N或C(R¹³)；

    W选自：-NH-、-S-或-O-；

    Z’选自：共价键、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-或-C(S)-；

    R¹⁰选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂或-(CH₂)_nR¹⁴；

    R¹¹选自(CH₂)_m芳基或(CH₂)_m杂芳基，其中芳基或杂芳基各自任选被C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂或卤素中的一个或多个基团取代；

    各R¹²独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂，NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂或-(CH₂)_nR¹⁴；或

    R¹⁰和R¹²与它们连接的碳原子一起形成五或六元碳环或杂环；

    各R¹³独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂，NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂或-(CH₂)_nR¹⁴；

    R¹⁴选自NH₂、OH、SH或CO₂H；

    M是0或1-4的整数；

    n是1-4的整数。

    优选的化学式(II)的化合物具有至少一个下面的特征：

    X是共价键或-CH₂-Z-CH₂-，

    U是N；

    W是NH或S；

    Z’是NH；

    R¹⁰是氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基或(CH₂)_nR¹⁴，优选氢、C_1-3烷基或(CH₂)_nR¹⁴；

    R¹¹是苯基、被C_1-3烷基或卤素取代的苯基、噻吩、吡啶、吡啶基甲基、咪唑或被一个或两个C_1-3烷基取代的咪唑；

    R¹²是氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基或(CH₂)_nR¹⁴，优选氢、C_1-3烷基或(CH₂)_nR¹⁴；或

    R¹⁰和R¹²与它们连接的碳原子一起形成稠合苯环；

    R¹³是氢或C_1-3烷基，优选氢或甲基；

    R¹⁴是NH₂或CO₂H；

    m是0或1；

    n是1或2。

    在另一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂选自化学式(III)的化合物，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐：

    

    式中Ar是苯基、萘基或吲哚基，它们任选被C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂中的一个或多个取代；

    R²¹选自：NH₂、NHR²⁵或-CH₂SR²⁵；

    R²²选自氢、羟基或C_1-6烷氧基；

    R²³选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基；

    R²⁴选自OH、OR²⁶、NH₂、NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂；

    R²⁵选自氢、C(O)C_1-6烷基，其中的烷基任选被-SH或-OH取代；

    R²⁶选自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基或苄基；

    P是0或1。

    优选的化学式(III)化合物具有至少一个下面的特征：

    Ar是苯基或萘基；

    R²¹是NH₂、任选被SH取代的-NHC(O)C_1-6烷基、-CH₂SC(O)C_1-6烷基或CH₂SH；

    R²²是氢或羟基；

    R²³是氢或C_1-3烷基，优选氢或甲基；

    R²⁴是OH、NH₂或O苄基；

    P是0或1。

    化学式(III)的优选化合物包括苯丁亮氨酸和Thiorophan，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐。

    又一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是化学式(IV)的化合物，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐：

    

    式中，Ar是苯基、萘基或吲哚基，它们任选被C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂，NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂中一个或多个取代；

    R³¹选自：CO₂H、CO₂C_1-6烷基、CO₂C_2-6烯基、CO₂C_2-6炔基、CONH₂，CONH(C_1-6烷基)或CON(C_1-6烷基)₂；

    R³²选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂、CH₂CH₂CO₂H、CH₂CH₂CONH₂、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂SH；

    R³³选自：C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂、NH(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)₂、CH₂CO₂H、CH₂CO₂C_1-6烷基、CH₂CONH₂、CH₂OH或CH₂SH。

    优选的化学式(IV)的化合物具有至少一个下面的特征：

    Ar是苯基或吲哚基，

    R³¹是CO₂H或CONH₂，

    R³²是C_1-6烷基、CH₂CH₂CO₂H、CH₂CH₂CONH₂、CH₂CH₂OH或CH₂CH₂SH，

    R³³是CH₂CO₂H、CH₂CONH₂、CH₂OH或CH₂SH。

    在另一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是化学式(V)的化合物，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐：

    

    式中，R⁴¹和R⁴²独立地选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基或R⁴¹和R⁴²与它们连接的氮一起形成五或六元杂环，该环任选被C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基中一个或多个取代；

    R⁴³选自：氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、羟基、C_1-6烷氧基、硫羟基、C_1-6烷硫基、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、SO₃H、SO₃C_1-6烷基、NH₂，NHC_1-6烷基或N(C_1-6烷基)₂。

    优选的化学式(V)的化合物具有至少一个下面的特征：

    R⁴¹和R⁴²独立地选自：C_1-6烷基或与它们连接的氮一起形成哌啶、哌嗪、N-甲基哌嗪或吗啉基；

    R⁴³是氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基。

    在又一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是选自四环素、强力霉素或二甲胺四环素，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐的四环抗生素。

    在又一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂选自：1-[(2S)-3-巯基-2-甲基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(Captopril)或N-(α-吡喃鼠李糖氧基(rhamnopyranosyloxy)-羟基氧膦基)-L-亮氨酰-L-色氨酸(磷阿米酮(phosphoramidon))，或其药学上、兽医或农业上可接受的盐。

    本文中，术语“烷基”指直链或支链饱和烃基，具有特定数量的碳原子。例如，在“C₁-C₆烷基”中C₁-C₆包括具有以直链或支链排列的1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。合适烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、4-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、5-甲基戊基、2-乙基丁基和3-乙基丁基。

    本文中，术语“烯基”指碳原子间有一个或多个双键的链或支链烃基，具有特定数量的碳原子。例如，在“C₂-C₆烯基”中C₂-C₆包括具有以直链或支链排列的2、3、4、5或6个碳原子的基团。合适烯基的例子包括但不限于：乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基。

    本文中，术语“炔基”指碳原子间有一个或多个三键的链或支链烃基，具有特定数量的碳原子。例如，“C₂-C₆炔基”中C₂-C₆包括具有以直链或支链排列的2、3、4、5或6个碳原子的基团。合适烯基的例子包括但不限于：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基。

    本文中，术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。

    本文中术语“烷氧基”表示通过氧桥连接的如上所述的烷基。合适烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基和正己氧基。

    本文中术语“烷硫基”表示通过硫桥连接的如上所述的烷基。合适烷硫基的例子包括但不限于：甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、异丁硫基、叔丁硫基、戊硫基和己硫基。

    本文中术语“碳环”指3-10元环或稠环体系，其中形成环的所有原子是碳原子。C_3-10碳环可以是饱和、不饱和或芳族的。合适碳环的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、苯基、萘基和四氢萘基。

    本文中所有“杂环”指3-10元环或稠环体系，其中至少一个成环的原子是杂原子。较好地，杂原子选自氮、氧、硫和磷。C_3-10杂环可以是饱和、不饱和或芳族的。合适杂环的例子包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基(benzofurazanyl)、苯并吡唑基、苯并三唑基，苯并苯硫基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、曾啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、中氮茚基(indolazinyl)，吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘并吡啶基(naphthpyridinyl)、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁基(oxetanyl)、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡二唑基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、吡二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四氢吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、氮杂环丙烷基、1，4-二噁烷基、六氢吖庚因基(hexahydroazepinyl)、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并苯硫基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基，二氢噁唑基，二氢吡嗪基、二氢吡唑基，二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧代苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基，及其N-氧化物。通过碳原子或杂原子连接杂环取代基。

    本文中，术语“芳基”意指任何稳定的单环或双环碳环，每个环上至多有6个原子，其中至少一个环是芳族的。这样的芳基的例子包括但不限于：苯基、萘基和四氢萘基。

    本文中术语“杂芳基”表示稳定的单环或双环碳环，每个环上至多有6个原子，其中至少一个环是芳族，并且至少一个环含有1-4个选自O、N和S的杂原子。在此定义范围之内的杂芳基包括但不限于：吖啶基、咔唑基、曾啉基、喹喔啉基、吡唑基(pyrrazolyl)、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吲哚基、吡嗪基、吡二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。

    本发明化合物可以药学上、兽医的或农业上可接受的盐形式。合适的药学上可接受的盐包括但不限于：药学上可接受的无机酸，如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、硼酸、磺酸、和氢溴酸的盐，或药学上可接受的有机酸，如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯基乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹宁酸、抗坏血酸和戊酸的盐。

    碱盐包括但不限于：与药学上可接受的阳离子，如钠、钾、锂、钙、，镁、铵和烷基铵形成的那些。

    碱性含氮基团可以用如下试剂季铵化，例如低级卤代烷基，如氯代、溴代和碘代甲烷、乙烷、丙烷和丁烷；硫酸二烷基酯，如硫酸二甲酯和硫酸二乙酯等。

    还应认可本发明的许多化合物具有不对称中心，因此存在一种以上的立体异构体形式。本发明还涉及基本上纯的一个或多个不对称中心的异构体形式，如约大于90％，如约95％含97％，含大于99％，以及包含其外消旋混合物的化合物。这些异构体可以采用不对称合成例如用手性中间体，或通过手性拆分来制备。

    对本发明有用的许多金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂可以从专业化学公司购得。不能购得那些化合物可以用本领域普通技术人员已知的反应，由可商购的原料来合成。

    例如，取代的2，2-联吡啶和1，10-菲咯啉可以由适当卤代的2，2-联吡啶或1，10-菲咯啉获得。例如，2，2’-联吡啶-6，6’-二羧酸可以由6，6’-二溴-2，2’-联吡啶，通过用丁基锂的卤素-金属交换，用干冰处理并酸化获得[Buhleier等人，Chem.Ber.，1978，111：200-204]。联吡啶的单取代，例如在6位用CH₂CHNH₂(CO₂H)取代可通过用N-溴琥珀酰亚胺处理6-甲基-2，2’-联吡啶，随后用N-保护的-氨基乙酸酯进行烷基化来达到。然后，通过酸水解除去保护基团(Imperiali B.和Fisher S.L.，J.Org.Chem，1992，57：757-759)。

    2，2’-联吡啶可以在C6和C4位进行亲核取代反应，引入取代基。当用卤代联吡啶作为原料时对该反应更有利。例如用6-单或二卤代的2，2’-联吡啶作为原料与氨反应，能在C6和/或C6’引入胺。

    联吡啶-磺酸可以由2，2’-联吡啶，与发烟硫酸(三氧化硫在浓硫酸的溶液)或硫酸汞(II)/浓硫酸在300℃加热制备。

    不对称取代的联吡啶可以由对称的联吡啶获得，例如，6’-甲基-2，2’-联吡啶-6-羧酸可由6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶用二氧化硒氧化，随后用硝酸银处理获得(Al-Saya等人，European J：Org.Clzenz.，2004，173-182)。

    通式(III)和(IV)的化合物可以由可商购的氨基酸，例如苯基丙氨酸和色氨酸，采用已知的与氨基酸羧酸或胺基的偶合反应制备(Jones J.，Amino Acid and PeptideSynthesis，Oxford Chemistry Press，1992)。如本领域已知以及Jones，1992，Supra或Green T.W.和Wutz P.，Protecting Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Son，3rd Ed.，1999中所示，需要合适的保护和脱保护步骤。

    通式(V)的硫脲类可以通过合适苯甲酰胺与丁基锂，随后与硫光气反应制备。得到的产物然后可以与合适的胺或氨基酸反应，如过程1所示。

    

    本说明书中，术语“外寄生物”用来包括外部感染寄主并通过产卵繁殖的任何寄生动物种类。本发明优选的外寄生物包括选自鳞翅目、半翅目、直翅目、啮虫目、膜翅目、等翅目、鞘翅目、网翅目、缨尾目、同翅目、双翅目、虱目、食毛目、蚤目和蛛形目的一个目的物种。

    适合采用本发明方法进行防治的外寄生物包括：

    (a)鳞翅目(lepidopterans)，例如，棉褐带卷蛾(Adoxophyes organa)，小地老虎(Agrotis ypsilon)、黄地老虎(Agrotis segetum)、木棉虫(Alabama argillacea)，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、苹果巢蛾(Argyresthia conjugella)，汉马夜蛾(Autographa gamma)，Cacoecia murinana，Capua reticulana，云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)，玉米禾螟(Chilo partellus)，西方云杉卷叶蛾(Choristoneura occidentalis)，二化螟(Cirphis unipuncta)，稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大菜螟(Crocidolomia binotalis)、苹果小卷蛾、松毛虫(Dendrolimus pini)，瓜野螟(Diaphania nitidalis)，西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)，埃及钻夜蛾(Earias insulana)、小玉米螟(Elasmopalpuslignosellus)、Eupoecilia ambiguella，粒肤地虎(Feltia subterrallea)，李小食心虫(Grapholitha funebrana、梨小食心虫(Grapholitha molesta)、棉铃实夜蛾(Heliothis armigera)、绿棉铃虫(Heliothis virescens)，谷实夜蛾(Heliothiszea)，菜心野螟(Hellula undalis)、Hibernia defoliaria，美国白蛾(Hyphantriacunea)、卫茅巢蛾(Hyponomeuta malinellus)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)，铁杉尺蛾(Lambdina fiscellaria)，贪夜蛾(Laphygma exigua)、旋纹潜蛾(Leucopterascitella)、Lithocolletis blancardella，鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana)，网锥额野螟(Loxostege sticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、模毒蛾(Lymantria monacha)、桃潜蛾(Lyonetia clerkella)、烟草天蛾(Manduca Sexta)，黄褐天幕毛虫(Malacosoma neustria)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、稻毛胫夜蛾(Mocis repanda)，Operophthera brumata，黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)，苹褐卷蛾(Pandemis heparana)，冬夜蛾(Panolisflammea)，棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)，马铃薯蠹蛾(Phthorimaeaoperculella)，柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella)，大菜粉蝶(Pierisbrassicae)，苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)，荷兰石竹小卷蛾(Platynotastultana)，抗溴氰菊酯小菜蛾(Plutella xylostella)，桔花巢蛾(Prays citri)，油橄榄巢蛾(Prays oleae)，Prodenia sunia，黄条粘虫(Prodenia ornithogalli)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，美松梢小卷蛾(Rhyacionia frustrana)，Scrobipalpula absoluta，大螟(Sesamia inferens)，葡萄卷叶蛾(Sparganothispilleriana)，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，棉贪夜蛾(Spodopteralittoralis)，斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，棉大卷叶螟(Syllepta derogate)，苹透翅蛾(Synanthedon myopaeformis)，松带蛾(Thaumatopoea pityocampa)，绿色橡木飞蛾(Tortrix viridana)，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)，象三化螟(Tryporyzaincertulas)，云杉小卷叶蛾(Zeiraphera Canadensis)；

    (b)半翅目，例如，蚜属(Aphis)，小粉虱属(Bemisia)，疣芽属(Phorodon)，Aeneolanzia，Enapoasca，Parkinsiella，Pyrilla，肾圆盾疥属(Aonidiella)，球菌(Coccus)，粉蚧属(Pseudococcus)，角盲椿属(Helopeltis)，绿盲蝽(Lygus)，姬赤星椿象(Dysdercus)，尖长春属(xycarenus)，绿椿属(Nezara)，粉虱属(Aleyrodes)，传播媒介锥蝽(Triatoma)，木虱(Psylla)，瘤蚜属(Myzus)，修尾蚜属(Megoura)，根瘤蚜属(Phylloxera)蝼蛄(Gryllotalpa gryllotalpa)，飞蝗(Locusta migratoria)，羽扇豆碱对双带蚱蜢(Melanoplus bivittatus)，红足黑蝗(Melanoplus femur-rubrum)，墨西哥黑蝗(Melanoplus mexicanus)，血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，石栖黑蝗(Melanoplus spretus)，土蝗(Nomadacris septemfasciata)，美洲沙漠蝗(Schistocerca americana)，Schistocerca peregrina，Stauronotus maroccanus，沙漠蝗虫(Schistocercagregaria)，钮灰蝶属(Adelges)，褐飞虱属(Nilaparvata)，黑尾叶蝉(Nephotettix)或Cimwx spp.

    (c)直翅目，例如，欧洲蝼蛄(Gryllotalpa gryllotalpa)，飞蝗(Locustamigratoria)，双带蚱蜢(Melanoplus bivittatus)，赤腿蚱蜢(Melanoplusfemur-rubrum)，墨西哥蚱蜢(Melanoplus mexicanus)，迁徒蚱蜢(Melanoplussanguinipes)，落矶山蚱蜢(Melanoplus spretus)，红翅蝗(Nomadacrisseptemfasciata)，美洲蚱蜢(Schistocerca Americana)，荒地蚱蜢(Schistocercaperegrine)，Stauronotus maroccanus，荒地蚱蜢(Schistocerca gregaria)；

    (d)啮虫目，例如，Peripsocus spp.；

    (e)膜翅目，例如，芜菁叶蜂(Athalia rosae)，南非人用切叶蚁(Atta cephalotes)，切叶蚁(Atta sexdens)，得州切叶蚁(Atta texana)，李实叶蜂(Hoplocamapa minuta)，苹实叶蜂(Hoplocampa testudinea)，阿根庭蚁(Iridomyrmes humilis)，多霜虹臭蚁(Iridomyrmex purpureus)，小黄家蚁(Monomorium pharaonis)，热带火蚁(Solenopsisgeminate)，红入侵火蚁(Solenopsis invicta)，黑火蚁(Solenopsis richteri)，白足狡臭蚁(Technomyrmex albipes)；

    (f)白蚁科(等翅目)，例如，Calotermes flavicollis，乳白蚁属(Coptotermesspp)，Leucotermes flavipes，Macrotermes subhyalinus，象白蚁(Nasutitermesspp)如Nasutitermes walkeri，黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)，南欧网纹白蚁(Reticulitermes lucifugus)，Termes natalensis；

    (g)鞘翅目，例如，墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)，苹果象甲(Anthonomuspomorum)，豆长吻象甲(Apion vorax)，甜菜隐食甲(Atomaria linearis)，松纵坑切梢小蠹(Blastophagus piniperda)，甜菜大龟甲(Cassida nebulosa)，豆叶甲(Cerotoma trifurcate)，甘兰荚象甲(Ceuthorhynchus assimilis)，Ceuthorhynchusnapi，甜菜跳甲(Chaetocnema tibialis)，烟草金针虫(Conoderus vespertinus)，天门冬叶甲(Crioceris asparagi)，云杉红翅小蠹(Dendroctonus refipennis)，长角叶甲(Diabrotica longicornis)，Diabrotica 12-punctata，玉米幼芽根叶甲(Diabrotica virgifera)，墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)，烟草跳甲(Epitrixhirtipennis)，棉籽灰象甲(Eutinobothrus brasiliensis)，松树皮象(Hylobiusabietis)，埃及苜蓿象甲(Hypera brunnipennis)，苜蓿叶象甲(Hypera postica)，欧洲种松小蠹(Ips typographus)，烟草负泥虫(Lema bilineata)，稻负泥虫(Lemamelanopus)，马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)，甜菜金针虫(Limoniuscalifornicus)，稻象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)，Melanotus communis，花粉甲虫(Meligethes aeneus)，东方五月鳃金龟(Melolontha hippocastani)，西方五月鳃金龟(Melolontha melolontha)，稻负泥虫(ulema oryzae)，葡萄黑象甲(Ortiorrhynchus sulcatus)，草莓根象甲(Otiorrhynchus ovatus)，辣根猿叶虫(Phaedon cochlearae)，庭院丽金龟(Phyllopertha horticola)，六月鳃角金龟属(Phyllophaga sp.)，Phyllotreta chrysocephala，芜菁淡足跳甲(Phyllotretanemorum)，曲条跳甲(Phyllotreta striolata)，日本丽金龟(Popillia japonica，Psylliodes napi)，Scolytus intricatus，豆根直条象甲(Sitona lineatus)；

    (h)网翅目，例如，来自地鳖科(Polyphagidae)，折翅蠊科(Bladberidae)，蜚蠊科(Blattidae)，Epilampridae，Chaetecsidae，Metallycidae，Mantoididae，Amorphoscelidae，Eremiaphilidae，Hymenopodidae，螳螂科(Mantidae)和Empusidae；

    (i)缨翅目，例如，烟草褐蓟马(Frankliniella fusca)，苜蓿蓟马(Frankliniellaoccidentalis)，东方花蓟马(Frankliniella tritici)，小麦皮蓟马(Haplothripstritici)，温室蓟马(Heliothrips haemorrhoidalis)，桔实蓟马(Scirtothripscitri)，稻蓟马(Thrips oryzae)，棕榈蓟马(Thrips palmi)，烟蓟马(Thrips tabaci)；

    (j)同翅目，例如，Acyrthosiphon onobrychis，豆无网长管蚜(Acyrthosiphonpisum)，落叶松球蚜(Adelges laricis)，安氏红圆蚧(Aonidiella aurantii)，Aphidulanasturtii，甜菜蚜(Aphis fabae)，棉蚜(Aphis gossypii)，苹果蚜(Aphis pomi)，茄无网蚜(Aulacorthum solani)，甘薯粉蚜(Bemisia tabaci)，飞廉短尾蚜(Brachycauduscardui)，甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，玉米叶蝉(Dalbulus maidis)，高加索漏杉椎球蚜(Dreyfusia nordmannianae)，云杉椎球蚜(Dreyfusia piceae)，南西圆尾蚜(Dysaphis radicola)，蚕豆小绿叶蝉(Empoasca fabae)，苹果绵蚜(Eriosomalanigerum)，灰飞虱(Laodelphax striatella)，麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)，蔷薇长管蚜(Macrosiphon rosae)，巢菜修尾蚜(Megoura viciae)，麦无网蚜(Metopolophium dirhodum)，紫堇瘤蚜(Myzuspersicae)，李瘤蚜(Myzus cerasi)，黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)，褐飞虱(Nilaparvata lugens)，甘飞虱(Perkinsiella saccharicida)，忽布疣蚜(Phorodonhumuli)，苹木虱(Psylla mali)，梨木虱(Psylla piri)，梨黄木虱(Psylla pyricola)，玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)，麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，禾谷网蚜(Sitobion avenae)，白背飞虱(Sogatella furcifera)，桔蚜(Toxoptera citricida)，结翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)，温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)，葡萄根瘤蚜(Viteus vitifolii)；

    (k)双翅目，例如，墨西哥实蝇(Anastrepha ludens)，地中海实蝇(Ceratitiscapitata)，高梁瘿蚊(Contarinia sorghicola)，托莫洪连纹果实蝇(Dacus cucurbitae)，油榄实蝇(Dacus oleae)，油菜叶瘿蚊(Dasineura brassicae)，麦地种蝇(Deliacoarctata)，甘蓝地种蝇(Delia radicum)，麦叶毛眼水蝇(Hydrellia griseola)，种蝇(myia platura)，蔬菜斑潜蚊(Liriomyza sativae)，三叶草斑潜蚊(Liriomyzatrifolii)，Lucilia Sp.，麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，蝇属(Musca sp.)，亚洲稻瘿蚊(Orseolia oryzae)，瑞典麦杆蝇(Oscinella frit)，天仙子泉蝇(Pegomyahyoscyami)，Phorbia antiqua，萝卜地种蝇(Phorbia brassicae)，Phorbia coarctata，樱桃实蝇(Rhagoletis cerasi)，苹果实蝇(Rhagoletis pomonella)；

    (l)from the order虱目，例如，Pthirus pubis，头虱(Pediculus humanuscapitus)，体虱(Pediculus humanus humanus)；

    (m)食毛目，例如，来自genera羽虱(Bovicola)，畜虱(Damalania)，嚼虱(Trichodectus)和短角习虱(Menopon)；

    (n)蚤目，例如，头蚤(Ctenocephalides)或人蚤属(Pulex spp.)。

    (o)蛛形目，例如，硬蜱属(Ixodes holocyclus)，牛蜱属(Boophilus rnicroplus)，血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)，人疥螨(Sarcoptes scabiei)和尘螨属(Dermatophagoides spp)。

    能较好通过本发明防止孵化的外寄生物卵包括：选自虱子、跳蚤、壁虱、苍蝇和其它刺入或吸血外寄生物的卵。在优选的实施方式中，外寄生物卵是虱卵，更优选是头虱卵。虱(Lice)是以动物皮肤和血液为食的寄生物，它们将其消化液和排泄物沉积到皮肤。这些物质以及在皮肤本身上的穿刺伤口引起皮肤刺激，并由于产生的擦伤而病变，并可能由神经节炎症引起一系列感染。虱子也是某些疾病的病媒，如疹病或流行性斑疹伤寒和回归热。成年雌性虱子的寿命约为1个月，并能每天产10个卵。传染人的虱子包括阴虱(Pthirus pubis)物种和由两种次物种(subspecies)头虱和衣虱组成的人虱(Busvine，Antenna，1993，17：196-201)。上述虱的次物种密切相关，已知已成功杂种繁殖(Busvine，Cutaneous Infestations and Insect Bites，1985，163-174)。

    头虱(Pediculus hzrnanzcs var.capitis)是一种特定的寄主-外寄生物，它们专门在人的头上生存，并通过从头皮吸取血液为食。在进食血液后，成熟的成年雌性虱子会在24小时内在靠近头皮处最多产10个卵。这些卵通过胶体牢固地固定在发干上。根据卵所处的温度和湿度，7-10天后，卵孵化，新产的稚虫开始进食。稚虫通过三次蜕皮(第一龄期，第二龄期，第三龄期)生长，每一次蜕皮需要3-5天完成。最好一次蜕皮后，成年雄性或雌性在以后的2天内尽快交配。在进食期间，会产卵并持续这一周期。从卵到卵的整个生命周期约需20-30天完成，取决于温度和湿度条件。卵孵化后，卵壳仍固定在发干上，并随头发长长而逐渐从发干上脱落。孵化后的卵(幼虫)由于其折射特性在人造光下呈白色而相当容易发现，与之相反，未孵化的卵为淡棕色，而混入大多数头发颜色中，因而难以发觉。

    本发明的一个实施方式中，本发明的方法和组合物通过抑制虱卵孵化来治愈虱子的目标。本申请人已识别出能作为抑制外寄生物虱卵孵化的有效制剂的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂。用金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂来抑制外寄生物虱卵孵化的优点是能防止外寄生物的繁殖周期，从而防治外寄生物感染。

    本文中术语“金属蛋白酶”指涉及外寄生物卵孵化的蛋白酶，所述蛋白酶具有能用作催化剂的活性金属离子。较好地，金属蛋白酶含有能参与催化反应，通过极化水分子来攻击底物-肽连接的锌离子。更好地，金属蛋白酶对能阻断其活性的金属螯合剂敏感。金属蛋白酶较好的涉及通过作用于卵的盖(operculum)诱发卵孵化，来实施卵孵化。涉及外寄生物卵孵化的合适金属蛋白酶包括内蛋白酶(在肽链内分裂的酶)和外蛋白酶(从肽末端分裂氨基酸的酶)。外蛋白酶也可以分类为羧基蛋白酶(从C末端分类氨基酸)或氨基肽酶(N末端分类氨基酸)。为具备活性，金属-羧基蛋白酶需要二价阳离子(通常Zn²⁺)，而氨基肽酶一般依据金属离子(Zn²⁺或Mg²⁺)来分类。它们以游离形式和膜束缚形式存在，并且在高(8-10)pH下具有活性。检测愈卵孵化相关的金属蛋白酶的方法涉及收集孵化卵时在形成胚胎周围的流体或在卵孵化后快速冲洗空卵壳，并采用明胶底物SDS-PAGE分析来分析样品存在的蛋白酶。显示样品存在溶解蛋白活性时，则可以在金属蛋白酶抑制剂，例如1，10-菲咯啉存在下孵化，然后再分析处理过的样品，以确定从已经孵化的卵提取的蛋白酶是否有活性。从孵化后卵获得的金属蛋白酶显示具有抑制活性时，则可以将未孵化的卵暴露于同样的抑制剂中，评价能否抑制卵发生孵化。涉及卵孵化的金属蛋白酶的鉴别还可以通过鉴定金属蛋白酶的基因编码，沉默该基因并显示该卵不能通过本领域技术人员已知的方法孵化来鉴别。

    本文中词语“抑制外寄生物卵孵化”指防止外寄生物卵孵化。本发明中，与未处理的外寄生物卵相比，将外寄生物卵暴露于能防止卵孵化的金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂中。卵孵化的特征是卵的孵育襟翼(hatchflap)或盖打开，之后稚虫很快突露。在虱子情况，首先露出头，随后连接腿的胸部。最后，腹部突露，稚虫从卵中爬出。卵孵化排除了卵壳损坏或意外破碎。

    较好地，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是在产卵和孵化之间任何时间施用于卵时能抑制卵孵化的化合物。

    外寄生物卵较好地，但不限于存在于寄主生物体，如动物的皮肤、毛发、皮毛或羊毛或人的头发中。在本发明的另一个实施方式中，外寄生物卵可存在于寄主动物包括人，寄主植物包括粮食作物、果树、棉花、油籽作物、观赏植物、花卉、蔓生作物、根类作物、牧草和蔬菜，或其它繁殖地，例如但不限于，房屋和建筑物，家畜和畜牧动物的围栏，地毯、毯子、帘子和家具。

    根据本发明，通过任何合适的手段将外寄生物卵暴露于金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂。本领域技术人员会理解这些手段可以不同，取决于是否将抑制剂施用于寄主，如植物或动物或其它各种繁殖地，并取决于目标外寄生物的特性和种类。将存在于动物的外寄生物卵暴露于金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂的合适手段包括但不限于，直接局部施用，如通过浸泡或喷涂，植入，缓释制剂或器件。本发明应用于人时，适合于局部施用的制剂包括但不限于：喷剂、气雾剂、洗剂、起泡剂、乳膏和洗液，适合于内部施用的制剂包括但不限于：片、胶囊和液体制剂。某些情况下，肠胃外给药是用于人或动物的最合适的防治手段。将金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂应用于植物时，合适的手段包括但不限于：喷剂、粉剂、颗粒或气雾剂。本发明方法还包括同时或相继使用两种或多种金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂，或同时或相继结合其它已知防治外寄生物的制剂使用一种或多种金属螯合剂和/或金属蛋白酶的方法。

    在本发明另一方面，方法和组合物还包括能控制孵化、稚虫或成年外寄生物的杀外寄生物剂。例如，能同时或分开与本发明金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂结合使用的合适杀外寄生物剂包括：有机磷酸盐如马拉硫磷、合成除虫菊酯(氯氰菊酯、溴氰菊酯)昆虫生长调节素、包括幼稚素模拟物、壳多糖合成抑制剂和三嗪衍生物、杀虫细菌毒素、氯化烃类(DDT，硫丹)或在EP 0191236、US 5,288,483和US 6,727,228所述的杀虫剂。其它有用的杀虫剂包括聚二甲基硅氧烷共聚醇，如US 6,663,876和US 6,607,716所述低毒性的那些。这样组合的的优点是只需要一次施用就能控制外寄生物的整个生命周期。

    金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂可施用于寄主的毛发和皮肤，较好在被外寄生物感染的区域。外寄生物感染较好是由于选自虱子、跳蚤、壁虱、苍蝇和其它穿刺或吸血外寄生物，以及它们的组合造成的。最好，外寄生物感染是被虱子引起的。金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂可以药膏、水性组合物包括溶液和悬浮液、乳膏、洗液、气雾喷剂或粉化粉末形式局部施用。

    术语“有效量”指足以提供治疗和防止寄主的外寄生物感染的至少一种金属螯合剂或至少一种金属蛋白酶抑制剂的浓度。本发明方法中使用的金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂的有效量可依据寄主以及外寄生物感染的种类和程度变化。金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂较好地施用到陷于头虱感染的人的发干，并在被治疗的人上停留一段时间以防止虱卵孵化。较好地，这段时间为5-15分钟。金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂宜以约0.0001mM至1M浓度，较好0.01mM-100mM，更好0.1mM-30mM范围施用。有效量取决于所用的金属螯合剂或金属蛋白酶。但是，一些联吡啶化合物可以适当在5mM-15mM，特别是以约10mM施用。由于很多哺乳动物的蛋白酶需要锌用于它们的活性，可由金属螯合剂和/或金属蛋白酶抑制剂实施，因此必须确保金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂以安全和有效量施用，宜专门瞄准外寄生物卵。

    采用本发明方法治疗的寄主选自，但不限于：人、羊、牛、马、猪、家畜、狗和猫。本发明的治疗或预防方法可应用于植物或外寄生物的其它繁殖地。采用本发明方法防治的植物较好选自：棉花、油籽作物、装饰植物、花卉、果树、粮食作物、蔓生作物、根类作物、牧草和蔬菜。

    本发明组合物可配制为溶液和乳液。

    组合物可以存在合适的赋形剂，如乳化剂、表面活性剂、稳定剂、染料、渗透增强剂和抗氧化剂。可加入组合物的合适载体包括：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、硬脂酸镁和硅酸。组合物可以包括灭菌和未灭菌水溶液。组合物宜为溶液形式，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂较好稀释在可溶的灭菌缓冲盐水或水溶液中。组合物还可以配制成在水性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。含水悬浮液还包含提高悬浮液粘度的物质，并且还含有稳定剂。溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。组合物可以包含与金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂活性相容的其它辅助组分。本发明的组合物可以配制成泡沫体、乳液、微乳液、洗剂、mousses、乳膏和凝胶体使用。上述组合物的制剂为杀外寄生物剂领域的技术人员已知。

    在优选的实施方式中，组合物包含浓度为0.0001mM-1M，较好为0.1mM-100mM，更好为0.1mM-30mM的金属螯合剂。含某些金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂，例如联吡啶化合物的组合物，宜含有5-15mM，特别是约10mM的化合物。

    本发明还提供一种识别抑制外寄生物卵孵化的化合物的方法，该方法包括评价化合物对外寄生物卵中存在的金属蛋白酶抑制能力。

    可以采用各种方法来测试化合物对金属蛋白酶的作用，但是，评价方法总体上宜涉及比较存在与不存在测试化合物时的金属蛋白酶的酶活性。一种检测与卵孵化相关的金属蛋白酶的方法涉及收集孵化卵时在形成胚胎周围的流体或在卵孵化后快速冲洗空卵壳，并采用明胶底物SDS-PAGE分析来分析样品存在的蛋白酶。显示样品存在溶解蛋白活性时，则可以在金属蛋白酶抑制剂，例如1，10-菲咯啉存在下孵化，然后再分析处理过的样品，以确定从已经孵化的卵提取的蛋白酶是否有活性。从孵化后卵获得的金属蛋白酶显示具有抑制活性时，则可以将未孵化的卵暴露于同样的抑制剂中，评价能否抑制卵发生孵化。涉及卵孵化的金属蛋白酶的鉴别还可以通过鉴定金属蛋白酶的基因编码，沉默该基因并显示该卵不能通过本领域技术人员已知的方法孵化来鉴别。

    在一个优选的实施方式中，该方法还包括在生物学的外寄生物卵孵化试验中测试所述化合物。

    合适的生物学外寄生物卵孵化试验宜包括：将外寄生物卵的测试样品暴露于包含测试化合物的溶液的同时，将外寄生物卵的对照样品暴露于对照缓冲溶液。

    在对照样品观察到卵孵化，而在测试样品中观察到少量孵化时，认为该化合物能有效抑制外寄生物卵孵化。在本发明优选的卵孵化试验中，外寄生物卵选自：虱子、跳蚤、壁虱、苍蝇和其它穿刺或吸血外寄生物的卵。在一个优选实施方式中，外寄生物卵样品是虱子卵。较好地，所用卵样品(对照样品和测试样品)都是产卵后不超过6-7天。更好地，所用卵样品是产卵后不超过1天。

    对照缓冲溶液包括但不限于：灭菌磷酸盐缓冲的盐水或水。测试的化合物较好是金属螯合剂和/或金属蛋白酶抑制剂。在生物学卵孵化试验中，观察到当卵的孵育襟翼或盖打开时卵孵化，之后稚虫很快开始突露。在虱子情况，首先露出头，随后连接腿的胸部。最后，腹部突露，稚虫从卵中爬出。

    在头虱情况，卵壳则仍粘着在发干上。

    本发明另一方面，提供至少一种金属螯合剂在制备用于抑制外寄生物卵孵化或治疗或预防外寄生物感染的组合物中的用途，其中，金属螯合剂是一种包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧和磷，所述化合物包含至少一个被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或者包含至少一个含至少一个杂原子的杂环的化合物，所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代。

    本发明又一方面，提供至少一种金属蛋白酶抑制剂在制备用于抑制外寄生物卵孵化或治疗或预防外寄生物感染的组合物中的用途。

    本发明还包括包含至少一种本文所述的金属螯合剂和/或至少一种金属蛋白酶抑制剂的制剂，用来抑制外寄生物卵孵化或治疗或预防外寄生物感染。

    本说明书中词语“包括”或变体“包含”应被理解为意味着包括所指的一个整体或分步的元素，或成组的整体或分步的元素，但不排除任何其它一个整体或分步的元素，或成组的整体或分步的元素。

    由下面的非选择性附图和实施例说明本发明。

    实施例

    实施例1-虱卵孵化机理的评价：

    在解剖显微镜下评价虱卵孵化的机理。雌性衣虱在兔子上喂养半小时，之后转移到有人头发的陪替氏培养皿中。然后将该陪替氏培养皿放入32℃和42％相对湿度的孵化器中。5小时饲养期间，雌性虱子开始产卵。每一个雌性虱子在一次孵化时产至多10个卵。卵在之后的7-9天发育。在孵化前的最好12小时内观察到以下变化。用取向为其头靠近孵育襟翼或盖的发育胚胎，清楚地检测到在卵内的发育胚胎的眼睛。观察到胚胎在卵内运动。孵化发生在盖打开时，之后胚胎很快突露。首先露出头，随后连接腿的胸部。最后，腹部突露，稚虫从卵中爬出，卵仍粘着在头发上。在光学显微镜下，没有明显可视的与新突露的稚虫头有关的结构，这便于孵化(即，不存在卵齿状物(egg tooth))。由这一观察结果可认为虽然稚虫在卵内的物理运动可能对卵孵化有用，但也涉及其它特定的生物化学特征。

    实施例2-检测虱卵提取物中的蛋白酶活性：

    在孵化的12小时内，从头发上取下50个体虱卵(Pediculus hunzcarauslaunzanus)，放至一个1ml eppendorf管中。将20μL蒸馏水加到未孵化卵中，在32℃制备孵化30分钟。回收20μL并于-70℃储存。按上述还收集许多其它样品。并收集已取下未孵化卵的头发样品，按上述步骤孵化。此外，收集在产卵后7天(卵孵化的24小时内)的未孵化卵样品和除去虱卵的头发样品。两种样品都用10ml的1％次氯酸钠溶液洗涤1分钟，随后用25ml蒸馏水洗涤5×1分钟，除去次氯酸盐。然后，这些样品按上述在20μL蒸馏水中孵化。此外，一组25个在孵化的24小时内的虱卵用1％次氯酸钠预处理，按上述洗涤，留下进行孵化。在孵化后的1-2小时内，空的卵壳按照上述在20μL蒸馏水中孵化，从孵化卵壳收集洗涤液并在-70℃储存。然后，全部提取物样品冷冻干燥过夜。冷冻干燥的样品然后再悬浮于15μL未还原的SDS样品缓冲液中，以10,000g离心2分钟，然后将全部15μL悬浮液加在10％明胶底物SDS-PAGE凝胶上。该凝胶在4℃，10mA下操作10分钟，随后在15mA/凝胶下再操作25分钟。然后，它们在2.5％Triton-X 100溶液中孵化2×20分钟，随后在含1mM CaCl₂，0.1M，pH 8.0的Tris/HCl中孵化3小时。检测为凝胶上透明区的活性，蛋白酶活性的结果分解凝胶中的明胶。

    这些研究的结果表明，蛋白水解活性存在于许多不同制备物，如使用底物SDS-PAGE所分析的。在孵化12小时内，在未孵化虱卵获得的洗涤物中检测到蛋白酶活性(图1，通道1)。这种活性在凝胶的高分子量区。在明胶底物SDS-PAGE上分析已经除去虱卵的头发样品时检测到显著量的蛋白酶活性(图1，通道2)。对这种活性的最可能的说明是，它是在产量时产生的母性起源。用次氯酸钠处理头发样品能完全除去污染的蛋白酶(图1，通道3)。此外，对未孵化量的处理也能除去这种蛋白酶活性(图1，通道4)。因此，决定在孵化前按上述用1％次氯酸钠Na进行处理，以除去这些母性蛋白酶。对新孵化后的卵壳(卵壳洗涤物)的分析表明：存在两种高分子量物质(图1，通道5)。

    注意到在这次收集中只用了25个虱卵，可能对低水平的蛋白酶活性有用。这些结果证实存在直接与新孵化的虱卵相关的蛋白酶活性。总之，用光学显微镜对虱子的孵化过程进行研究。卵孵化呈现出与卵内发育的稚虫的物理活性有关。但是，缺乏任何专门用来穿刺或松开孵育襟翼或盖的结构，表明孵化过程还涉及生物化学构成。

    虽然在卵孵化时在虱子中检测到高活性蛋白酶，但是这些蛋白酶的主要来源表现出是母性起源。用次氯酸钠对正进行成功孵化的虱子，能达到在卵孵化前除去这种活性。随后对新孵化的虱子的ESW分析表明，存在有限的蛋白酶物质，它们可作为对抑制虱子的卵孵化的目标作进一步的研究。

    实施例3：卵壳洗涤物中蛋白酶的特征：

    为评价在卵壳洗涤物中虱子孵化蛋白酶作为用来抑制卵孵化的目标的可能性，首先必须确定孵化蛋白酶的特性。用四种蛋白酶类的抑制剂来分类ESW中的蛋白酶。

    将10％SDS-PAGE明胶底物凝胶装在来自100个虱卵的冷冻干燥的卵壳洗涤物中，该洗涤物已再悬浮于50μl非还原样品缓冲液，样品以10μl/通道运行。凝胶以10mA/凝胶在4℃运行10分钟，随后以15mA/凝胶再运行25分钟。然后，将凝胶切成带，每个带在含特定抑制剂的2.5％Triton-X 100溶液中孵化2×20分钟。所用抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF(5mM)、金属蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉(10mM)、天冬氨酸蛋白酶胃酶抑素(5plM)和半胱氨酸抑制剂E-64(10mM)。然后，凝胶带在含不同蛋白酶抑制剂的含1mM CaCl2，pH为8的0.1M Tris/HCl中，37℃孵化3小时，之后用考马斯蓝染色并前面所述脱色。与图1不同，通道5显示约25-30kDa的蛋白水解活性的优势(参见图2括弧)。洗涤ESW的制备物的随后分析表明：这种约25-30kDa的蛋白水解活性的三倍量能很好重现。

    抑制剂的研究结构表明：用1，10-菲咯啉处理后蛋白酶的活性明显下降(通道2括号区)。观察当用丝氨酸蛋白酶抑制剂PMS或半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64时，ESW的蛋白酶活性没有下降。此外，天冬氨酸抑制剂胃酶抑素未显示蛋白酶活性的然后下降(数据未示出)。

    实施例4：用来测定虱卵孵化的体外活体鉴定的发展：

    为评价蛋白酶抑制剂对虱卵孵化的潜在作用，必须进行可靠的体外活体鉴定。雄性和雌性衣虱按照前面所述在兔子上喂养。雌性和雄性成年虱子以3∶1的比例转移到一个透明陪替氏培养皿，该培养皿中有约3×3cm²的尼龙布，在32℃保留12小时。在此期间雌性虱子产卵并将卵固定在织物布上。然后除去所有虱子，让卵在孵化5天。在第6天，将含有卵的布放入1％次氯酸钠溶液中1分钟，然后充分洗涤。卵通过最好的发育阶段发展到孵出。在未处理的对照卵中，采用体外卵孵化评价，达到85-95％的可靠的平均孵化％。随后发现对卵孵化评价，并不需用次氯酸钠预处理虱卵。

    实施例5：识别能抑制虱子孵化蛋白酶活性的化合物：

    (a)采用虱卵-孵化活体鉴定测试蛋白酶抑制剂。

    已改进用来测定虱卵孵化的活体鉴定，在研究的下一阶段，采用这种活体鉴定作为测试不同蛋白酶抑制剂对卵孵化的作用。

    如上所述，将虱卵放在布上。5天后，除去布上虱卵，并将其浸在1％次氯酸钠溶液中，之后用蒸馏水充分洗涤，并在棉纸上吸干。在解剖显微镜下对虱卵计数，将布切成一批有10-30卵的小块，对每一次处理有3-5个重复品。将含有虱卵的布浸在蛋白酶抑制剂溶液中2-10分钟，再放在棉纸上吸干1分钟，然后转移到一个透明陪替氏培养皿上，孵卵直到孵化。在接下来的1-2天，以规定时间间隔观察卵证明卵孵化，这段时间对照卵孵化。通常将蛋白酶抑制剂溶液制备成储备溶液，以适当浓度新鲜加入。具体的储备溶液如下制备：1，10-菲咯啉(200mM甲醇溶液)和苯丁亮氨酸(5mg/ml甲醇溶液)。此外，在含对照卵的非抑制剂中加入等量溶剂，测试任何只有缓冲剂时的作用。计算孵化抑制百分数为预未处理的对照相比，卵孵化减少的百分数。未处理的对照指定为100％的孵化。

    其它的1，10-菲咯啉，一种金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂在10mM时能显著抑制虱子的卵孵化，与对照组相比在1mM时的抑制水平约为30％(参见图3)。苯丁亮氨酸，一种金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂，更具体是氨基肽酶M和N在5mM时也能显著抑制虱卵孵化(图4)。

    这些结果提供了特定金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂对虱卵孵化作用的数据。但是，注意到在孵化24小时内加入1，10-菲咯啉或苯丁亮氨酸时，观察到不同的对卵孵化的抑制作用(数据未示出)。这种对孵化抑制作用的变化的原因可能是涉及虱子特定发育阶段的许多因素。而且，这些研究表明，很难预测卵孵化的确切时间，因此在评价具体抑制剂对卵孵化作用时，可能较难选择处理卵的简单时间点。

    因此，考虑到虱子发育中的这种变化性，改进体外活体鉴定系统。

    (b)采用体外活体鉴定的时间过程实验。

    进行一系列的时间过程实验，作为评价抑制剂对虱卵孵化作用的手段。如前面所述将卵放置在布上，然后以24小时的间隔，将抑制剂加入新的一组卵，直到放置到120小时。然后，卵在28℃再孵化8天，使卵孵化。这种评价抑制剂的方法更接近反映出虱卵在各发育阶段的现场情况。

    这些研究的结果列于表1。证明不同浓度的1，10-菲咯啉在虱子孵化过程中的显著抑制作用。还观察到1，10-菲咯啉的抑制作用与浓度无关的程度。结果表明：时间过程实验提供了一种评价抑制剂对虱卵孵化的抑制作用的更可靠的手段。加入苯丁亮氨酸产生显著的抑制作用，不仅是在卵孵化前24小时施用时。

    表1，在产卵后，用不同浓度1，10-菲咯啉和5mM苯丁亮氨酸处理后，以24小时的间隔对卵孵化的抑制％

    

    上面的研究结果表明：虱子孵化酶是金属类蛋白酶，如由金属螯合剂金属蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉抑制其活性作用所判断的。而且，特别在孵化期间以低浓度处理卵时，浓度依赖作用的明显证据说明，这种化合物能够在全部测试的时间点显著抑制虱卵孵化。1，10-菲咯啉提供其螯合金属离子较好是锌的能力显示其作用，从而抑制与锌相关的蛋白酶。

    对苯丁亮氨酸的数据还表明，在卵发育后阶段将该化合物给予卵时，特别能抑制虱子卵的孵化。苯丁亮氨酸是一种环化合物，包含被含胺、羟基、酰胺和羧基的取代基取代的芳环。苯丁亮氨酸是一种微生物源的抗生素，可用来防治各种形式的毒瘤，包括非淋巴细胞的白血病，以及不同形式的固态肿瘤，包括肺、胃、膀胱、头、颈和食管，苯丁抑制素名下使用的情况。可以以低毒性给予培养的细胞，接触动物和人。虽然苯丁亮氨酸常规以微摩尔浓度用作纯化蛋白酶的抑制剂(10μM和130pM)，所获数据表明只到5mM才是有效。这一结果可能是由于多种因素包括苯丁亮氨酸穿透卵的能力及其对虱子孵化蛋白酶的特异性能造成的。

    实施例6：筛选抑制虱卵孵化的蛋白酶抑制剂：

    按实施例4所述，将虱子卵放在布料上。按照实施例5(部分(b))所述组织一系列的时间-过程试验。对相当数量的市售蛋白酶抑制剂/金属螯合剂进行虱子孵化试验，以测定各蛋白酶抑制剂对虱卵孵化的作用(表2)。计算的孵化抑制百分数为与未处理的对照组相比卵孵化减少的百分数。设定未处理的对照组的孵化百分数为100％。

    表2.用各种蛋白酶抑制剂处理后对虱卵孵化抑制百分数。抑制百分数指在该试验的时间-过程中达到的最大卵孵化。

       编号  抑制剂 抑制％*  1  1，10-菲咯啉(10mM) 100  2  2，2-联吡啶(10mM) 100  3  6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶(10mM) 100  4  5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶(10mM) 100  5  Captopril(23mM) 27

       编号  抑制剂 抑制％*  6  D-L Thiorophan(1mg/ml) 20  7  磷阿米酮(5mM) 41  8  放线酰胺素(Actinonin)(5mM) 0  9  苯丁亮氨酸(5mM) 58  10  硝基苯丁亮氨酸(1mg/ml) 0  11  Amastatin(5mM) 26  12  Leuhistin(5mM) 0  13  Ebelactone(1，2和5mM) 0  14  L-leucinthiol(5mM) 0  15  烟曲霉素(Fumagillin)(5mM) 0  16  羧肽酶抑制剂(5mM) 26  17  N-CBZ-PRO-LEU-GLY羟肟酸酯(10mM) 0  18  四环素(5mg/ml) 89  19  强力霉素(5mg/ml) 69  20  二甲胺四环素(5mg/ml) 55  21  GM 1489 0  22  GM 6001 0  23  抑制剂IV 0  24  洗必太二盐酸盐 0

    *不同蛋白酶抑制剂对卵孵化的抑制百分数相对于适当的对照进行计算，抑制百分数代表所观察到的最大卵孵化抑制。

    许多蛋白酶抑制剂显示能显著抑制虱卵孵化。测试显示最有效的抑制剂包括金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂，如1，10-菲咯啉、2，2-联吡啶和6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶、5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶(各自在10mM时100％抑制)。苯丁亮氨酸(金属蛋白酶抑制剂)也能显著抑制卵孵化(5mM时为58％)。

    天然生成的基质(matrix)的四环化合物(其中一个环是芳环，四环结构可以被多个羟基、羰基、胺和酰胺取代)的金属蛋白酶(MMP)抑制剂和金属螯合剂包括：四环素(5mg/ml时89％抑制)，强力霉素(5mg/ml，65％抑制)和二甲胺四环素(5mg/ml，55％抑制)。这些金属螯合剂显示对卵孵化的抑制活性，但是这些化合物的抑制效果量级上有较大差别，并且表现出与时间相关。氧肟酸盐抑制剂的总体可用性由于降低抗生素在一般环境的使用而受到限制。这些结果表明MMP抑制剂也对虱卵孵化显示抑制作用。测试的其它蛋白酶抑制剂包括100mM EDTA、10mM EGTA和5％三乙醇胺。结果表明这些抑制剂在所用浓度(结果未示出)并未显示对卵孵化的作用。

    实施例7：用1-10菲咯啉洗涤卵的后处理效果：

    该试验用来测定洗涤卵是否能达到1，10-菲咯啉的抑制活性(表3)。还设定对照组(5％甲醇)。金属孵化抑制％为与未处理对照组相比的卵孵化降低的百分数。设定未处理对照组的抑制百分数为100％。此试验的结果表明在水中洗涤卵后1，10-菲咯啉仍能有效抑制虱卵孵化。在后一阶段，卵适当孵化(5天)，其作用显示与使用低浓度抑制剂时有类似的浓度依赖性。还注意到用一定比例的用1，10-菲咯啉处理的卵的胚胎在正常发育下仍不能孵化。

    表3.在虱子产卵后以24小时间隔，用10mM 1-10菲咯啉处理，对卵孵化的抑制百分数。虱子卵用抑制剂处理10分钟并且不洗涤，或进行处理并洗涤1分钟，然后孵化。

    

    实施例8：用1-10菲咯啉抑制头虱卵孵化：

    该试验用来测定金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉是否能抑制头虱卵(头虱)孵化，与体虱不同。将每组1-2个成年雄性头虱和6-8个成年雌性头虱放在有棉布的24孔陪替氏培养皿的单个孔中，获得卵。将陪替氏培养皿转移到32℃，70％RH的潮湿孵化器中12小时，使雌性虱子产卵。12小时后，从陪替氏培养皿孔中取出成年虱子，进行一系列的时间-过程试验。一组卵(24小时虫龄)用200μl 10mM 1，10-菲咯啉处理10分钟。还包括对照组卵(即未经抑制剂处理)。从抑制剂中除下的卵在棉纸上吸干，处于32℃和70％RH下孵化。第二组卵(48吸收虫龄)如前所述进行处理并且进行孵化。在产卵后以24小时间隔重复这一过程，至多为120小时。这种测试抑制剂的方法更密切反映了虱子卵在头的发育不同阶段的现场并且观察到对不同阶段的寄生虫的抑制作用。

    上面的研究结果表明1，10-菲咯啉能显著抑制头虱的卵孵化(表4)。

    表4.在产卵后以24小时间隔，用10mM 1，10-菲咯啉处理，相对于对照组对卵孵化的抑制百分数。

    

    这些结果足以表明体虱是一种用来评价蛋白酶抑制剂对头虱的卵孵化的抑制作用的有效方式。

    实施例9：用金属螯合剂抑制虱卵孵化：

    用两种可用作金属蛋白酶抑制剂的金属螯合剂进行试验，来测定它们对虱卵孵化的作用。对这些化合物进行标准虱子试验，测定它们的杀卵作用(参见用来测试抑制剂的方法的实施例5和6)。评价以下金属螯合剂：2，2’-联吡啶和6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶。此研究的结果列于表5和6。

    表5.在产卵后以24小时间隔，用2，2’-联吡啶处理后的卵孵化结果。所列结果简称如下：N(每次平行试验的卵数)，H(成功孵化的卵数)和Ph(部分孵化的卵数)。

    

    表6.在产卵后以24小时间隔，用6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶处理后的卵孵化结果。所列结果简称如下：N(每次平行试验的卵数)，H(成功孵化的卵数)和Ph(部分孵化的卵数)。

    

    这些研究的结果表明6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶和2，2’-联吡啶都显示很强的杀卵活性，在测试的全部时间完全抑制了虱卵孵化。6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶和2，2’-联吡啶都是非夹层的的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂。

    实施例10：用1，10-菲咯啉处理市售虱子产品的比较试验

    对三种主要的市售头虱产品进行标准虱卵孵化试验，评价这些产品的杀卵性能。这三种市售头虱产品如下：

    1.Nelson Laboratories，活性成分1％maldison(马拉硫磷)；

    2.Bayer，活性成分，1％除虫菊酯；

    3.Pfizer，活性成分，1％氯菊酯。

    按照厂商的推荐测试这三种产品。按照厂商推荐用不同产品处理多组卵(24小时虫龄)适当的时间(5-10分钟)，随后在32℃水中漂洗1-2分钟。还加入一个正对照组(10mM 1，10-菲咯啉)和两个负对照组(未处理和20％甲醇)。暴露于不同产品后，卵在32℃温水中漂洗，之后在棉纸上吸干，处于32℃，70％RH下孵化。第二组卵(48小时虫龄)按照前述处理并进行孵化。在产卵后以24小时间隔重复这一过程，至多为120小时。这种测试抑制剂的方法更密切反映了虱子卵在头部的发育不同阶段的现场并且观察到对不同阶段的寄生虫的抑制作用。研究结果列于表7。

    表7.在产卵后以24小时间隔，对三种市售头虱产品、10mM 1，10-菲咯啉和对照组处理后的卵孵化结果。所列结果简称如下：N(每次平行试验的卵数)，H(成功孵化的卵数)和Ph(部分孵化的卵数)。

    

    三种市售灭虱剂的测试结果表明，它们在虱卵孵化的不同阶段显示不一致的杀卵活性孵化。而化合物1，10-菲咯啉显示能有效抑制虱卵孵化。

    实施例11：其它市售产品的评价

    两种主要的市售头虱产品进行标准虱卵孵化试验。这两种市售头虱产品如下：

    1.ProntoShampoo Del Laboratories，活性成分0.33％除虫菊酯；

    2.ProntoMousse Shampoo Del Laboratories，活性成分，0.33％除虫菊酯。

    按照厂商的推荐测试这两种产品。按照厂商推荐用不同产品处理多组卵(24小时虫龄)适当的时间(5-10分钟)，随后在32℃水中漂洗1-2分钟。还加入两个负对照组(未处理和20％乙醇)。暴露于不同产品后，卵在32℃温水中漂洗，之后在棉纸上吸干，在32℃，70％RH下孵化。第二组卵(48小时虫龄)按照前述处理并进行孵化。在产卵后以24小时间隔重复这一过程，至多为120小时。这种测试抑制剂的方法更密切反映了虱子卵在头部的发育不同阶段的现场并且观察到对不同阶段的寄生虫的抑制作用。研究结果列于表8。

    表8.在产卵后以24小时间隔，对两种市售头虱产品和对照组处理后的卵孵化结果。所列结果简称如下：N(每次平行试验的卵数)，H(成功孵化的卵数)和Ph(部分孵化的卵数)。

    

    两种市售灭虱剂的测试结果表明，它们在虱卵孵化的不同阶段的杀卵活性很差，且不一致。

    本领域技术人员应理解，在不偏离广义所述的本发明的精神和范围下，可以对按具体实施方式所示的本发明进行各种变动和/或修改。因此，认为在此的实施方式是说明书性的不构成限制。

    上面所述的所有出版物被全文参考结合于本文。

    本说明书中包含的对文献、作用、材料、设备、制品等的所有讨论仅用于提供本发明的背景。但是并不认为任何或所有这些物质形成现有技术的一部分或是与本发明相关的领域的公知常识，就象它们在本申请的各权利要求的优先权日之前在任何国家已存在那样。

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