技术领域
本发明涉及动物分子免疫学，具体涉及阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用。
背景技术
免疫系统存在着活化和抑制调节两种信号通路，免疫活化和抑制调节相互协调共同维持免疫系统动态平衡。TCR或BCR与MHC分子-抗原肽和共刺激信号通路B7/CD28共同调节T细胞或B细胞活化；另外，T细胞表面存在一系列的免疫抑制性表面分子，如PD-1、CTLA-4、Tim-3、ICOS、LFA1、SLAM、LAG-3等，与其相应配体结合激活免疫负调节通路，导致T细胞功能衰竭。其中PD-1/PD-Ls通路是目前研究的热点，研究表明，多种急性或慢性病毒性疾病过程中，PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达量升高，PD-1与其配体相互结合后，激活PD-1下游通路，抑制了T细胞抗病毒细胞因子分泌、增殖和CTL等功能，导致机体免疫抑制。有趣的是用抗PD-1或PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-Ls通路后，可以逆转已衰竭T细胞的功能，为提高免疫水平和治疗病毒性免疫抑制性疾病提供新的思路和方法。
PD-L1比PD-L2的分布更加广泛，如表达PD-L1的细胞种类较多，如B细胞、DC、巨噬细胞、骨髓源肥大细胞、T细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、胰岛细胞星形胶质细胞等，而PD-L2仅表达于DC、巨噬细胞、记忆性B细胞等，所以在阻断PD-1/PD-Ls通路逆转T细胞功能方面，PD-1/PD-L1通路比PD-1/PD-L2通路显得更加重要。相关研究表明，可溶性PD-1重组蛋白免疫小鼠后，可以显著提高T细胞抗病毒或抗肿瘤免疫反应，达到清除病原或杀死肿瘤细胞的目的，为开发可溶性蛋白PD-1和PD-Ls的药物或疫苗奠定基础。目前，PD-1和PD-Ls的晶体结构已被解析，在PD-1与PD-L1复合物结合区域中，PD-1的N末端结合区域与PD-L1的C端结合区域位于复合物的同一侧面，PD-1的两个β折叠链分别位于ABED和A′GFCC′C″区域，PD-L1的两个β折叠链分别位于AGFCC′C″和BED区域，为筛选和鉴定阻断PD-1/PD-Ls通路的多肽表位提供有利信息。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用。
本发明的技术方案是：阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESHQAKLT。
本发明的另一目的在于，提供了阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高体液免疫中的应用。
阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽作为佐剂在提高体液免疫中的应用。
阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高细胞免疫中的应用。
阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽的用途，用于结合PBMC上的PD-L1，阻断PD-1/PD-L1通路，提高PBMC增殖。
本发明设计合成了基于PD-1/PD-L1复合物结合位点的系列多肽，对其阻断PD-1/PD-L1通路后的免疫效应进行研究，为获得提高免疫效应的多肽药物或疫苗佐剂奠定基础。
附图说明
图1a是PBMC与FITC结合的结合流式散点图。
图1b是PBMC与FITC结合的流式荧光曲线图。
图1c是PBMC与本发明多肽结合散点图。
图1d是PBMC与本发明多肽结合曲线图。
图2a是阴性对照组刺激PBMC增殖的流式图。
图2b是本发明多肽刺激PBMC增殖的流式图。
图3a是本发明多肽高效液相图。
图3b是本发明多肽的质谱图。
图4是本发明多肽作为佐剂免疫小鼠的抗体效价变化。
图5a是FITC对照组。
图5b是PD-15与重组蛋白PD-L1的结合。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明。
多肽标记FITC
用FITC Antibody Labeling Kit试剂盒将FITC标记于多肽上，FITC Antibody Labeling Kit可以将FITC连接于氨基酸残基中的巯基、咪唑基、羰基和酪氨酰等基团，步骤如下：
(1)多肽准备，向0.5mL 2mg/mL多肽溶液中加入40μL 0.67mol/L的硼酸钠溶液，并将多肽浓度调制1mg/mL；
(2)0.5mL多肽加入装有约30μL FITC试剂管中，混匀使试剂充分溶解，室温避光孵育60min；
(3)往反应管中加入400μL纯化树脂，将反应管放入微型收集管中，1000r/min室温离心30～45sec，弃掉收集管；
(4)把反应管放入新的收集管中，加入250～270μL的标记反应液(0.05mol/L硼酸钠溶液)，混匀，1000r/min室温离心30～45sec，收集液即为标记并纯化多肽，分装－20℃避光保存。
FITC标记多肽与PBMC结合
PBMC分离
(1)颈静脉采集正常猪抗凝血5mL，抗凝剂为10％柠檬酸钠，全血与抗凝剂比例为10:1，抗凝血与等量PBS轻轻混匀；
(2)取4mL淋巴细胞分离液于15mL玻璃离心管中，将上述混匀血10mL沿管壁慢慢加入离心管中(注：动作要轻，不能混匀)，水平转子2000r/min，室温离心20min；
(3)用毛细管吸取血浆层与分离液之间的白色细胞薄层(单个核细胞)，移入新的15mL玻璃离心管中，加入2～5倍体积PBS，轻轻悬浮细胞，1000r/min，室温离心10min，弃上清，加入10mL PBS，轻轻悬浮细胞，重复离心一次，弃上清；
(4)观察白细胞中红细胞量，适当加入1～2mL红细胞裂解液，冰上裂解红细胞5min，加入10mL PBS，1000r/min，室温离心10min，弃上清，加入0.5mL PBS，悬浮细胞，即为PBMC细胞悬液。
PD-15与PBMC结合
PBMC来自于临床感染PCV2的断奶仔猪，用PBS调整PBMC浓度至106个/mL，取106个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL的FTIC-多肽(总体积200μL)，同时设FITC为阴性对照组，混合均匀后冰上避光结合2h，期间多次悬浮细胞，PBS洗涤6次，加入0.5mL PBS悬浮细胞，200目尼龙网过滤后，流式细胞仪和荧光显微镜检测多肽与PBMC结合情况，流式细胞仪计数20000个细胞。
多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合
(1)包板，10μg/mL的PD-L1包板，50μL/孔，4℃过夜孵育，PBST洗涤3次；
(2)封闭，5％脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃孵育4h，PBST洗涤3次；
(3)加多肽，加入0.1mg/mL FITC标记多肽PD-15，设FITC为阴性对照，浓度为0.1mg/mL，稀释液为5％脱脂奶粉，50μL/孔，37℃孵育2h，PBS洗涤5次，
(4)荧光显微镜观察多肽PD-15与PD-L1的结合情况，记录结果。
为检测合成的系列多肽能否阻断PD-1/PD-L1通路，首先检测多肽与PD-1或PD-L1结合，本研究用标记FITC的多肽与PBMC结合，流式细胞仪检测结果显示，多肽PD-15与PBMC结合后，与FITC对照组相比荧光信号显著增强，说明多肽PD-15与PBMC结合(如图1a，图1b，图1c，图1d所示)。多肽PD-15与重组蛋白PD-L1结合试验表明，PD-15可以与PD-L1结合，因此得出结论，PD-15位于猪PD-1蛋白上，PD-15与PBMC的结合是与PBMC上的PD-L1结合。
多肽PD-15阻断PD-1/PD-L1通路后对PBMC增殖影响
(1)PBMC来临床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪，PBMC的分离纯化同上述过程，用RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至106个/mL；
(2)分别取106个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL未标记多肽(总体积200μL)，冰上避光孵育2h，PBS洗涤3次，洗去未结合多肽；
(3)加入10μmol/L CFSE，37℃孵育10min，1000r/min室温离心10min，弃上清，洗涤3次，将多余的SFSE洗去；
(4)将PBMC转至96孔细胞培养板中，50000个/孔，每个样品做6个重复，然后加入100μL 10％RPMI-1640培养基，10mg/mL conA，4mmol/L L-谷氨酰胺，10μL猪血浆(过滤除菌)100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃5％CO2培养箱中培养3d，收集细胞，PBS洗涤3次，加入0.5mL PBS悬浮细胞，200目尼龙网过滤，流式细胞仪计数20000个细胞，检测细胞中CFSE荧光信号强弱，判定PBMC增殖能力。
多肽PD-15阻断后对PBMC增殖影响
体外检测PBMC的增殖变化，以期证实多肽PD-15结合PBMC后能否阻断PD-1/PD-L1通路。本研究用感染PCV2断奶仔猪的PBMC，与多肽PD-15作用后，培养3d，检测CFSE标记的PBMC增殖变化，流式结合显示PD-15阻断PD-1/PD-L1通路后，PBMC的增殖显著提高，出现大量增殖细胞，而空白对照组的PBMC几乎未增殖(图2)。说明PD-15不但能够结合PBMC上的PD-L1，而且还能阻断PD-1/PD-L1通路，提高免疫细胞免疫效应。为深入研究PD-15的免疫功能奠定基础。
(1)PBMC来自临床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪，PBMC的分离纯化同上述过程，用RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至106个/mL；
(2)分别取106个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL未标记多肽(总体积200μL)，冰上避光孵育2h，PBS洗涤3次，洗去未结合多肽；
(3)加入10μmol/L CFSE，37℃孵育10min，1000r/min室温离心10min，弃上清，洗涤3次，将多余的SFSE洗去；
(4)将PBMC转至96孔细胞培养板中，50000个/孔，每个样品做6个重复，然后加入100μL 10％RPMI-1640培养基，10mg/mL conA，4mmol/L L-谷氨酰胺，10μL猪血浆(过滤除菌)100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃5％CO2培养箱中培养18～24h；
(5)流式检测结果，计数20000个PBMC。
免疫小鼠
(1)准备病毒，石门株CSFV为本实验室在PK-15细胞上传代获得，用终浓度为2‰的甲醛溶液37℃灭活24h；
(2)免疫昆明鼠，50μg灭活CSFV+50μg PD-15多肽/只，皮下多点注射，同时设CSFV和PBS两组对照，每组试验3只昆明鼠，一免后14d进行二免，二免后14d，检测CSFV抗体的水平。
多肽PD-15作为佐剂与灭活CSFV共同免疫昆明鼠，CSFV和PBS分别为无多肽对照和阴性对照，二免后14d用ELISA检测CSFV抗体水平。结果显示，多肽PD-15和CSFV抗原组的抗体效价达1:3200以上，无多肽的CSFV组的抗体效价为1:400～1:1600(见表1和图4)，说明多肽PD-15能够刺激B细胞活化，提高B细胞产生抗体的能力，为PD-15作为免疫佐剂提高体液免疫反应奠定基础。
表1 CSFV抗体效价
ELISA检测抗体水平
用本实验室已建立检测CSFV的ELISA方法，具有步骤如下：
(1)包被包被液稀释灭活CSFV至10μg/mL，50μL/孔，4℃过夜，PBST洗3次；
(2)封闭5％脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃封闭4h，PBST洗3次；
(3)加一抗免疫鼠血清依次1:50，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200，1:102400倍稀释，50μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗3次；
(4)加二抗HRP标记羊抗鼠IgG 1:5000倍稀释，稀释液为5％脱脂奶粉，50μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗3次；
(5)显色底物缓冲液A和B液混合后，50μL/孔，显色5min左右，加入2mol/L的H2SO4终止液50μL/孔。
(6)结果判定，酶标仪读取各孔OD450nm吸光值，以P/N≥2.1判为阳性。
测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列
HPLC检测多肽PD-15的纯度，HPLC结果显示在洗脱时间约为11min左右呈现单一狭窄峰，表明多肽纯度高(图3a)，质谱分析结果表明氨基酸数量和顺序正确，分子量为4012.42Da(图3b)。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 新乡学院
<120> 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用
<140> 2015101320904
<141> 2015-03-25
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> RNA
<213> 猪(sus scrofa)
<400> 1
Cys Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Ala Ile
Tyr Leu Pro Pro Lys Thr Gln Ile Asn Glu Ser His Gln Ala Lys
Leu Thr