阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510132090.4 (22)申请日 2015.03.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104761633 A (43)申请公布日 2015.07.08 (73)专利权人 新乡学院 地址 453000 河南省新乡市金穗大道191号 (72)发明人 岳锋王选年朱艳平李鹏 孙国鹏张艳芳 (74)专利代理机构 北京汉昊知识产权代理事务 所(普通合伙) 11370 代理人 冯谱 (51)Int.Cl. C07K 14/705(2006.01) A61K 38/

2、17(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 37/04(2006.01) 审查员 贾麒 (54)发明名称 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用 (57)摘要 本发明公开了基于阻断猪PD-1/PD-L1复合 物结合位点的多肽， 对其阻断猪PD-1/PD-L1通路 后的免疫效应进行初步研究， 为获得提高免疫效 应的多肽药物或疫苗佐剂奠定基础。 该多肽： CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESHQAKLT， 分子量： 4012.42Da。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图7页 CN 104761633 B 2018.11.27 CN 1

3、04761633 B 1.阻 断 猪 P D - 1 / P D - L 1 通 路 的 多 肽 ， 其 特 征 在 于 ， 其 氨 基 酸 序 列 为 ： CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESHQAKLT。 2.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在制备提高体液免疫药物中的应 用。 3.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽作为佐剂在制备提高体液免疫药物 中的应用。 4.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在制备提高细胞免疫药物中的应 用。 5.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在制备提高PBMC增殖药物中的应

4、用， 所述药物用于结合PBMC上的PD-L1， 阻断PD-1/PD-L1通路。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104761633 B 2 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用 技术领域 0001 本发明涉及动物分子免疫学， 具体涉及阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用。 背景技术 0002 免疫系统存在着活化和抑制调节两种信号通路， 免疫活化和抑制调节相互协调共 同维持免疫系统动态平衡。 TCR或BCR与MHC分子-抗原肽和共刺激信号通路B7/CD28共同调 节T细胞或B细胞活化； 另外， T细胞表面存在一系列的免疫抑制性表面分子， 如PD-1、 CTLA- 4、 Tim-

5、3、 ICOS、 LFA1、 SLAM、 LAG-3等， 与其相应配体结合激活免疫负调节通路， 导致T细胞功 能衰竭。 其中PD-1/PD-Ls通路是目前研究的热点， 研究表明， 多种急性或慢性病毒性疾病过 程中， PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达量升高， PD-1与其配体相互结合后， 激活PD-1下游通 路， 抑制了T细胞抗病毒细胞因子分泌、 增殖和CTL等功能， 导致机体免疫抑制。 有趣的是用 抗PD-1或PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-Ls通路后， 可以逆转已衰竭T细胞的功能， 为提高免疫 水平和治疗病毒性免疫抑制性疾病提供新的思路和方法。 0003 PD-L1比PD-L2

6、的分布更加广泛， 如表达PD-L1的细胞种类较多， 如B细胞、 DC、 巨噬 细胞、 骨髓源肥大细胞、 T细胞、 血管内皮细胞、 成纤维细胞、 上皮细胞、 胰岛细胞星形胶质细 胞等， 而PD-L2仅表达于DC、 巨噬细胞、 记忆性B细胞等， 所以在阻断PD-1/PD-Ls通路逆转T细 胞功能方面， PD-1/PD-L1通路比PD-1/PD-L2通路显得更加重要。 相关研究表明， 可溶性PD-1 重组蛋白免疫小鼠后， 可以显著提高T细胞抗病毒或抗肿瘤免疫反应， 达到清除病原或杀死 肿瘤细胞的目的， 为开发可溶性蛋白PD-1和PD-Ls的药物或疫苗奠定基础。 目前， PD-1和PD- Ls的晶体结

7、构已被解析， 在PD-1与PD-L1复合物结合区域中， PD-1的N末端结合区域与PD-L1 的C端结合区域位于复合物的同一侧面， PD-1的两个 折叠链分别位于ABED和A GFCC C 区 域， PD-L1的两个 折叠链分别位于AGFCC C 和BED区域， 为筛选和鉴定阻断PD-1/PD-Ls通路 的多肽表位提供有利信息。 发明内容 0004 为了解决现有技术的不足， 本发明提供了阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应 用。 0005 本发明的技术方案是： 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽， 其特征在于， 其氨基酸序列 为： CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESH

8、QAKLT。 0006 本发明的另一目的在于， 提供了阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高体液免疫中 的应用。 0007 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽作为佐剂在提高体液免疫中的应用。 0008 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高细胞免疫中的应用。 0009 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽的用途， 用于结合PBMC上的PD-L1， 阻断PD-1/PD-L1 通路， 提高PBMC增殖。 0010 本发明设计合成了基于PD-1/PD-L1复合物结合位点的系列多肽， 对其阻断PD-1/ 说明书 1/5 页 3 CN 104761633 B 3 PD-L1通路后的免疫效应进行

9、研究， 为获得提高免疫效应的多肽药物或疫苗佐剂奠定基础。 附图说明 0011 图1a是PBMC与FITC结合的结合流式散点图。 0012 图1b是PBMC与FITC结合的流式荧光曲线图。 0013 图1c是PBMC与本发明多肽结合散点图。 0014 图1d是PBMC与本发明多肽结合曲线图。 0015 图2a是阴性对照组刺激PBMC增殖的流式图。 0016 图2b是本发明多肽刺激PBMC增殖的流式图。 0017 图3a是本发明多肽高效液相图。 0018 图3b是本发明多肽的质谱图。 0019 图4是本发明多肽作为佐剂免疫小鼠的抗体效价变化。 0020 图5a是FITC对照组。 0021 图5b是

10、PD-15与重组蛋白PD-L1的结合。 具体实施方式 0022 下面结合实施例对本发明做详细说明。 0023 多肽标记FITC 0024 用FITC Antibody Labeling Kit试剂盒将FITC标记于多肽上， FITC Antibody Labeling Kit可以将FITC连接于氨基酸残基中的巯基、 咪唑基、 羰基和酪氨酰等基团， 步骤 如下： 0025 (1)多肽准备， 向0.5mL 2mg/mL多肽溶液中加入40 L 0.67mol/L的硼酸钠溶液， 并 将多肽浓度调制1mg/mL； 0026 (2)0.5mL多肽加入装有约30 L FITC试剂管中， 混匀使试剂充分溶解，

11、 室温避光孵 育60min； 0027 (3)往反应管中加入400 L纯化树脂， 将反应管放入微型收集管中， 1000r/min室温 离心3045sec， 弃掉收集管； 0028 (4)把反应管放入新的收集管中， 加入250270 L的标记反应液(0.05mol/L硼酸 钠溶液)， 混匀， 1000r/min室温离心3045sec， 收集液即为标记并纯化多肽， 分装20避 光保存。 0029 FITC标记多肽与PBMC结合 0030 PBMC分离 0031 (1)颈静脉采集正常猪抗凝血5mL， 抗凝剂为10柠檬酸钠， 全血与抗凝剂比例为 10:1， 抗凝血与等量PBS轻轻混匀； 0032 (2

12、)取4mL淋巴细胞分离液于15mL玻璃离心管中， 将上述混匀血10mL沿管壁慢慢加 入离心管中(注： 动作要轻， 不能混匀)， 水平转子2000r/min， 室温离心20min； 0033 (3)用毛细管吸取血浆层与分离液之间的白色细胞薄层(单个核细胞)， 移入新的 15mL玻璃离心管中， 加入25倍体积PBS， 轻轻悬浮细胞， 1000r/min， 室温离心10min， 弃上 清， 加入10mL PBS， 轻轻悬浮细胞， 重复离心一次， 弃上清； 说明书 2/5 页 4 CN 104761633 B 4 0034 (4)观察白细胞中红细胞量， 适当加入12mL红细胞裂解液， 冰上裂解红细胞

13、5min， 加入10mL PBS， 1000r/min， 室温离心10min， 弃上清， 加入0.5mL PBS， 悬浮细胞， 即为 PBMC细胞悬液。 0035 PD-15与PBMC结合 0036 PBMC来自于临床感染PCV2的断奶仔猪， 用PBS调整PBMC浓度至106个/mL， 取106个 PBMC加入终浓度为0.1mg/mL的FTIC-多肽(总体积200 L)， 同时设FITC为阴性对照组， 混合 均匀后冰上避光结合2h， 期间多次悬浮细胞， PBS洗涤6次， 加入0.5mL PBS悬浮细胞， 200目 尼龙网过滤后， 流式细胞仪和荧光显微镜检测多肽与PBMC结合情况， 流式细胞仪计

14、数20000 个细胞。 0037 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合 0038 (1)包板， 10 g/mL的PD-L1包板， 50 L/孔， 4过夜孵育， PBST洗涤3次； 0039 (2)封闭， 5脱脂奶粉封闭， 200 L/孔， 37孵育4h， PBST洗涤3次； 0040 (3)加多肽， 加入0.1mg/mL FITC标记多肽PD-15， 设FITC为阴性对照， 浓度为 0.1mg/mL， 稀释液为5脱脂奶粉， 50 L/孔， 37孵育2h， PBS洗涤5次， 0041 (4)荧光显微镜观察多肽PD-15与PD-L1的结合情况， 记录结果。 0042 为检测合成的系列多肽能否阻

15、断PD-1/PD-L1通路， 首先检测多肽与PD-1或PD-L1 结合， 本研究用标记FITC的多肽与PBMC结合， 流式细胞仪检测结果显示， 多肽PD-15与PBMC 结合后， 与FITC对照组相比荧光信号显著增强， 说明多肽PD-15与PBMC结合(如图1a， 图1b， 图1c， 图1d所示)。 多肽PD-15与重组蛋白PD-L1结合试验表明， PD-15可以与PD-L1结合， 因此 得出结论， PD-15位于猪PD-1蛋白上， PD-15与PBMC的结合是与PBMC上的PD-L1结合。 0043 多肽PD-15阻断PD-1/PD-L1通路后对PBMC增殖影响 0044 (1)PBMC来临

16、床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪， PBMC的分离纯化同上述过程， 用 RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至106个/mL； 0045 (2)分别取106个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL未标记多肽(总体积200 L)， 冰上避 光孵育2h， PBS洗涤3次， 洗去未结合多肽； 0046 (3)加入10 mol/L CFSE， 37孵育10min， 1000r/min室温离心10min， 弃上清， 洗涤 3次， 将多余的SFSE洗去； 0047 (4)将PBMC转至96孔细胞培养板中， 50000个/孔， 每个样品做6个重复， 然后加入 100 L 10RPMI-1640培养基，

17、 10mg/mL conA， 4mmol/L L-谷氨酰胺， 10 L猪血浆(过滤除 菌)100IU/mL青霉素和100 g/mL链霉素， 375CO2培养箱中培养3d， 收集细胞， PBS洗涤3 次， 加入0.5mL PBS悬浮细胞， 200目尼龙网过滤， 流式细胞仪计数20000个细胞， 检测细胞中 CFSE荧光信号强弱， 判定PBMC增殖能力。 0048 多肽PD-15阻断后对PBMC增殖影响 0049 体外检测PBMC的增殖变化， 以期证实多肽PD-15结合PBMC后能否阻断PD-1/PD-L1 通路。 本研究用感染PCV2断奶仔猪的PBMC， 与多肽PD-15作用后， 培养3d， 检

18、测CFSE标记的 PBMC增殖变化， 流式结合显示PD-15阻断PD-1/PD-L1通路后， PBMC的增殖显著提高， 出现大 量增殖细胞， 而空白对照组的PBMC几乎未增殖(图2)。 说明PD-15不但能够结合PBMC上的PD- L1， 而且还能阻断PD-1/PD-L1通路， 提高免疫细胞免疫效应。 为深入研究PD-15的免疫功能 奠定基础。 说明书 3/5 页 5 CN 104761633 B 5 0050 (1)PBMC来自临床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪， PBMC的分离纯化同上述过程， 用 RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至106个/mL； 0051 (2)分别取106

19、个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL未标记多肽(总体积200 L)， 冰上避 光孵育2h， PBS洗涤3次， 洗去未结合多肽； 0052 (3)加入10 mol/L CFSE， 37孵育10min， 1000r/min室温离心10min， 弃上清， 洗涤 3次， 将多余的SFSE洗去； 0053 (4)将PBMC转至96孔细胞培养板中， 50000个/孔， 每个样品做6个重复， 然后加入 100 L 10RPMI-1640培养基， 10mg/mL conA， 4mmol/L L-谷氨酰胺， 10 L猪血浆(过滤除 菌)100IU/mL青霉素和100 g/mL链霉素， 375CO2培养箱中培养

20、1824h； 0054 (5)流式检测结果， 计数20000个PBMC。 0055 免疫小鼠 0056 (1)准备病毒， 石门株CSFV为本实验室在PK-15细胞上传代获得， 用终浓度为2的 甲醛溶液37灭活24h； 0057 (2)免疫昆明鼠， 50 g灭活CSFV+50 g PD-15多肽/只， 皮下多点注射， 同时设CSFV 和PBS两组对照， 每组试验3只昆明鼠， 一免后14d进行二免， 二免后14d， 检测CSFV抗体的水 平。 0058 多肽PD-15作为佐剂与灭活CSFV共同免疫昆明鼠， CSFV和PBS分别为无多肽对照和 阴性对照， 二免后14d用ELISA检测CSFV抗体水平

21、。 结果显示， 多肽PD-15和CSFV抗原组的抗 体效价达1:3200以上， 无多肽的CSFV组的抗体效价为1:4001:1600(见表1和图4)， 说明多 肽PD-15能够刺激B细胞活化， 提高B细胞产生抗体的能力， 为PD-15作为免疫佐剂提高体液 免疫反应奠定基础。 0059 表1 CSFV抗体效价 0060 0061 ELISA检测抗体水平 0062 用本实验室已建立检测CSFV的ELISA方法， 具有步骤如下： 0063 (1)包被包被液稀释灭活CSFV至10 g/mL， 50 L/孔， 4过夜， PBST洗3次； 0064 (2)封闭5脱脂奶粉封闭， 200 L/孔， 37封闭4

22、h， PBST洗3次； 说明书 4/5 页 6 CN 104761633 B 6 0065 (3)加一抗免疫鼠血清依次1:50， 1:100， 1:200， 1:400， 1:800， 1:1600， 1:3200， 1: 6400， 1:12800， 1:25600， 1:51200， 1:102400倍稀释， 50 L/孔， 37孵育1h， PBST洗3次； 0066 (4)加二抗HRP标记羊抗鼠IgG 1:5000倍稀释， 稀释液为5脱脂奶粉， 50 L/孔， 37 孵育1h， PBST洗3次； 0067 (5)显色底物缓冲液A和B液混合后， 50 L/孔， 显色5min左右， 加入2m

23、ol/L的H2SO4终 止液50 L/孔。 0068 (6)结果判定， 酶标仪读取各孔OD450nm吸光值， 以P/N2.1判为阳性。 0069 测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列 0070 HPLC检测多肽PD-15的纯度， HPLC结果显示在洗脱时间约为11min左右呈现单一狭 窄峰， 表明多肽纯度高(图3a)， 质谱分析结果表明氨基酸数量和顺序正确， 分子量为 4012.42Da(图3b)。 0071 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精

24、神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。 说明书 5/5 页 7 CN 104761633 B 7 0001 序列表 0002 新乡学院 0003 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用 0004 2015101320904 0005 2015-03-25 0006 1 0007 SIPOSequenceListing 1.0 0008 1 0009 32 0010 RNA 0011 猪(sus scrofa) 0012 1 0013 Cys Thr Arg Arg Asn A

25、sp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Ala Ile 0014 Tyr Leu Pro Pro Lys Thr Gln Ile Asn Glu Ser His Gln Ala Lys 0015 Leu Thr 序列表 1/1 页 8 CN 104761633 B 8 图1a 说明书附图 1/7 页 9 CN 104761633 B 9 图1b 说明书附图 2/7 页 10 CN 104761633 B 10 图1c 说明书附图 3/7 页 11 CN 104761633 B 11 图1d 图2a 说明书附图 4/7 页 12 CN 104761633 B 12 图2b 图3a 说明书附图 5/7 页 13 CN 104761633 B 13 图3b 图4 说明书附图 6/7 页 14 CN 104761633 B 14 图5a 图5b 说明书附图 7/7 页 15 CN 104761633 B 15