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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410293597.3 (22)申请日 2014.06.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104277102 A (43)申请公布日 2015.01.14 (73)专利权人 李光辉 地址 中国台湾台北市北投区林泉里5邻中 山路47号五楼之一 (72)发明人 孙世龙李光辉尉军 (74)专利代理机构 长春众益专利商标事务所 (普通合伙) 22211 代理人 赵正 (51)Int.Cl. C07K 14/47(2006.01) G01N 33/68(2006.。
2、01) G01N 33/574(2006.01) (56)对比文件 WO 2012092529 A2,2012.07.05, WO 2009126966 A2,2009.10.15, TW 201348704 A,2013.12.01, CN 102791290 A,2012.11.21, CN 1378552 A,2002.11.06, CN 1915433 A,2007.02.21, CN 102164964 A,2011.08.24, 张敏等.膜联蛋白A1 的表达差异同乳腺癌 发生发展相关性的初步研究. 实用癌症杂质 .2005,第20卷(第6期), 审查员 陈雪梅 (54)发明名称 一。
3、种检测乳腺癌标志物Annexin A1抗原表 位氨基酸序列及应用 (57)摘要 一种检测乳腺癌标志物AnnexinA1抗原表 位的氨基酸序列及应用， 属于免疫学技术领域， 本发明提供了一种乳腺癌相关基因AnnexinA1 的抗原氨基酸序列。 应用AnnexinA1多肽抗原检 测乳腺癌患者血中相应的特异性自身抗体， 这种 自身抗体可作为乳腺癌标志物评估乳腺癌发生 的危险度。 这种抗原多肽及其抗体可用于制备乳 腺癌早期诊断试剂和开发治疗乳腺癌的靶向药 物。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 104277102 B 2017.04.12 CN 104277102 B 1.一种检。
4、测乳腺癌标志物AnnexinA1抗原表位多肽， 其特征在于： 氨基酸序列为 H-DITSDTSGDFRNALLSEATIIDILTKRNNAQDC-OH 其纯度95%， pH7.0。 2.根据权利要求1所述的检测乳腺癌标志物AnnexinA1抗原表位多肽在制备乳腺癌早 期诊断试剂盒中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104277102 B 2 一种检测乳腺癌标志物AnnexinA1抗原表位氨基酸序列及 应用 技术领域 0001 本发明属于免疫学技术领域， 是一种用于制备肿瘤早期诊断试剂和开发治疗肿瘤 的靶向药物。 背景技术 0002 大量研究表明， 血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机。
5、体产生自身抗体， 在肿瘤 患者血清中既存在肿瘤抗原， 也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。 因此， 既可以利用抗体检 测肿瘤抗原， 也可以利用抗原检测肿瘤抗原的自身抗体， 但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的 特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。 很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者 体内存在， 在正常人体内也存在， 因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。 而肿瘤自 身抗体在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在， 若体内肿瘤自身抗体水平明显增 高， 则表明体内存在异常免疫情况， 表明体内相关抗原水平发生波动， 预示疾病的存在或原 有疾病加重。 0003 近年来的研究表明， 在恶性肿瘤体积发展到。
6、可用现代影像学技术检出之前3-5年， 患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。 因此， 检测血中肿瘤相关抗原自身抗体 具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。 是肿瘤临床诊断领域的重点发展方向 之一。 在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。 然而， 目前所报道的自身抗体 检测方法敏感度低， 特异性差， 假阴性比率可高达50以上。 其主要原因是由于每一种肿瘤 相关抗原自身抗体在癌症患者中的阳性检测率平均在10左右。 如何提高诊断试剂敏感度 是当前需要亟待解决的关键问题。 比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的自 身抗体， 然后与现有已知的肿瘤相关抗原自身抗体组合成具有。
7、敏感度高和特异性强的诊断 试剂盒。 0004 乳腺癌相关基因AnnexinA1定位于人染色体9q12q21.2， 由13个外显子和12个 内含子组成， AnnexinA1的N端212位氨基酸可以和S100C蛋白相互作用。 与其他膜联蛋白 (ANX)最主要的结构区别在于其第重复序列与N-端的疏水结构域没有结合钙离子的时 候， 该螺旋结构由N-端前12残基构成并代替D-螺旋包埋入第重复序列的核心位点中， 而 D-螺旋则悬挂于N-端螺旋外。 研究表明， AnnexinA1参与细胞的生理调节过程， 包括炎症反 应、 细胞增殖分化凋亡、 吞噬分泌过程以及细胞死亡信号的调节， 并发挥巨大作用， 并且与 肿。
8、瘤的发生发展密切相关。 体外实验表明， AnnexinA1C端结构域通过疏水作用与cPLA2的 特异位点结合， 从而干扰cPLA2与质膜结合， 抑制cPLA2的活性进而阻遏c-fos等原癌基因的 表达。 学者们用组织微阵列分析了乳腺正常组织、 乳腺癌组织及转移淋巴结组织中 AnnexinA1的表达情况， 结果发现： AnnexinA1在乳腺正常组织中表达强阳性， 乳腺癌组织 中表达下调， 而在腋窝淋巴结中表达增强， 显示AnnexinA1的表达随乳腺癌的发生发展而 变化。 最近研究显示： AnnexinA1在乳腺癌高转移、 激素敏感细胞系中高表达， 干扰此细胞 中AnnexinA1的表达后导致。
9、细胞迁移和侵袭能力下降。 在细胞水平证明了AnnexinA1可促 说明书 1/5 页 3 CN 104277102 B 3 进乳腺癌的侵袭转移。 AnnexinA1在乳腺肿癌中表达的特异性， 提示我们其在乳腺癌早期 诊断的应用价值较好， 以及作为潜在生物标志物的可能。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是公开一种检测乳腺癌标志物AnnexinA1自身抗体的 抗原表位序列。 0006 本发明同时公开了AnnexinA1抗原表位的用途。 0007 本发明提供的一种检测乳腺癌标志物AnnexinA1自身抗体的抗原表位氨基酸序 列为： 0008 H-DITSDTSGDFRNALLSEATIID。
10、ILTKRNNAQDC-OH 0009 其纯度95， pH7.0。 0010 本发明所述的AnnexinA1抗原表位多肽在制备乳腺癌早期诊断试剂盒中的应用。 0011 本发明利用自行设计的AnnexinA1蛋白的线性多肽， 采用ELISA法检测乳腺癌患 者血清及血浆中AnnexinA1蛋白的特异性自身IgG抗体。 自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患 者体内AnnexinA1蛋白的表达量增加， 预示患者可能出现原发性或继发性乳腺癌， 可以预 测乳腺癌发生与复发的危险性， 指导临床医生对乳腺癌的早期诊断。 0012 Tab.1AnnexinA1抗原表位多肽序列表 0013 0014 抗原抗体的结合实。
11、际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间， 两者在 空间结构和空间构型上完全互补。 因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态 与亲和特性。 另外， 以重组蛋白为抗原， 要经过载体构建、 转染、 表达、 筛选、 纯化等繁琐的过 程， 蛋白空间结构复杂， 抗原表位不易暴露， 因此抗原抗体结合的特异性差。 此外， ELISA法 的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高， 成本昂贵。 0015 发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原： 选择细胞膜蛋白表面区域； 选择不 形成a-helix的序列； 两端的肽段比中间的排列合理； 避免蛋白内部重复； 避免同源 性强的肽段； 序列中尽量避免Cys和Gl。
12、u， 不可以有太多的Pro， 但有1-2个Pro利于肽链结 构稳定， 对产生特异性抗体有益。 此外， 该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原(HLA)系 统的限制性表位， 包括HLA-DR,HLA-DPandHLA-DQ的限制性表位。 这些表位可被90以上 华人群体的HLA二类抗原系统所识别。 基于以上抗原设计原则及AnnexinA1蛋白的生物学 特性， 本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件， 分析与抗原性相关的参数， 设计了 的线性氨基酸序列。 AnnexinA1线性多肽抗原由33个氨基酸残基组成， 共含11个重叠表位， 可检测至少11种单克隆抗体， 具有高度的特异性。 0016 ELI。
13、SA法检测抗原表位 0017 我们采用ELISA方法， 对收集的血液进行检测， 并得到各样本OD值进行分析。 0018 质控 0019 各样本设双复孔， 取平均OD值。 OD值离散度判定： 离散度OD1-OD2/OD1+OD2， 离散 度0.1， 为有效结果； 离散度0.1,为无效结果。 取100份健康人血清等体积混合作为质控 血(Qualitycontrol,QC)， 代表人群的普遍情况， 每板均设2个QC血浆孔， 以QC血浆孔的OD 说明书 2/5 页 4 CN 104277102 B 4 值变异水平判定结果的稳定性， 批间变异CV所有批次QC孔SD/所有批次QC孔OD均值 20。 批内变。
14、异CV每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值0.5的情况下， 曲线下面积越接近于1， 说明诊断准确度越好。 ROC曲线 将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起， 可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关 系， 是试验准确性的综合代表。 该发明采用Analyse-itforMicrosoftExcel软件绘制ROC 曲线， 计算曲线下面积(AU)， 判定灵敏度和特异度。 0023 本发明应用AnnexinA1抗原表位多肽检测到乳腺癌患者血清及血浆中的Annexin A1特异性自身IgG抗体， 并且该反应具有高特异性和高灵敏性。 0024 AnnexinA1抗原表位多肽可用于制备乳腺癌早期诊断试剂盒。。
15、 附图说明 0025 附图为乳腺癌患者体抗AnnexinA1自身IgG抗体水平的ROC曲线分析图。 0026 其中， 横坐标为1-特异度， 纵坐标为敏感度。 具体实施方式 0027 下面结合具体实施例子， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例子仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。 0028 实施例1 0029 试剂盒制备 0030 1试剂试剂配制见Tab.27。 0031 0032 说明书 3/5 页 5 CN 104277102 B 5 0033 0034 0035 0036 0037 0038 2操作 0039 (1)包被： 酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍， 工作抗原用包被液稀释。
16、至工作浓度， 包 被于酶标板， 4过夜。 0040 (2)加谷氨酸： 洗涤缓冲液清洗3遍， 用包被液稀释谷氨酸至浓度100 g/ml， 每孔 200 l,37或室温孵育1h； 0041 (3)加血浆和质控对照(一抗):酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍， 利用包被液将血 浆稀释至合适浓度， 一般为1:1001:500， 每孔100 l,37或室温孵育1h； 0042 (4)二抗孵育： 洗涤缓冲液清洗3遍， 利用包被液稀释二抗标准液IgG， 工作浓度1: 20000， 每孔加100 l， 37或室温孵育1h； 说明书 4/5 页 6 CN 104277102 B 6 0043 (5)显色： 洗涤缓冲液。
17、清洗3遍， 每孔加100 l底物显色液， 室温避光3045min。 0044 (6)检测： 每孔加50 l终止液， 10min内检测， 检测波长为450nm， 参考波长为630nm。 0045 实施例2 0046 乳腺癌患者的AnnexinA1自身IgG抗体检测 0047 1样本收集： 本研究从吉林大学第二医院、 省肿瘤医院选取经放射学检查和组织学 检查确诊乳腺癌样本311例。 所有血清样本采集前未经过任何抗癌治疗， 并具有全面的临床 资料和信息。 同时招募了健康对照组样本303例。 临床访谈及影像学检查均排除乳腺癌患病 可能。 健康组与乳腺癌组在性别、 年龄匹配， 具有可比性(P0.05) 0048 2检测结果： AnnexinA1的自身抗体表达水平(Tab.8)： 乳腺癌组与健康对照组相 比存在统计学差异(t-7.163， P95%， pH7.0。 序列表 1/1 页 8 CN 104277102 B 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 104277102 B 9 。