技术领域
本实用新型涉及细胞体外培养领域，尤其涉及一种细胞体外培养装置。
背景技术
细胞或组织的增殖、分化及生理功能的实现，与其所处的环境密切相关， 这些环境因素可以是营养物质、压力、温度、pH等中的一种或多种。人体内有 很多组织和细胞生存于动态载荷环境下，如软骨细胞和肺细胞等，这些组织和 细胞只有在适当压力条件下培养，才能正常增殖、分化，产生与体内相同的生 理功能。现有体外研究表明：未在适当压力条件下体外培养的关节软骨细胞， 细胞排列不规则，基质产生少，且胶原纤维较细；同时动物研究发现，关节制 动会使关节软骨发生变性，特别对蛋白多糖的合成有影响。相反，一定的机械 应力刺激是维持软骨细胞正常新陈代谢机能所必需的生长环境。
加压培养技术是细胞培养的方法之一，通过不同手段对培养的组织或细胞 施加一定的压力载荷，以模拟其承受生理载荷的环境。常见的加压培养技术有 液压培养技术、离心管培养技术和直接接触压缩培养技术等。液压培养技术是 将软骨细胞或软骨块置于培养皿中，其中加满完全培养液，去除培养皿上盖换 成压力膜，排出皿内空气后用粘胶使压力膜与皿贴紧，确保皿内无残留气泡， 然后将培养皿置于压力室中，压力室内充满蒸馏水，压力和频率由计算机控制 下的压力阀来调控。离心管培养技术则是将细胞及培养基置于离心管内，通过 离心力产生加压，通过调控离心速度的快慢，来调节细胞承受重力大小，加压 强度不能灵活调整，离心过程中细胞的培养条件可能不稳定。直接接触压缩培 养技术中较有代表性的是flexcell公司的细胞力学培养产品，该系统基本原理 (正气压交换模式)：利用橡胶密封垫在细胞培养板基底膜与基座之间形成封 闭腔，把此密封腔的进、出气管插入二氧化碳培养箱里，把此密封腔放入二氧 化碳培养箱，利用封闭腔正气压挤压培养孔里的活塞，进而使活塞和固定台之 间的三维培养物间接受到压力发生形变，通过计算机控制系统调节气体的压力 来改变基底膜的形变量。目前几种加压培养方法中，利用液压或气压加载方式， 组织处于相对密闭的培养环境中，难以实现对细胞组织培养液的动态更新，需 在实验载荷间隙更换培养液。
软骨是人或脊椎动物体内的一种结缔组织。骨关节炎可引起关节软骨的破 坏，其他原因也可导致软骨缺损，软骨破坏或缺损后，其自身很难再生修复， 常用异体软骨移植、假体替代和自身软骨细胞移植等进行治疗，但这些治疗方 法的效果不甚理想。科学家们正在研究通过组织工程学对破坏或缺损的软骨进 行再生修复。组织工程学是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法， 再造或者修复器官及组织的技术。组织工程化软骨现已逐渐被认为是一种有希 望治疗全层软骨缺损的手段。软骨的组织工程是将关节软骨酶解后，游离出原 代软骨细胞，或直接利用可向软骨细胞分化的干细胞，种植于可降解吸收的聚 合物上，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等或天然载体如胶原纤维，经离体三 维培养一段时间后再移植到动物体内，继续生成新的软骨。三维培养环境有利 于软骨细胞的增殖、分化、表型稳定和基质蛋白合成。
人体内部分组织或细胞在不同部位需要不同的营养物质，这些营养物质对 于细胞的增殖、分化、表型稳定和基质蛋白合成等也是非常重要的。以最具有 代表性的软骨组织为例来进行说明。软骨是人或脊椎动物体内的一种结缔组织。 关节软骨组织呈分层结构，靠近关节腔的部分为关节软骨表层，靠近软骨下骨 的部分为关节软骨深层，又称为关节软骨钙化层。关节软骨无血管、无淋巴管、 无神经，其营养来源有：①软骨下骨组织的血管穿入钙化层，供应该层的营养； ②软骨周围的滑膜血管与滑液进行营养交换；③滑膜分泌的滑液藉渗透作用进 入软骨，为关节软骨表层提供营养。因此，关节软骨表层与关节软骨深层分别 由不同营养来源的不同营养物质提供营养。培养基在软骨细胞三维培养中对细 胞分化起着关键性作用。但现有研究尚未对培养基的研究给予足够的重视。现 有的软骨组织或细胞培养中，未对软骨组织进行结构区分，仅使用一种培养基 提供营养。目前尚未有使用两种培养基对软骨组织进行培养的报道，更未有可 以同时使用两种培养基对软骨细胞进行三维立体体外培养的装置。
当在细胞外培养基质中对软骨细胞等细胞或组织进行三维立体体外培养时， 模拟其所处的力学和/或营养环境即显得尤为重要。建立一套能够模拟体内生理 环境的体外培养装置及方法，是进行软骨细胞等细胞或组织相关基础研究的重 要手段。
实用新型内容
有鉴于此，有必要针对现有细胞培养中不能实现两种不同培养液的分层动 态灌注培养的问题，提供一种细胞体外培养装置。
为了实现上述实用新型目的，本实用新型采用如下技术方案：
细胞体外培养装置，包括生物反应器和双培养液灌溉系统；
所述生物反应器包含盖板、中板、底板和双重培养杯，所述盖板对合放置 在中板上，所述底板对合放置在中板下，所述中板设有中板方孔，所述方孔内 放置双重培养杯，所述双重培养杯包括方杯以及位于方杯之内的圆杯；所述圆 杯包含圆杯壁和圆杯多孔底片，所述圆杯设有圆杯抽吸管和圆杯输液管，所述 方杯设有方杯抽吸管和方杯输液管；所述圆杯和方杯之间设有支撑结构；
所述双培养液灌溉系统包括两个培养液盛放装置、两个废液回收装置、两 个培养液输送管、两个废液回收管和一个多通道蠕动泵，两个培养液盛放装置 分别通过一个培养液输送管与圆杯输液管或方杯输液管相连，所述圆杯抽吸管 和方杯抽吸管各通过一个废液回收管与一个废液回收装置相连；所述多通道蠕 动泵为培养液的输送和废液的抽吸提供动力。
优选的，所述细胞体外培养装置还包括加载装置，所述加载装置包括马达、 加压板、加压柱和多孔加压片；所述加压板位于盖板之上，所述盖板上对应中 板方孔的位置设有盖板方孔，所述加压柱的上端与加压板螺纹连接，加压柱穿 过盖板方孔，加压柱的下端与多孔加压片螺纹连接；所述马达与加压板连接。
优选的，所述细胞体外培养装置还包括监测系统，所述监测系统包括压力 感应片、电子显微镜和电脑；所述压力感应片位于所述底板上，且与双重培养 杯对应设置，所述压力感应片通过数据线与电脑连接；所述电子显微镜位于盖 板和中板之间，通过数据线与电脑连接；所述电脑还通过数据线与多功能蠕动 泵和马达连接。
优选的，所述盖板的底面设有盖板管槽和盖板电子显微镜安装槽，所述中 板的正面设有中板管槽和中板电子显微镜安装槽。
优选的，所述方杯和圆杯分别设有管道固定结构。
更优选的，所述双重培养杯分为压力承载杯和非压力承载杯；所述压力承 载杯的方杯含有3个管道固定结构，圆杯有1个管道固定结构，圆杯抽吸管穿 过加压柱；所述非压力承载杯的圆杯含有2个含有管道固定结构，所述方杯含 有4个管道固定结构。
优选的，细胞体外培养装置含有12个双重培养杯，分为3排，每排4个， 中间1排为非压力承载杯，其余2排为压力承载杯。
优选的，所述支撑结构为设于圆杯底部的支撑脚。
优选的，所述细胞体外培养装置适用于人体内生存于压力条件下的各种组 织和细胞的体外培养，例如：胃上皮细胞、肠上皮细胞、软骨组织、椎间盘骨 组织、肌腱组织、韧带组织以及从肌肉、肺、心脏、血管、皮肤、肌腱、韧带、 软骨和骨中分离出来的细胞。
本实用新型细胞培养装置的有益效果具体如下：
(1)本实用新型细胞培养装置采用生物反应器和双培养液灌溉系统，仿生 模拟生理状态，建立双培养液灌溉系统，对不同层次的组织块供应不同的养分； 每个双重培养杯均配备2套管路系统，利用培养组织本身作为两种培养液的分 隔层，可同时利用2种培养液进行培养，培养液自动灌溉，可定时，定量更换 细胞培养液，调控培养液的灌注速度，能恒定提供细胞所需各种养分和稳定的 pH值。
(2)本实用新型细胞培养装置采用动态加压环境，通过施加可控的轴向压 缩形变载荷，对培养组织施加压力，并可实时监测分析各个培养组织所受压力 大小及压缩形变大小，并对压力进行调整。
(3)本实用新型细胞培养装置采用三维培养，取代传统的平面培养，从而 能够有利于维持细胞形态，本实用新型细胞培养装置及培养方法适用于大多数 三维培养基质材料和支架材料。
(4)本实用新型细胞培养装置适用于人体内生存于压力条件下或/和不同部 位对营养物质有不同要求的各种组织和细胞的体外培养，尤其适用于胃上皮细 胞、肠上皮细胞、软骨组织、椎间盘骨组织、肌腱组织、韧带组织以及从肌肉、 肺、心脏、血管、皮肤、肌腱、韧带、软骨和骨中分离出来的细胞的体外培养。
附图说明
图1是本实用新型细胞体外培养装置的整体结构示意图。
图2是生物反应器结构示意图。
图3是双重培养杯结构示意图。
图4是压力承载杯结构示意图。
图5是非压力承载杯结构示意图。
图6为盖板结构示意图。
图7为中板结构示意图。
图8是底板结构示意图。
图中各附图标记为：
生物反应器1，盖板11，中板12，底板13，双重培养杯14，盖板方孔111， 盖板管槽112，盖板电子显微镜安装槽113，中板方孔121，中板管槽122，中 板电子显微镜安装槽123，方杯141，圆杯142，圆杯抽吸管144，圆杯输液管 145，方杯抽吸管146，方杯输液管147，支撑结构148，管道固定结构149，培 养液盛放装置21，废液回收装置22，培养液输送管23，废液回收管24，多通 道蠕动泵25，马达31，加压板32，加压柱33，多孔加压片34，压力感应片41， 电脑42，压力感受数据线分通道43，压力感受数据线总通道44。
具体实施方式
为了更好地说明本实用新型，下面结合附图和实施例做进一步说明。
实施例1
如图1所示，一种细胞体外培养装置，包括生物反应器1、双培养液灌溉系 统、加载装置和监测系统。
如2所示，所述生物反应器1包含盖板11、中板12、底板13和双重培养 杯14，所述盖板11对合放置在中板12上，所述底板13对合放置在中板12下， 所述中板12设有中板方孔121，所述中板方孔121内放置双重培养杯14。
如图3-5所示，所述双重培养杯14包括方杯141以及位于方杯141之内的 圆杯142。所述圆杯142由圆杯壁和可拆卸的圆杯多孔底片组成，所述圆杯多孔 底片可以使培养液通过。所述圆杯142设有圆杯抽吸管144和圆杯输液管145， 所述方杯141设有方杯抽吸管146和方杯输液管147。圆杯输液管145和方杯输 液管147用于将培养液盛放装置21中的培养液经培养液输送管23输入圆杯142 或方杯141中，所述圆杯抽吸管144和方杯抽吸管146用于将圆杯142或方杯 141中的培养液经废液回收管24输出至废液回收装置22。所述圆杯142和方杯 141之间设有支撑结构148，以使圆杯142杯底与方杯141杯底之间留有一定的 空隙，便于存放方杯141内的培养液；所述支撑结构148优选设置在圆杯142 杯底的支撑脚，所述支撑脚有3个或4个。在圆杯142和方杯141中可使用不 同的培养液，能够满足细胞不同部位的营养需求。圆杯142和方杯141中的培 养液可以完全不同，也可以仅有某一组分的含量不同或梯度变化。
如图1所示，所述双培养液灌溉系统包括两个培养液盛放装置21、两个废 液回收装置22、两个培养液输送管23、两个废液回收管24和一个多通道蠕动 泵25，两个培养液盛放装置21分别通过一个培养液输送管23与圆杯输液管145 或方杯输液管147相连，所述圆杯抽吸管144和方杯抽吸管146各通过一个废 液回收管24与一个废液回收装置22相连；所述多通道蠕动泵25为培养液的输 送和废液的抽吸提供动力。优选的，所述培养液输送管23和废液回收管24为 医用硅胶管。
优选的，如图6和图7所示，所述中板12正面设有中板管槽122，用于固 定培养液输送管23和废液回收管24；所述盖板11底面设有盖板管槽112，用 于与中板管槽122配合固定培养液输送管23和废液回收管24。所述盖板11上 设有与中板方孔121对应的盖板方孔111。当使用压力承载杯时，所述加压柱 33由盖板方孔111穿过盖板。所述中板12正面还设有中板电子显微镜安装槽 123，盖板11底面还设有盖板电子显微镜安装槽113，二者组成圆管状的电子显 微镜安装槽，用来安装电子显微镜。
优选的，如图2所示，所述细胞体外培养装置还包含加载装置，所述加载 装置包括马达31、加压板32、加压柱33和多孔加压片34；所述加压板32位于 盖板11之上，所述加压柱33的上端与加压板32螺纹连接，加压柱33的下端 与多孔加压片34螺纹连接。当马达31对加压板32施加压力时，加压板3向下 移动，同时带动与其连接的加压柱33向下移动，与加压柱33连接的多孔加压 片34亦向下移动，对培养的组织或细胞施加压力。反之亦然。
优选的，所述加压柱33的下部及多孔加压片34位于所述圆杯142内，所 述多孔加压片34与多孔底片之间的距离为1-4mm，优选2mm。所述马达31与 加压板32连接，用以驱动加压板32的位移。所述马达31为可编程的线性进步 马达。
优选的，所述双重培养杯14分为压力承载杯和非压力承载杯。更优选的， 所述中板方孔121有12个，分为3排，每排4个，每个方孔内放置一个双重培 养杯。更进一步优选的，中间一排中板方孔121放置非压力承载杯，两侧两排 中板方孔121放置压力承载杯。
优选的，所述方杯141和圆杯142分别设有管道固定结构149，用于固定输 液管和抽吸管。在本实施例中，所述管道固定结构149为圆杯142或方杯141 杯沿处下凹的凹口。所述压力承载杯的圆杯142只有1个管道固定结构149，用 于固定圆杯输液管145，圆杯抽吸管144则穿过中空的加压柱33后与其培养液 输送管23连接；方杯141含有3个管道固定结构149，其中2个管道固定结构 149分别用于固定方杯输液管147和方杯抽吸管146，另1个管道固定结构149 与圆杯的管道固定结构149对应，用于固定圆杯输液管145。所述非压力承载杯 的圆杯含有2个含有管道固定结构149，分别用于固定圆杯输液管145和圆杯抽 吸管144；所述方杯141含有4个管道固定结构149，其中2个管道固定结构149 分别用于固定方杯输液管147和方杯抽吸管146，另2个管道固定结构149与圆 杯的2个管道固定结构149对应，分别用于固定圆杯输液管145和圆杯抽吸管 144。
所述监测系统4包括压力感应片41、电子显微镜(图中未视出)和电脑42； 所述压力感应片41位于所述底板13上表面，且与多孔加压片34、压力承载杯 对应设置，所述压力感应片41通过数据线与电脑42连接；所述电子显微镜位 于盖板11和中板12之间，通过数据线与电脑42连接用于监测加压柱33的微 位移，进而监测加压板32的微位移，实时显示加压板32的位移情况。所述电 脑42还通过数据线与多功能蠕动泵25和马达31连接。
如图8所示，所述底板13对应压力承载杯的位置设有压力感应片41，所述 压力感应片41通过压力感受数据线与电脑相连。底板13设有压力感受数据线 分通道43和压力感受数据线总通道44，所述压力感受数据线分通道43用于固 定直接由压力感应片41引出的压力感受数据线，压力感受数据线总通道44用 于固定汇总后的压力感受数据线并引出底板13。在本实施例中，因为两侧中板 方孔121中为压力承载杯，中间中板方孔121中为非压力承载杯，所以，底板 13中部开设的通道为压力感受数据线总通道44，连通压力感应片41和压力感 受数据线总通道44的通道为压力感受数据线分通道43。
实施例2
为了更好的理解本实用新型，下面仅以软骨细胞为例说明使用实施例1中 所述的细胞体外培养装置培养细胞的方法，包括以下步骤：
S1、预制含有软骨细胞的液态凝胶；在本实施例中对软骨细胞采用三维培 养，可以使用现有技术中的任何三维培养载体；
S2、将生物反应器和加载装置装配后置于超净台上，将电脑连接马达，控 制马达调节加压板位置使多孔加压片与圆杯多孔底片之间有1-4mm的间隙，然 后将步骤S1预制的液态凝胶注入该间隙中，使液态凝胶与多孔加压片和圆杯多 孔底片的表面充分接触，置于室温待液态凝胶充分凝固；
S3、在圆杯和方杯中分别加适量的第一种培养液或第二种培养液，方杯内 的培养液可经圆杯多孔底片渗透滋养圆杯内培养组织的底层，圆杯内的培养液 直接滋养培养组织的顶层；再将生物反应器转移至细胞培养箱，连接双培养液 灌溉系统以及监控系统；根据实验设计，按照程序启动驱动马达和培养液蠕动 泵，对培养组织施加设定的压力载荷，并维持稳定的培养液环境，实时监测加 压板的加压位移情况，以及组织的受力大小变化。
优选的，所述软骨细胞体外培养方法还包括对软骨细胞施加动态压力载荷， 所述动态压力载荷为10％压应变载荷，频率1Hz，每间隔1小时给予动态加压1 小时。
本实用新型细胞体外培养装置改进了软骨细胞体外培养环境，利于维持软 骨细胞表型，促进软骨细胞外基质产生及重塑，建立更加先进的组织工程软骨 的体外培养方法。本实用新型细胞培养装置及培养方法采用生物反应器和双培 养液灌溉系统，仿生模拟软骨组织在生理状态下，关节软骨表面无血清环境、 软骨底层同层次的养分特点，建立双培养液灌溉系统，对不同层次的组织块供 应不同的养分；每个双重培养杯均配备2套管路系统，利用培养组织本身作为 两种培养液的分隔层，可同时利用2种培养液进行培养，培养液自动灌溉，可 定时，定量更换细胞培养液，调控培养液的灌注速度，能恒定提供细胞所需各 种养分和稳定的pH值。
以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和 详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以 做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型 专利的保护范围应以所附权利要求为准。