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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410512199.6 (22)申请日 2014.09.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104327164 A (43)申请公布日 2015.02.04 (73)专利权人 广西中医药大学 地址 530213 广西壮族自治区南宁市青秀 区五合大道13号 (72)发明人 李培源苏炜霍丽妮陈睿 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 靳浩 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01) A61K 。
2、6/02(2006.01) 审查员 李翠莹 (54)发明名称 一种合成多肽及其用途 (57)摘要 本发明公开了一种合成多肽， 所述合成多肽 包含： (a)合成多肽氨基酸序列： SEQIDNo.1所 示的氨基酸序列； (b)在(a)限定的合成多肽中经 过缺失、 插入或置换一个或几个氨基酸且与(a) 所述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的多 肽； 所述合成多肽分子量为1691.05g/mol， 等电 点为9.7； 其可应用于制备抗菌和促进成骨细胞 生长的材料中。 本发明是一种合成多肽， 具有抗 菌能力， 也可促进成骨细胞的生长， 稳定性强， 易 于与其它化合物结合， 可以简单应用于各种形式 的。
3、材料， 本发明无毒， 具有一定的应用潜力。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 104327164 B 2017.06.13 CN 104327164 B 1.一种合成多肽， 其特征在于， 所述合成多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所 示。 2.根据权利要求1所述的合成多肽， 其特征在于， 所述合成多肽分子量为1691.05g/ mol。 3.根据权利要求1所述的合成多肽， 其特征在于， 所述合成多肽等电点为9.7。 4.权利要求1所述的合成多肽， 其特征在于， 其在制备抗菌和促进成骨细胞生长的材料 中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 10432716。
4、4 B 2 一种合成多肽及其用途 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 特别涉及一种合成多肽及其用途。 背景技术 0002 通过外科手术将种植体植入人体缺牙部位， 在其上部安装修复假牙的种植称为牙 种植， 种植体的与人体的生物相容性及骨整合之间关系重大， 它可为病原微生物提供栖息 场所， 一旦发生感染， 都会导致种植失败。 牙种植体按其材料不同， 分为金属与合金材料类， 陶瓷材料类， 碳素材料类， 高分子材料类， 复合材料类。 0003 骨基质中具有特定功能的蛋白质、 酶、 多肽等可促进骨潜能细胞及成骨细胞的增 殖、 分化， 可通过将其固定在种植体表面， 改良种植体表面的结构和成分促进。
5、早期骨整合。 将具有特定功能的蛋白质、 酶、 多肽等生物活性物质固定于种植体表面， 可促进骨潜能细胞 及成骨细胞的增殖、 分化， 达到良好的成骨作用， 因此， 寻找一种化合物用于提高种植体性 能和预防种植体相关感染是很有必要的。 发明内容 0004 本发明目的之一在于提供一种具有抗菌和促进成骨细胞生长的合成多肽； 本发明 目的之二在于提供该合成多肽在制备抗菌和促进成骨细胞生长的材料中的应用。 0005 本发明提供的技术方案为： 0006 一种合成多肽， 所述合成多肽包含： 0007 (a)合成多肽氨基酸序列： SEQ ID No.1所示的氨基酸序列； 0008 (b)在(a)限定的合成多肽中经。
6、过缺失、 插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)所 述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的多肽。 0009 优选的是， 所述合成多肽分子量为1691.05g/mol。 0010 优选的是， 所述合成多肽等电点为9.7。 0011 优选的是， 其在制备抗菌和促进成骨细胞生长的材料中的应用。 种植体的钛表面 可用连接子预处理， 并且可将含有-SH基团的氨基酸， 例如半胱氨酸引入本发明合成多肽的 N末端或C末端中， 以结合所述连接子的官能团。 也可用连接子对钛表面预处理后连接多肽 中的-NH2基团， 将多肽连接在钛表面。 举例来说， 结合连接子， 本发明合成多肽在N末端含有 半胱氨酸以便借助于连接子。
7、与半胱氨酸之间的相互作用容易地被引入种植体中。 另外， 为 了将本发明合成多肽稳定地引入种植体的钛(Ti)表面中， 优选利用硅烷-连接子-肽的连接 关系将这些合成多肽引入种植体表面中。 这样处理得到的钛金属可作为牙种植体和骨种植 体使用， 由于其优异的抗菌性能和促进成骨细胞生长功能， 对于避免种植体细菌感染和挽 救病人生命有重大意义。 0012 此外， 本发明的合成多肽也可简单应用于其他日常使用的材料表面， 如塑料、 玻璃 和其他金属表面， 可有效预防日常接触引起的细菌感染。 0013 本发明的有益效是： 说明书 1/5 页 3 CN 104327164 B 3 0014 第一、 本发明合成多。
8、肽无毒， 适用于种植体材料， 通过细胞毒性分析可知本发明合 成多肽乳酸脱氢酶活性略低于没有加入本发明合成多肽的培养基， 乳酸脱氢酶活性越高表 明细胞受损程度越高， 由此可知本发明合成多肽无毒； 0015 第二、 本发明合成多肽具有良好的杀菌效果， 对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、 大 肠埃希氏菌(ATCC 25922)、 白假丝酵母(ATCC 10231)、 枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC 9372) 都具有很强的杀菌性， 其杀菌率达99以上； 0016 第三、 本发明合成多肽具有提高成骨细胞活性， 促进成骨细胞分化的能力； 0017 第四、 本发明合成多肽制作成本相较于其它材料成本更。
9、低， 易于大规模生产； 0018 第五、 本发明提供的合成多肽稳定性强， 结构易于调控， 易于与其它化合物结合， 可以简单应用于各种形式的材料， 具有很明显的应用潜力， 也可简单应用于其他日常使用 的材料表面， 如塑料、 玻璃和其他金属表面， 可有效预防日常接触引起的细菌感染。 0019 本发明所涉及到的术语定义 0020 除非另外定义， 否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。 虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者 类似或等效的任何方法、 装置和材料， 但现在描述优选方法、 装置和材料。 0021 术语 “氨基酸” 意指构成蛋白质的。
10、基本单位， 赋予蛋白质特定的分子结构形态， 使 它的分子具有生化活性。 蛋白质是生物体内重要的活性分子， 包括催化新陈代谢的酶， 两个 或两个以上的氨基酸化学聚合成肽， 一个蛋白质的原始片段， 是蛋白质生成的前体， 氨基酸 广义上是指既含有一个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物， 正如它的名字所说的 那样。 但一般的氨基酸， 则是指构成蛋白质的结构单位。 在生物界中， 构成天然蛋白质的氨 基酸具有其特定的结构特点， 即其氨基直接连接在 -碳原子上， 这种氨基酸被称为 -氨基 酸。 在自然界中共有300多种氨基酸， 其中 -氨基酸21种。 -氨基酸是肽和蛋白质的构件分 子， 也是构成生命大厦。
11、的基本砖石之一。 0022 术语 “多肽” 意指 -氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物， 它也是蛋白质水解 的中间产物。 由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽， 同理类推还有三肽、 四 肽、 五肽等， 通常由10100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽， 它们的分子量低于 10000道尔顿， 能透过半透膜， 不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀， 也有文献把由210个氨基酸 组成的肽称为寡肽(小分子肽)； 1050个氨基酸组成的肽称为多肽； 由50个以上的氨基酸 组成的肽就称为蛋白质。 0023 术语 “缺失” 意指一个正常染色体断裂后丢失了一个片段， 这片段上的基因也随之 失去， 在本发明。
12、中意指合成多肽除了为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列之外， 还包括合成多 肽氨基酸序列中丢失一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列的合成多肽。 0024 术语 “插入” 意指利用基因操作技术把一段DNA接入另一段DNA中或克隆载体中去， 在本发明中意指合成多肽除了为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列之外， 还包括合成多肽氨 基酸序列中插入一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列的合成多肽。 0025 术语 “置换” 意指一种基因重组载体， 一般利用同源重组将基因组中的某段基因替 换， 而达到基因敲除的目的， 在本发明中意指合成多肽除了为SEQ ID No.1所示的氨基酸。
13、序 列之外， 还包括合成多肽氨基酸序列中一个或几个氨基酸被其他种类的氨基酸置换后的不 影响其功能的新的氨基酸序列的合成多肽。 说明书 2/5 页 4 CN 104327164 B 4 0026 术语 “等电点” 意指在某一pH的溶液中， 氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的 趋势或程度相等， 成为兼性离子， 呈电中性， 此时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电 点， 生物两性分子如蛋白质即含有酸性的， 也含有碱性的官能团。 组成蛋白质的氨基酸可能 是带正电荷的、 带负电荷的、 中性的或者本生是两性的， 它们的电荷加在一起是蛋白质的电 荷， pH值小于等电点时蛋白质的总电荷是正的， 大于等电点时。
14、是负的。 附图说明 0027 图1为本发明所述合成多肽对成骨细胞增殖活性的影响与普通培养基对成骨细胞 增殖活性影响的比较结果对照图； 0028 图2为本发明所述合成多肽对初始细胞分化能力与普通培养基对初始细胞分化能 力的比较结果对照图。 具体实施方式 0029 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。 0030 实施例1： 0031 一种合成多肽， 氨基酸序列如SEQ ID No.1所示； 0032 SEQ ID No.1： QKKPVPIIYC NGTCQ。 0033 实施例2： 0034 合成多肽的制备： 0035 选用氨基酸-王树脂作为载。
15、体(树脂)， 用二氯甲烷将树脂充分溶胀， 用二甲基甲酰 胺清洗几遍， 用适当浓度的DBLK， 将Fmoc-保护基团脱出， 之后用二甲基甲酰胺清洗数遍， 洗 去DBLK， 称取适合的缩合剂苯并三氮唑-N， N， N ， N -四甲基脲六氟磷酸盐和活化剂甲基吗 啉以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸(Fmoc-Pro-OH)进行偶联， 通过茚三酮检测法进行检测 确保连接比较完全， 用二甲基甲酰胺清洗几遍， 洗去残留的各种残基， 活化剂和缩合剂， 依 氨基酸序列进行偶联， 将所有的氨基酸连接结束后， 脱去最后的Fmoc-保护基团， 用切割液 裂解， 去除树脂和氨基酸保护基团， 得到合成多肽的粗品， 送。
16、质谱确认产品分子量 1691.05g/mol符合理论值。 0036 实施例3： 0037 抗菌能力实验： 0038 一、 实验方法 0039 在灭菌试管中加入1mL浓度为1106个/mL的菌液， 加入1mg本发明所提供的合成 多肽， 37培养24小时后， 培养基收集起来用倍比稀释， 稀释倍数为10倍和涂布培养法检测 活菌数。 0040 二、 实验结果： 0041 表1 本发明所述合成多肽的杀菌率() 0042 细菌ATCC 6538ATCC 25922ATCC 10231ATCC 9372 杀菌率99.9999.9999.9699.98 说明书 3/5 页 5 CN 104327164 B 5。
17、 0043 由表1可知， 本发明所提供的合成多肽， 对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、 大肠埃希 氏菌(ATCC 25922)、 白假丝酵母(ATCC 10231)、 枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC 9372)都具有 很强的杀菌性， 其杀菌率达99以上。 0044 实施例4： 0045 成骨细胞增殖活性实验： 0046 一、 实验方法 0047 将1mg本发明合成多肽置于24孔板中， 1mL密度为2104个/mL的小鼠成骨细胞悬 液接种于24孔板， 然后培养1、 4和7天。 到预定时间点后， 每孔加入200uL浓度为5mg/mL的3- (4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑。
18、溴盐(MTT)和800uL无血清无酚红改良杜氏伊格尔 培养基(DMEM)， 37孵育4小时后吸弃上清液， 加入1ml二甲基亚砜(DMSO)溶解生成的结晶 物， 每孔取三份200uL溶解液转到96孔培养板， 用分光光度计于490nm处测其光密度值(OD 值)。 0048 二、 实验结果 0049 如图1所示， 从图1可以看到小鼠成骨细胞接种于普通培养基和添加有本发明所提 供的合成多肽的培养基中， 其OD值均呈增加的趋势， 随着天数增加， 添加有本发明所提供的 合成多肽的小鼠成骨细胞OD值增加更加显著， OD值可以反映小鼠成骨细胞的活性， 所以从 图1我们可以知道本发明所提供的合成多肽能显著提高小。
19、鼠成骨细胞增殖活性。 0050 实施例5： 0051 初始细胞分化能力分析： 0052 通过比较作为成骨细胞初始分化标记物的本发明所提供的合成多肽的碱性磷酸 酶(ALP)活性， 检查本发明所提供的合成多肽对小鼠成骨细胞分化的影响。 0053 一、 实验方法 0054 将1mL浓度为1104个/mL细胞的小鼠成骨细胞接种到24孔板中， 并培育1天。 随 后， 分别用不含本发明的培养基和含有本发明所提供的合成多肽的分化培养基处理细胞， 并在CO2含量为5的37恒温箱中培育， 在培养后第7天和第14天测量ALP活性。 0055 二、 实验结果 0056 如图2所示， 实验发现， 含有本发明所提供合成。
20、多肽的分化培养基在第7天显示的 ALP活性比不含本发明所提供合成多肽的培养基高93， 这表明在发明所提供合成多肽的 作用下成骨细胞分化能力明显改善。 0057 实施例6： 0058 细胞毒性分析： 0059 以乳酸脱氢酶(LDH)的活性作为细胞毒性指标来评估本发明所提供的合成多肽的 细胞毒性大小。 LDH是一种稳定的蛋白质， 存在于正常细胞的胞质中， 一旦细胞膜受损， LDH 即被释放到细胞外。 通过检测细胞培养上清中LDH的活性， 可判断细胞受损的程度， LDH活性 越高表明细胞受损程度越高。 0060 一、 实验方法 0061 将1mL浓度为1104个/mL细胞的小鼠成骨细胞接种到24孔板。
21、中， 并培育1天。 随 后， 分别用不含本发明合成多肽的培养基和含有本发明合成多肽的分化培养基处理细胞， 并在CO2含量为5的37恒温箱中培育24小时， 离心后取上清液用于LDH活性检测， LDH活 说明书 4/5 页 6 CN 104327164 B 6 性用南京建成生物工程研究所生产的LDH试剂盒检测。 0062 二、 实验结果 0063 表2 本发明合成多肽的LDH活性(U/L) 0064 培养基本发明合成多肽 LDH活性308298 0065 如表2所示， 实验发现， 含有本发明所提供合成多肽的分化培养基的LDH活性略低 于不含本发明所提供的合成多肽的培养基， 表明本发明所提供合成多肽无细胞毒性。 0066 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。 说明书 5/5 页 7 CN 104327164 B 7 0001 序列表 1/1 页 8 CN 104327164 B 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 104327164 B 9 。